一种酶-无机晶体复合微球及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种酶-无机晶体复合微球及其制备方法。本发明提供的酶-无机晶体复合微球的制备方法，包括如下步骤：金属离子和酶均溶解于磷酸盐缓冲液中，即得到所述酶-无机晶体复合微球；所述金属离子为钙离子、镁离子、铁离子、亚铁离子、铜离子、二价镍离子或锌离子中任一种；所述磷酸盐缓冲液中包括磷酸氢二根和磷酸二氢根。本发明提供的酶-无机晶体复合微球的制备方法具有操作简单、成本低廉等优点。本发明提供的酶-无晶体复合微球中酶的稳定性提高，酶的活性基本保持不变甚至有所提高。
【专利说明】—种酶-无机晶体复合微球及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种酶-无机晶体复合微球及其制备方法，属于固定化酶【技术领域】。
【背景技术】
[0002]酶作为一种生物催化剂，因其具有高选择性、反应条件温和等特点，已广泛应用于医药、食品加工及精细化学品合成等领域。而多酶由两种或以上不同的酶联合组成，能够进行连续的催化反应。多酶体系在催化过程中表现出高效率与协调性。然而工业催化使用中的单酶或多酶在实际工业操作条件下表现出稳定性低、耐受性差、不可回收利用等缺陷，很大程度上限制了其工业应用。固定化酶技术为解决上述问题提供了一条途径。
[0003]目前，固定化酶技术已经广泛应用于工业酶催化生产过程，取得了一定效果。但现有的单酶和多酶的固定化方法存在局限性，例如制备方法复杂、固定化酶的活性收率较低以及制备成本较高等，因此探求一种操作简单、固定化酶活收率高、成本低廉的方法十分重要。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种酶-无机晶体复合微球及其制备方法，具体采用沉淀法制备酶-无机晶体复合微球，该方法操作简单、条件温和、成本低廉、酶活性收率高。
[0005]本发明提供的一种酶-无机晶体复合微球的制备方法，包括如下步骤:
[0006]金属离子和酶均溶解于磷酸盐缓冲液中，即得到所述酶-无机晶体复合微球；
[0007]所述金属离子为钙离子、镁离子、铁离子、亚铁离子、铜离子、二价镍离子或锌离子中任一种；
[0008]所述磷酸盐缓冲液中包括磷酸氢根和磷酸二氢根。
[0009]上述制备方法中，所述酶的分子量为5~500kD。
[0010]上述制备方法中，所述酶为南极假丝酵母脂肪酶B (Candida antarctica LipaseB)、葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase)、辣根过氧化物酶(Horse radish peroxidase)、乙醇脱氢酶(Ethanol dehydrogenase)、鹿糖酶(Invertase)、超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase)、过氧化氢酶(Catalase)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutath1n peroxidase) >漆酶(Laccase)、葡萄糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase)、纤维二糖脱氢酶(Cellob1sedehydrogenase)、尿酸酶(Uricase)、南极假丝酵母脂肪酶 A (Candida antarctica LipaseA)、裙皱假丝酵母脂肪酶(Candida rugosa Lipase)、猪胰脂肪酶(Porcine pancreasLipase)、米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei Lipase)和疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus Lipase)中至少一种。
[0011]上述制备方法中，所述酶与所述磷酸盐缓冲液组成的混合液中，所述酶的浓度为
0.01 ~10mg/mL,具体可为 0.5mg/mL ；
[0012]所述磷酸缓冲液中，所述磷酸氢根和所述磷酸二氢根的浓度均为I~100mM ；
[0013] 所述磷酸氢根具体可来自磷酸氢二钠；所述磷酸二氢根具体可来自磷酸二氢钾；
[0014]所述磷酸氢根的浓度具体可为1mM ;所述磷酸二氢根的浓度具体可为2mM ；
[0015]所述磷酸缓冲液的pH为5.0~9.0,具体可为7.4。
[0016]上述制备方法中，所述金属离子以其水溶液的形式添加至所述磷酸盐缓冲液中；
[0017]所述水溶液中金属离子的浓度为10~100mM,具体可为200mM。
[0018]上述制备方法中，所述金属离子与所述酶的质量比为0.1~5:1，具体可为0.256:
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[0019]上述制备方法中，在静置条件下，于O~50°C的温度下得到所述酶-无机晶体复合微球，具体可为25°C或4°C ；
[0020]所述静置的时间为I~100小时，具体可为24小时。
[0021 ] 上述制备方法中，所述混合方式为滴加混合和微反应器混合中的任一种。
[0022]上述制备方法还包括如下步骤:干燥所述酶-无机晶体复合微球；
[0023]所述干燥方式为真空常温干燥、喷雾干燥和冷冻干燥中任一种。
[0024]本发明进一步提供了上述制备方法所制备的酶-无机晶体复合微球，其中，酶的质量含量为5%~20%，具体可为 5%~10%、5%或10%。
[0025]本发明提供的一种单酶或者多酶固定化的方法，该方法具有操作简单、成本低廉等优点。本发明制备得到的酶-无晶体复合微球中酶的稳定性得到极大提高，酶活性基本保持不变甚至有所提高。以上特点使得该种酶-无机晶体复合微球在酶催化合成、生物传感等领域有极大的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为实施例6中磷酸铜晶体与酶-磷酸铜晶体复合微球的XRD及标准卡片对比图。
[0027]图2为实施例1所制备的酶-磷酸铜晶体复合微球的扫描电镜图。
[0028]图3为实施例2所制备的酶-磷酸铜晶体复合微球的扫描电镜图。
[0029]图4为实施例3所制备的酶-磷酸铜晶体复合微球的扫描电镜图。
[0030]图5为实施例4所制备的酶-磷酸铜晶体复合微球的扫描电镜图。
[0031]图6为实施例5所制备的酶-磷酸铜晶体复合微球的扫描电镜图。
[0032]图7为实施例6所制备的酶-磷酸铜晶体复合微球的扫描电镜图。
[0033]图8为实施例6所制备的酶-磷酸铜晶体复合微球和酶粉末的吸光度与葡萄糖浓度的关系曲线的对比图。
[0034]图9为实施例6所制备的酶-磷酸铜晶体复合微球与酶粉末的相对酶活随时间的变化曲线。
[0035]图10为实施例7中吸光度与不同葡萄糖浓度的关系曲线，内嵌图为葡萄糖浓度在O~20 μ M内吸光度与浓度的线性关系图。
【具体实施方式】
[0036]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0037]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0038]PBS 缓冲液(pH = 7.4)的配方:10mM HPO广，2mM H2PO4' 137mM NaCl 和 2.7mM KCl。
[0039]下述实施例中酶的活性:南极假丝酵母脂肪酶B(约为9U/mg)，葡萄糖脱氢酶(100-200U/mg)，纤维二糖脱氢酶(0.25-0.40U/mg)，尿酸酶(15-30U/mg)，葡萄糖氧化酶(约为15U/mg)，辣根过氧化物酶(约为150U/mg)，如无特殊说明所有酶购自Sigma公司。
[0040]下述实施例中酶的负载量L由以下公式得到:
【权利要求】
1.一种酶-无机晶体复合微球的制备方法，包括如下步骤: 金属离子和酶均溶解于磷酸盐缓冲液中，即得到所述酶-无机晶体复合微球； 所述金属离子为钙离子、镁离子、铁离子、亚铁离子、铜离子、二价镍离子或锌离子中任一种； 所述磷酸盐缓冲液中包括磷酸氢二根和磷酸二氢根。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于:所述酶的分子量为5~500kD。
3.根据权利要求1或2所述制备方法，其特征在于:所述酶为南极假丝酵母脂肪酶B、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、乙醇脱氢酶、蔗糖酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、漆酶、葡萄糖脱氢酶、纤维二糖脱氢酶、尿酸酶、南极假丝酵母脂肪酶A、褶皱假丝酵母脂肪酶、猪胰脂肪酶、米黑根毛霉脂肪酶、和疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶中至少一种。
4.根据权利要求1-3任一项所述制备方法，其特征在于:所述酶与所述磷酸盐缓冲液组成的混合液中，所述酶的浓度为0.01~10mg/mL ； 所述磷酸缓冲液中，所述磷酸氢二根和所述磷酸二氢根的浓度均为I~100mM ； 所述磷酸缓冲液的pH为5.0~9.0。
5.根据权利要求1-4任一项所述制备方法，其特征在于:所述金属离子以其水溶液的形式添加至所述磷酸盐缓冲液中； 所述水溶液中金属离子的浓度为10~lOOOmM。
6.根据权利要求1-5任一项所述制备方法，其特征在于:所述金属离子与所述酶的质量比为0.1~5:1。
7.根据权利要求1-6任一项所述制备方法，其特征在于:在静置条件下，于O~50°C的温度下得到所述酶-无机晶体复合微球； 所述静置的时间为1~100小时。
8.根据权利要求1-7中任一项所述制备方法，其特征在于:所述混合方式为滴加混合和微反应器混合中的任一种。
9.权利要求1-8中任一项所述制备方法所制备的酶-无机晶体复合微球。
【文档编号】C12N11/14GK104073483SQ201410309010
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年7月1日 优先权日:2014年7月1日
【发明者】李致贤, 戈钧, 刘铮 申请人:清华大学