β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体的涉及一种β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因及其应 用。
【背景技术】
[0002] β -葡聚糖是一种结构性非淀粉多糖，广泛存在于禾本科植物（黑麦、大麦、小麦、 燕麦和稻谷）的胚乳细胞及糊粉层中。物种不同，β-葡聚糖的含量及其所占比例会有很 大区别；在相同物种中，其含量也会因生长环境的不同而有所差异。
[0003] 广义的β-葡聚糖酶是指一类能分解由β-糖苷键连接构成的D-葡萄糖 聚合物的酶系，主要包括昆布多糖酶（EC. 3. 2. 1.6)、β-葡聚糖苷酶（EC. 3. 2. 1.21)、 纤维素酶（EC. 3. 2. 1.4)、内切-β-1，2-葡聚糖酶（EC. 3. 2. 1.71)内切β-1，3-葡聚 糖酶（EC. 3. 2. 1.39)、外切 β-1，3-葡聚糖酶（EC. 3. 2. 1.58)、内切 β-1，4-葡聚糖 酶（EC. 3. 2. 1.4)、内切 β-1，3-1，4-葡聚糖酶（EC. 3. 2. 1.73)、外切 β-1，4-葡聚糖酶 (EC. 3. 2. 1.74)和内切β-1，6-葡聚糖酶（EC. 3. 2. 1.75)，在所有这些酶中以β-1，3-1， 4-D-葡聚糖酶（又称地衣多糖酶）活性最高。
[0004] 狭义的β-葡聚糖酶专指内切β-1，3-1，4-葡聚糖酶，其底物为β-1，3和β-1，4 混和糖苷键连接的内切β-D-葡聚糖。水解内切β-D-葡聚糖时，内切β-1，3-1，4-葡聚糖 酶内切水解与3-0-吡喃葡萄糖连接的β-1，4糖苷键，其产物主要为纤维三糖（3-Ο-β-纤 维二糖-D-吡喃葡萄糖）和纤维四糖（3-0- β -纤维三糖-D-吡喃葡萄糖）。
[0005] β-1，3-1，4-葡聚糖酶是一种重要的工业用酶，目前主要应用于啤酒酿造和饲料 工业中，近年其在生物防治方面的应用受到人们越来越多的关注。姚乌兰等首次报道了多 粘类芽孢杆菌WYllO β -1，3-1，4-葡聚糖酶具有抗稻瘟病菌的特性。以提取的WYllO菌株 基因组DNA为模板进行了基因克隆和表达，为葡聚糖酶在农业生产中的应用开辟了新的研 宄领域。文凤云等研宄发现自-1，3-1，4-葡聚糖酶是多粘类芽孢杆菌0?7菌株抗真菌的 活性组分或其中之一，为葡聚糖酶在生物防治方面的应用提供了理论依据。金志雄等 [56]报 道，内生枯草芽孢杆菌SWB8分泌的β -1，3-1，4-葡聚糖酶具有抗菌和抗肿瘤细胞的活性， 为抗菌和高效低毒的抗肿瘤药物的研宄提供支持。
[0006] 生物防治是解决病原真菌耐药性、环境污染等问题的有效方法。目前研宄与应用 涉及较多的是微生物菌体，但是微生物菌体的应用易受环境条件和菌剂保质期的限制，在 实际生产中防效不稳、效果不够理想。而许多拮抗菌分泌的抑菌蛋白可以在体外抑制或杀 死有害微生物，如果能够分离出抑菌蛋白及其编码序列，这对运用基因工程的手段开发新 型生物保鲜剂将会很有价值和意义。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种β-1，3_1，4-葡聚糖酶基因及其应用。为了实现本发明 的目的，拟采用如下技术方案。
[0008] 本发明一方面涉及一种β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因，其特征在于所述的基因核苷 酸序列为SEQ ID NO. L
[0009] 本发明另一方面涉及β-1，3_1，4-葡聚糖酶，其特征在于所述的酶的氨基酸序列 为 SEQ ID NO. 2.
[0010] 本发明另一方面还涉及上述β-1，3-1，4-葡聚糖酶的应用，所述的应用是抗梨黑 斑病中的应用。
[0011] 本发明的酶可以显著地控制梨链格孢霉孢子的萌发和芽管的伸长，并对菌丝生长 具有破坏作用。通过在梨果上损伤接种和直接喷施重组酶及病原菌的实验发现：接种重组 酶后梨果的病斑直径小于只接种病原菌的病斑直径，且腐烂程度也明显低于对照；梨果经 酶液处理后，发病率为37. 61 %，防病效果为66. 25%，相较于现有的β -1，3-1，4-葡聚糖酶 具有更好的防治效果。
[0012] 微生物信息
[0013] 本发明所筛选的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)J18已经保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 3665,保藏地址为：北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，保藏日期为2010年03月12日。
【附图说明】
[0014] 图1 :重组蛋白的Western Blot检测
[0015] 图2 !SDS-PAGE分析纯化后的重组蛋白
[0016] M :蛋白质分子量标准；1，2 :亲和纯化后的重组蛋白
[0017] 图3 :重组酶对梨链格孢霉菌丝的抑制作用
[0018] 图4 :重组酶在PDA平板上对梨链格孢霉的抑制
[0019] 图5 :重组酶对梨黑斑病的防治
[0020] 左：重组酶；右：对照（无菌水）
[0021] 图6 :重组酶对梨黑斑病的防治效果
[0022] 左：对照（只喷施病原菌）；右：重组酶处理
[0023] 图7 :温度对抑菌效果的影响
[0024] 图8 :pH对抑菌效果的影响
[0025] 图9 :光照对抑菌效果的影响
【具体实施方式】 [0026] 实施例1
[0027] 1.菌株的分离
[0028] 从四川成都梨果园土样中筛选到一株枯草芽孢杆菌（Bacillus substilis)J18， 该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，中国微生物菌种保藏中心 登记编号 CGMCC No. 8343。
[0029] 2.试验方法
[0030] 2.1引物的设计与合成
[0031] 通过在GenBank文库中进行序列查找与同源性比对，根据已登录的β-1，3-1， 4-葡聚糖酶的基因序列及表达载体pET28a(+)的多克隆位点设计引物，在正反向引物5'端 分别引入BamH I和Xho I酶切位点，并加入相应的保护性碱基，由上海生物工程公司合成。
[0032] 引物序列如下：
[0033] 上游引物 Gl :5，-CGGGATCCATGCAAACAGGTGGATCG-3，
[0034] 下游引物 G2 :5' -CCGCTCGAGGCTTATTTTTTTGTATAGCGCACCC-3 '
[0035] 2. 2 β-1，3-1，4-匍聚糖酶基因的克隆
[0036] 2. 2. 1枯草芽孢杆菌（B. substilis) J18基因组DNA的提取
[0037] 对枯草芽孢杆菌J18基因组DNA进行提取，按照试剂盒说明书进行。具体步骤如 下：
[0038] (1)将枯草芽孢杆菌J18以1% (V/V)的接种量接种于LB培养基，在37°C条件下、 200r/min振荡过夜培养。吸取IOmL菌液5000r/min离心lOmin，保留菌体。
[0039] (2)用 STE(lmM EDTA，pH8. O ;10mM Tris-HCl，pH8. O ;0· IM NaCl)洗涤一次， 5000r/min 离心 lOmin，弃上清。
[0040] (3)力卩 4mL TE(lmmol/L EDTA，pH8. 0 ;10mmol/L Tris-HCl，pH8. 0)悬浮沉淀，并加 8 μ L 溶菌酶溶液（50mg/mL)，37°C 静置 20min。
[0041] (4)加 10 yL Rnase(10mg/mL)，再加入 0· 5mL 的 10% SDS 溶液，37°C静置 30min。
[0042] (5)加 10以1^蛋白酶1((2〇11^/1^)，37°〇静置6〇1^11。
[0043] (6)加入相同体积的Tris-饱和酷溶液，混勾，8000r/min离心5min，吸取上清转移 至新的I. 5mLEP管中。
[0044] (7)向上清液中加入相同体积的酷：氯仿，混勾，8000r/min离心5min，吸取上清转 移至新的1.5mLEP管中。
[0045] (8)向上清液中加入1/5体积、浓度为10mol/L的醋酸按和2倍体积无水乙醇，颠 倒混合，静置l〇min，离心沉淀DNA。用70%乙醇洗涤，吸干，加500 μ LTE溶解DNA，-20°C保 存。
[0046] 2. 2. 2 β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因 PCR扩增
[0047] 以提取的枯草芽孢杆菌（B. subtilis) J18的基因组DNA为模板，Gl和G2为引物 进行PCR扩增，在0. 2mL的PCR小管中加入以下成分。
[0048] PCR反应体系（20 μ L)如下：
[0049] 模板 Ιμ? IOxPCRbuffer 2\xb 上游引物σ?(10μΜ) ΙμΙ 下游引物G2(10pM) Ιμ? dNTP(2.5mM) 2\iL· pfii 酶(5U/pL) 0.2μ? (MH2O 12.8μ?
[0050] PCR 扩增程序：95°C 5min ;95°C 45s，61°C 50s，72°C 90s，共进行 30 个循环；循环结 束后，72°C延伸IOmin ;4°C保存。I. 0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。
[0051] 2. 2. 3琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物
[0052] (1)1.0%琼脂糖凝胶制备
[0053] 将0. 2g琼脂糖加入到20mL的I X TAE缓冲液（PH8. 0)中，混匀以后放入微波炉 中加热，直至琼脂糖全部溶解。待琼脂糖冷却以后，温度大约为40 °C -60 °C，吸取I yL的 Gelred染料加入琼脂糖后混匀。选取适当的梳子插到制胶板上，把融化的琼脂糖倒入制胶 槽中。待胶完全凝固后，小心拔去梳子，将带有琼脂糖凝胶的电泳板放入电泳槽中。
[0054] (2)上样：取5 yL PCR产物和I yL6XDNA Buffer，混勾，加到点样孔里。
[0055] (3)电泳：在稳定电压90V条件下电泳30min。
[0056] (4)成像：将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统中拍照保存。切下扩增目的基因片段 的胶。
[0057] 2.2.4目的基因片段的回收
[0058] 将PCR扩增目的基因片段的胶用小量胶回收试剂盒进行回收，实验具体方法参 照试剂盒的说明书。通过1. 〇%琼脂糖凝胶电泳检测回收情况，来估计DNA浓度
[0059] 2. 2. 5目的基因片段与克隆载体pMD18-T的连接
[0060] 按照TaKaRa (大连）公司的T-A克隆载体连接试剂盒说明书步骤将目的基因片段 与克隆载体PMD18-T连接。
[0061] 连接体系（5 μ L)如下：
[0062] 回收目的基因片段 1?3yL
[0063] pMD18-T IyL
[0064] CldH2O 补足到 5 μ L
[0065] 离心混匀，16°C过夜连接。
[0066] 2. 2. 6大肠杆菌感受态细胞的制备
[0067] (1)取_80°C冻存的菌株于固体LB平板上划线，37°C培养箱中过夜培养；
[0068] (2)挑取平板上生长良好的单菌落，接种于3mL LB液体培养基的试管中，37°C， 200r/min振荡过夜培养；
[0069] (3)取ImL的菌液接种于50mL的LB液体培养基中，37°C，200r/m