一种用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统及制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统及制备方法，属于纳米药物【技术领域】。本发明制备方法包括以下步骤：（1）将两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物溶解于水中，并用有机溶剂稀释；（2）将蛋白质溶于水或有机溶剂中，配置成溶液；（3）将步骤（2）制备所得溶液加入步骤（1）制备的溶液中，超声分散，并旋转蒸发成膜；（4）将步骤（3）所成膜加入溶剂重新分散，得纳米粒子溶液，经离心、洗涤、干燥，得到包载蛋白质药物的仿生纳米载体系统。本发明提供的仿生纳米载体系统可保持蛋白质药物的活性，提高蛋白质药物稳定性和生物利用度，且制备条件温和，工艺简单，能够在蛋白质药物制备中得到很好的应用。
【专利说明】一种用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及纳米药物【技术领域】，具体涉及一种用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统及制备方法。
【背景技术】
[0002]随着生物技术及重组技术的革新，蛋白质、多肽等药物的种类和数量日益增多，用途越来越广，可以用来治疗一些以前无法治疗或疗效较差的疾病，已成为人类攻克癌症、恶性肿瘤、心脑血管疾病等顽疾的有力工具。蛋白质药物大多为内源性物质，具有高活性、低毒性、特异性强、生物功能明确等优点，但其存在的稳定性差、体内酶降解、血液半衰期短、难以穿透细胞膜等缺点，对此类药物的临床应用造成了巨大障碍。
[0003]为了提高蛋白质药物的生物利用度和治疗效果，人们发展了一系列蛋白质药物载体技术，如蛋白质及其载体的聚乙二醇(PEG)化，以聚乳酸、葡聚糖、壳聚糖等可降解型高分子及其衍生物为基材构建的微球、微囊及凝胶等作为蛋白质药物传输载体[1.S.Salmaso, P.Caliceti, Self assembling nanocomposites for proteindelivery:Supramolecular interactions of soluble polymers with protein drugs.1nt.J.Pharmac eut.2013，440，111-123 ；2.H.By sell，R.1VlanSSOn9 P.Hans son，M.Malmstenj Microgels and microcapsules in peptide and protein drug delivery.Adv.Drug Deliv.Rev.2011，63，1172-1185.]。虽然这些技术在一定程度上可以改善蛋白质药物的稳定性及延长半衰期，但仍然存在种种不足，如负载蛋白质药物的活性往往会降低；而且载体本身也可能导致一些不良反应，如PEG可能引发补体激活而导致超敏反应和快速血液清除，不可降解的PEG链段在体内累积，等等。
[0004]近年来，人们发现仿细胞膜结构的两性离子磷酸胆碱(PC)基团改性技术可抑制源于非特异性蛋白吸附导致的机体防御机制激活，包括单核吞噬细胞系统的清除作用，改善载体的血液相容性；而且聚两性离子链段可增强蛋白质药物的稳定性而不损失其生物活性[1.R.Matsuno, K.1shihara, Integrated functional nanocolloids coveredwith artificial cell membranes for biomedical applications, Nano Today, 6，61 ~74(2011) ；2.A.J.Keefe, S.Jiang, Poly(zwitterionic) protein conjugates offerincreased stability without sacrificing binding affinity or bioactivity.Nat.Chem.2012，4，59-63.]。因此，利用两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物负载蛋白质药物形成仿生载体系统，可以克服蛋白质药物载体现有技术的不足，实现蛋白质、多肽等蛋白质药物的有效包载及高效化利用。
【发明内容】
[0005]为克服上述现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统的制备方法。
[0006]本发明的另一目的在于提供上述制备方法获得的用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统，实现蛋白质药物的高效化利用。
[0007]本发明的再一目的在于提供上述用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统的应用。
[0008]本发明的目的是通过下述技术方案实现的:一种用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统的制备方法，具体步骤如下:
[0009]( I)将两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物溶于水，用有机溶剂稀释，配制成两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物溶液；
[0010](2)将蛋白质药物溶解于溶剂中，配制成蛋白质药物溶液；
[0011](3)将步骤(2)配制的蛋白质药物溶液缓慢加入步骤(1)配制的两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物溶液中，超声分散，并旋转蒸发成膜；
[0012](4)将步骤(3)所成膜加水搅拌重新分散，得纳米粒子溶液，经离心、沉淀洗涤、干燥，得到用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统。
[0013]本发明的优选方案如下:
[0014]步骤(1)中所述两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物，其特征在于分子结构如式I所示:
[0015]
【权利要求】
1.一种用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统的制备方法，其特征在于具体步骤如下: (1)将两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物溶于水，用有机溶剂稀释，配制成两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物溶液； (2)将蛋白质药物溶解于溶剂中，配制成蛋白质药物溶液； (3)将步骤(2)配制的蛋白质药物溶液缓慢加入步骤(1)配制的两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物溶液中，超声分散，并旋转蒸发成膜； (4)将步骤(3)所成膜加水搅拌重新分散，得纳米粒子溶液，经离心、沉淀洗涤、干燥，得到用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统； 步骤(1)中所述两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物的分子结构如式I所示:
2.根据权利要求1所述的用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统的制备方法，其特征在于:所述的两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物通过下述方法制备获得: 1)将壳聚糖改性得到6-0-三苯基甲醚化壳聚糖，溶于反应介质；加入双取代胆碱膦酸酯，其中6-0-三苯基甲醚化壳聚糖中的氨基与膦酸酯的摩尔比为1:2~10，于O~40°C搅拌反应12~24小时；旋干溶剂，加入甲酸，室温搅拌0.5~2小时；旋干甲酸，加入碱性水溶液，水解0.5~4小时，用去离子水透析，冷冻干燥，得到磷酸胆碱化壳聚糖衍生物； 2)将磷酸胆碱化壳聚糖衍生物溶于pH=2~7的酸性或中性水溶液中，利用N-酰化反应引入疏水基团，控制反应温度在10~40°C，反应24~72小时，控制疏水化试剂与磷酸胆碱化壳聚糖衍生物中氨基的摩尔比为0.05~0.6:1 ;产物经纯化，干燥，得到两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物。
3.根据权利要求2所述的用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统的制备方法，其特征在于: 步骤I)所述壳聚糖为脱乙酰度70%~100%、平均分子质量5000~IOOW的壳聚糖； 步骤I)所述的将壳聚糖改性得到6-0-三苯基甲醚化壳聚糖的改性方法为壳聚糖先后通过N-邻苯二甲酰化和6-0H的三苯基氯甲烷醚化，再用水合肼脱去邻苯二甲酰基得到； 步骤I)所述反应介质为二甲基乙酰胺、三乙胺和四氯化碳的混合溶液；其中每IOOmL二甲基乙酰胺中含有I~IOg的6-0-三苯基甲醚化壳聚糖，其中三乙胺、四氯化碳与6-0-三苯基甲醚化壳聚糖的氨基摩尔比为6:4:1 ; 步骤I)所述双取代胆碱膦酸酯由氯化胆碱和对苯氧基膦酸酯按摩尔比2:1在二甲亚砜/吡啶混合溶剂中反应2小时制得； 步骤I)所述的碱性水溶液为氨水、氢氧化钾或氢氧化钠水溶液中的一种；pH值为10~13。
4.根据权利要求2所述的用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统的制备方法，其特征在于:步骤2)所述的酸性水溶液为乙酸或盐酸水溶液中的一种； 步骤2)所述的磷酸胆碱化壳聚糖衍生物的浓度为5~20g/L ； 步骤2)所述的N-酰化反应为1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐作为偶联剂，将疏水化试剂上的疏水基团通过酰胺键偶联在氨基上； 步骤2)所述的疏水基团为脱氧胆酰基、去羟基胆酰基、胆酰基、胆固醇半琥珀酰基、辛酰基、癸酰基、肉豆蘧酰、棕榈酰基、油酰基或亚油酰基中的至少一种； 步骤2)所述的反应温度为室温； 步骤2)所述的磷酸胆碱化壳聚糖衍生物中氨基、疏水化试剂的羧基和偶联剂的摩尔比为 1:0.05 ~0.6:0.15 ~0.9 ; 步骤2)所述的纯化方法为透析； 步骤2)所述的干燥方法为冷冻干燥。
5.根据权利要求1所述的用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统的制备方法，其特征在于:步骤(1)中所述的两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物溶于水形成的水溶液浓度为0.05 ~10mg/mL ； 步骤(1)中所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈或丙酮中的至少一种，有机溶剂与水之体积比为1:1~19:1。
6.根据权利要求1所述的用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统的制备方法，其特征在于:步骤(2)中所述蛋白质药物为亲水性小肽、疏水性小肽、多肽或蛋白质中的至少一种； 步骤(2)中所述的溶剂为水或适于溶解疏水性蛋白质药物的有机溶剂；所述的适于溶解疏水性蛋白质药物的有机溶剂为甲醇、乙醇或乙腈中的至少一种； 步骤(2)中所述的蛋白质药物溶液的浓度为0.05~10mg/mL。
7.根据权利要求1所述的用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统的制备方法，其特征在于:步骤(3)中所述加入的两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物溶液与蛋白质药物溶液中两亲性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物与蛋白质药物质量之比为在1:1~5:1 ; 步骤(3)中所述的旋转蒸发温度为30~60°C ； 步骤(3)中所述的旋转蒸发成膜的转速为50~300rpm。
8.根据权利要求1所述的用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统的制备方法，其特征在于:步骤(4)中所述的搅拌的时间为10~20min ； 步骤(4)中所述的离心的转速为12000~20000rpm ;离心时间为15~60min ;离心温度为4°C ； 步骤(4)中所述的洗涤为去离子水洗涤，洗涤次数为三次； 步骤(4)中所述的干燥为冷冻干燥。
9.一种用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统由权利要求1~8中任一项所述的制备方法获得。
10.权利要求9所述的用于蛋白质药物传输的仿生纳米载体系统在蛋白质药物制备中 应用。
【文档编号】C08B37/08GK103536895SQ201310451917
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】曾戎, 董宏伟, 梁昊, 屠美, 赵剑豪 申请人:暨南大学