一种口服纳米疫苗运载体的免疫实施与检测技术的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于口服疫苗免疫实施与检测技术领域，具体是涉及应用pH敏感、耐 水解的高分子在口服免疫过程中加强疫苗保护、协助抗原靶向运输与吸收、免疫响应水平 的快速检测方法和用途。
【背景技术】
[0002] 口服疫苗在实施上相对于注射免疫更加便捷，对神经系统伤害小。多肽作为抗原 安全、无毒副作用、可设计性强。尽管肠道系统分布有丰富的免疫细胞和组织为口服疫苗的 应用提供了基础，但由于小肠富含多种水解酶，成为当前口服疫苗成功开发的关键屏障，从 而目前少有口服疫苗成功应用的报道。
[0003] 为了获得有效被肠粘膜吸收进入免疫系统的口服疫苗，本专利发明了 一种以 PMMMA-PLGA完全包裹抗原、有效"绕行"小肠、靶向pH值较高且水解酶少的大肠的疫苗保护 性运载体的免疫实施方法，该实施技术可在大肠控制释放PLGA/抗原纳米颗粒、促进抗原 被细胞吸收。
[0004] 相对于传统的佐剂，该运载体外层聚（甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸甲酯-甲基丙烯 酸）（PMMMA)具有pH响应能力，在酸性下呈致密疏水状态，完全隔离水解酶，保护疫苗，碱性 下发生相变，转变为亲水状态使PLGA/抗原被释放。该运载体在PLGA包裹技术上首次采用 表面自由基聚合反应，填补了常规反应不能完全包裹内核颗粒的缺陷。
[0005] 免疫实施例米用混和伺料，抽干，壳聚糖（用于中性和喊性时稳定疫苗）浸泡的技 术，对受试动物罗非鱼进行投喂，短期内激发罗非鱼体内形成较高水平的特异性抗体（采 用抗原标记技术和非还原PAGE验证），有效消除病原体（GBS菌），保护罗非鱼天数达到210 天以上。结合活体成像分析，受到PMMMA-PLGA保护的抗原（FITC)主要分布于免疫相关的 大肠、肾脏和脾脏，较少在降解酶丰富的肝脏和小肠检出。
[0006] 在检测过程中，首次采用了FITC标记抗原应用非还原PAGE检测抗原-抗体复合 物，快速有效地检测免疫水平。以其为主体，检测技术还包括基于大肠杆菌胞外-周质、胞 内抗原表达系统的快速抗体凝集检测、微量抗血清抑菌实验、免疫保护及FITC标记抗原的 活体成像技术。
[0007] 该项专利的提出基于上述新型口服疫苗运载体的简易制备与相应成套的免疫实 施-检测技术方案，提高了口服免疫的成功率，可用于精确快速地鉴定通过口服该疫苗获 得的免疫水平。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种以pH敏感、酸性至弱碱条件下抗水解的膜壳层的制备 方法，该膜壳层可包裹内核，进而以其作为疫苗运载体进行口服免疫实施及建立诱导免疫 相关性能的快速检测技术体系。
[0009] 本发明通过如下技术方案实现：
[0010] 以一种pH响应的PMMMA膜壳层加强口服疫苗，及相应的免疫实施与免疫水平检 测技术。包括：以PLGA/抗原等具有疏水界面的颗粒体系为基础，通过表面自由基聚合方 法，获得在酸性条件下稳定、抗酶解的聚（甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸） (PMMMA)膜壳层，用以包裹药物内核加强对疫苗等药物的保护，并旨在加强口服疫苗。该疫 苗投喂方式是与饲料混和，首选通过壳聚糖在偏碱环境中提供保护。特定时期采用检测技 术的优化组合鉴定抗体水平，优选地，检测技术包括荧光标记抗原-抗体复合物的非还原 PAGE检测、大肠杆菌抗原表达系统的抗体凝集检测、微量血清抑菌实验、免疫保护及FITC 标记抗原的活体成像技术。
[0011] 根据本发明，所述内壳层具有疏水界面，在实施例中，乳酸-羟基乙酸共聚物 (PLGA)是现有技术中已知的用于抗原的缓释层。
[0012] 根据本发明，所述的pH敏感的聚（甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸） (PMMMA)膜壳层，是通过表面自由基聚合反应直接在PLGA外周实现紧密包裹，该膜壳层在 酸性或中性条件下为致密的疏水层，对酶催化的水解作用有抵抗作用，并能有效逃逸胃、小 肠中的降解和小肠肠道吸收，在碱性提高的大肠中PMMMA通过相转变呈现亲水状态，释放 出可被肠吸收的PLGA/抗原囊泡纳米颗粒。该释放特性实现疫苗在大肠环境的释放与吸 收。优选地，所述聚（甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸）（PMMMA)膜壳层是由三 种前体，即甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸形成的共聚物。免疫水平的检测以抗 原（FITC)-抗体复合物的非还原PAGE检测方法为主体，整合大肠杆菌抗原表达系统的细菌 凝集检测、微量抗血清抑菌检测、免疫保护及FITC标记抗原的活体成像检测技术。
[0013] 在一个优选的实施方案中，所述内核蛋白为蛋白/多肽，优选为具有活性的蛋白/ 多肽。更优选的，所述抗原蛋白为免疫原性和抗原性的蛋白，例如为B族链球菌（GBS)的表 面免疫原性蛋白与环氧硫蛋白（Trx)的融合蛋白Trx-SIP。
[0014] 在一个优选的实施方案中，所述pH敏感PMMMA控释体系是由如下制备方法获 得：在含有PLGA/抗原疫苗体系的液相中，依顺序先后加入甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸甲酯、 甲基丙烯酸，再加入引发剂和催化剂。更优选地，将反应温度控制在40-60°C，pH调节至 6. 0-7. 0,在超声作用下，疏水性较强的甲基丙烯酸甲酯先通过疏水作用吸附至PLGA表面， 进而加入具有疏水性的丙烯酸甲酯吸附PLGA，最后在均匀分散的乳液体系中加入亲水前体 甲基丙烯酸，以及过硫酸铵（APS)和N，N，N'，N' -四甲基乙二胺（TEMED)，在PLGA表面催化 三个前体的自由基聚合反应，使反应得到的线性PMMMA高分子牢固包覆PLGA/抗原。
[0015] 在一个优选的实施方案中，甲基丙烯酸甲酯：丙烯酸甲酯：甲基丙烯酸体积比 为6-8:2-4:1-2,更优选地，体积比为6. 5 :2. 5 :1-2 ;还更优选地，体积比为6. 5:2. 5:1或 6. 5:2. 5:2〇
[0016] 本发明还提供了一种以PMMMA加强内核疫苗体系、实现口服免疫的实施方法与检 测技术，在一个实施例中，包括如下步骤：
[0017] 1)制备包裹所述PLGA/抗原（Trx-SIP)内核疫苗体系的pH敏感膜壳层PMMMA，加 强PLGA/抗原疫苗体系。
[0018] 2)增强型疫苗PMMMA-PLGA/Trx-SIP与食物（含饲料）混和，以壳聚糖溶液浸泡， 获得更稳定的食用疫苗体系。
[0019] 3)采用上述食用疫苗体系在动物中经口免疫。
[0020] 4)抗血清抗体与抗原的免疫反应的非还原PAGE检测，抗血清菌凝、微量抑菌能力 检测，免疫保护实验，以及活体成像技术示踪抗原（FITC标记）在主要脏器内的分布。
[0021 ] 根据本发明，所述步骤1)中，所述抗原为蛋白/多肽，通过现有技术中已知的各种 方法，如乳液中的界面自组装法将PLGA包裹多肽，制备一级疫苗体系。pH敏感层PMMMA的制 备方法优选为：在含有PLGA/抗原的液相中，以甲基丙烯酸甲酯（MMA)、丙烯酸甲酯（MA)和 甲基丙烯酸（MAA)进行自由基聚合反应，在PLGA表面制备得到完全包裹PLGA/抗原颗粒的 pH感应体系。优选的，以过硫酸铵（APS)引发自由基聚合反应。更优选的，N，N，N'，N'_四 甲基乙二胺（TEMED)为催化剂。
[0022] 根据本发明，所述步骤2)中，该食物饲料是以PMMMA-PLGA/抗原体系与食物/饲 料混和制成。优选为：以PMMMA-PLGA/抗原体系与食物在中性或酸性环境下混和，真空抽干 后，浸泡于壳聚糖溶液（pH〈7.0)后，迅速浸泡于弱碱缓冲液数秒后适度干燥制成，使疫苗 在食物中得以稳定。进一步优选为：所获得的食用疫苗经过真空干燥或冷冻干燥，充分去除 水分，保护抗原在储存中不被迅速水解，从而延长抗原活性时间。
[0023] 根据本发明，所述步骤3)中，动物为具有胃肠道系统的脊椎动物。优选为：在30 摄氏度的水温下饲养罗非鱼，采用Trx-SIP作为抗原，按步骤1)和2)制备PMMMA-PLGA/ Trx-SIP的饲料疫苗，疫苗分三次投喂硬骨鱼类罗非鱼，每尾鱼每次以20ygTrx-SIP/克 体重的摄入量进行投喂，每两次投喂之间间隔1周。
[0024] 根据本发明，所述步骤4)中，本发明针对PMMMA-PLGA/抗原口服疫苗的施用提供 了一种新的系统检测方法。通过非还原PAGE在蛋白/肽处于非还原的状态下检测抗体对 抗原（异硫氰酸酯FITC标记）的特异性识别与抗体-抗原复合物形成，相对于传统非还原 凝胶电泳检测方法，标记的技术直观、灵敏度高、抗体对抗原的特异性结合未受FITC标记 的明显影响。细菌凝集检测中，采用系列稀释的抗体分别与大肠杆菌胞内、周质-胞外空间 抗原表达体系，及大肠杆菌胞外表达对照蛋白体系的菌悬液进行混和与凝集检验，确定抗 血清对抗原表达菌的特异性识别与结合作用。其后采用微量抑菌实验，即体积为微升级的 抗血清与病原菌悬液混和，充分培养，在平板上涂布平板，检测菌落形成单位（CFU)。优选 的：菌悬液采用生理盐水，即0. 9%NaCl对细菌进行悬浮。更优选的：混和时间设定为48 小时，包括37°C混和1小时，4°C混和47小时，4°C的设定是为了在离体环境下充分保持抗体 的活性与结合抗原的性能；平板优选为无抗生素的广谱细菌培养平板，例如LB平板；平板 的培养条件优化为37°C3天，30°C4天，以达到充分培养病原菌落的目的。免疫保护实验设 置为抗原投喂组、PMMMA-PLGA/抗原投喂组，和未采取免疫的空白对照组。优选的，采用腹 腔注入法接种病原菌，例如将GBS菌悬液进行腹腔注射，接种经三次口服免疫的罗非鱼，在 210天内连续监测鱼的健康状况，统计感染比例。活体成像技术采用荧光示踪的方法检测抗 原（FITC标记）在罗非鱼主要脏器内的分布。优选的，采用异硫氰酸酯标记抗原Trx-SIP， 按步骤1)和2)制备食用疫苗，对健康的罗非鱼进行投喂，进食36小时后进行活体成像分 析（附图1)。此时疫苗已经过完整的消化系统，并处于循环代谢阶段，利于保证结果的准确 度。
【附图说明】：
[0025] 图1 :活体成像技术分析PMMMA-PLGA/Trx-SIP靶向性能。投喂疫苗36小时后检 测Trx-SIP(FITC标记）在体内的分布。参数：激发光：500nm;发射光：530nm。
【具体实施方式】
[0026] 下面将结合附图和实施例，对