一种耐热重组腈水合酶基因、编码酶、工程菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种来自根瘤菌的耐热重组腈水合酶基因、编码酶、工程菌，以及该基 因工程菌在制备酰胺化合物和降解除草剂一敌草腈中的应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 腈化合物是一类含有氰基（-CN)的有机化合物。在化工领域，腈化合物可以作为 重要的化工原料，广泛应用于化学品酰胺和羧酸及其衍生物的有机合成中。然而，采用化学 法转化腈化合物通常需要强酸、强碱和高压等条件，势必对环境造成严重的污染。与化学水 解法相比，生物催化法反应条件温和（常温、常压和中性PH值），同时对环境污染的压力较 小。更重要的是，由酶介导的生物催化法能实现化学、区域和对映体选择性等优点，提高其 原子经济利用率。另外，腈化合物可以作为除草剂应用于农林业领域。然而，腈化合物通常 具有细胞毒性，大量使用势必将在环境中大量积累，而如何从环境中去除将更加严峻。腈化 合物的生物转化过程中主要涉及到腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶。其中，腈水合酶可以催化 腈水合生成酰胺，而酰胺酶进一步将酰胺催化水解产生羧酸化合物；而腈水解酶可以直接 将腈化合物转化为羧酸化合物。
[0003] 在自然界中，生产腈水合酶的微生物分布非常广泛，如红球菌、假单胞菌、诺卡 氏菌、假诺卡氏菌、产碱杆菌、棒状杆菌等。其中，一些微生物已经用于丙烯酰胺、烟酰胺 等化合物的工业化生产中，如专利号为US007405064B2的专利公开了一种野生睾丸酮丛 毛单胞菌5-MGAM-4D ;专利号ZL88106735的专利公开了一种野生玫瑰色红球菌Jl ;专 利号为ZL86100062的专利公开了一种红球菌S-6、氧化节杆菌和黄色微杆菌；专利号为 ZL99106291. 4的专利公开了一种野生嗜热假诺卡氏菌JCM3095。目前，该领域的主要研宄 针对野生菌株进行筛选和培育，以达到工业生产的要求。然而，在腈水合酶的基因簇中往往 同时含有酰胺酶基因，从而可以转化丙烯酰胺和烟酰胺为丙烯酸和烟酸，严重影响到目标 产物的纯度和实际产率。另外，已报道的腈水合酶具有稳定性差、对底物和产物的耐受性低 等问题。随着生物技术的迅速发展，采用基因工程手段构建腈水合酶的基因工程菌株，不 仅可以从源头阻断酰胺的进一步水解，保证酰胺产品的高质量；而且可以采用蛋白质工程 技术手段对其进行定向改造，提高腈水合酶的某些特性，如稳定性和底物耐受性等。同时， 从基因分子水平进行分析，目前已报道的腈水合酶基因序列具有很高的同源度，如来源于 Rhodococcus属的铁型腈水合酶的序列同源度大于95%。因此，开发基因序列多样性的腈 水合酶基因具有较高的研宄价值和应用潜力。 (三）
【发明内容】
[0004] 本发明目的是提供一种耐热重组腈水合酶基因、编码酶、载体、工程菌及其在催化 腈化合物生成酰胺和生物降解除草剂--敌草腈中的应用。
[0005] 本发明采用的技术方案是：
[0006] 本发明涉及一种耐热重组腈水合酶基因，所述耐热重组腈水合酶基因由SEQ ID NO. 2所示α亚基（氨基酸序列为SEQ ID NO. 5所示）、SEQ ID NO. 3所示β亚基（氨基 酸序列为SEQ ID NO. 6所示）和SEQ ID NO. 4所示活化元件（氨基酸序列为SEQ ID NO. 7 所示）依次连接组成，由于在β亚基基因上游的SD序列比较弱，不利于核糖体的结合和后 续的蛋白翻译，人工添加一段强SD序列，实现该亚基的高效表达，因此优选β亚基上游依 次连接SEQ ID NO. 8所示的大肠杆菌SD序列和SEQ ID NO. 9所示间隔序列。
[0007] 由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7所 示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸 序列同源性在90%以上，且具有相同的酶活力，均可实现本发明目的，属于本发明保护范围 之列。
[0008] 由于核苷酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3和 SEQ ID NO. 4所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90%以上同源性，均可实现本 发明目的，属于本发明保护范围之列。
[0009] 本发明还涉及一种由所述的耐热腈水合酶基因编码的耐热重组腈水合酶，所述耐 热重组腈水合酶为SEQ ID NO. 2所示α亚基基因编码的SEQ ID NO. 5所示氨基酸序列、SEQ ID NO. 3所示β亚基基因编码的SEQ ID NO. 6所示氨基酸序列和SEQ ID NO. 4所示活化元 件基因编码的SEQ ID NO. 7所示氨基酸序列依次连接构成。
[0010] 本发明提供一种由所述耐热重组腈水合酶基因构建的重组载体。
[0011] 本发明提供一种由所述耐热重组载体转化得到的重组基因工程菌。
[0012] 本发明还提供一种所述耐热重组腈水合酶基因在制备耐热重组腈水合酶中的应 用，所述的应用为：在SEQ ID NO. 3所示β亚基基因序列的上游添加 SEQ ID NO. 8(aaggag) 所不的大肠杆菌SD序列和SEQ ID NO. 9 (atatacc)所不间隔序列，形成含SD序列和间隔 序列的β亚基，将SEQ ID NO. 2所示α亚基、含SD序列和间隔序列的β亚基和SEQ ID NO. 4所示活化元件依次连接，合成含有SD序列和间隔序列的耐热重组腈水合酶基因片段， 将含有SD序列和间隔序列的耐热重组腈水合酶基因片段与载体连接，构建含有SD序列和 间隔序列的耐热重组腈水合酶基因片段的重组载体，再将重组载体转化宿主菌，获得的重 组基因工程菌诱导培养，培养液分离获得含耐热重组腈水合酶的菌体细胞。
[0013] 本发明涉及一种所述的耐热重组腈水合酶在催化腈化合物（优选3-氰基吡啶） 生成酰胺（优选烟酰胺）中的应用，具体所述的应用为：以含耐热重组腈水合酶基因的重组 基因工程经诱导培养后获得的湿菌体为催化剂，以PH5. 0?8. 0的磷酸缓冲液为反应介质， 以3-氰基吡啶为底物，在25°C下进行反应，反应结束后，获得含烟酰胺的反应液，将反应液 分离纯化，获得烟酰胺；所述催化剂的用量以湿菌体的重量计为10?50g/L缓冲液（优选 22. 4g/L)，所述底物的终浓度为0· 2?I. Omol/L缓冲液（优选0· 8mol/L) 〇
[0014] 本发明还提供一种所述的耐热重组腈水合酶在生物降解除草剂一敌草腈中的应 用，具体所述的应用为：以含耐热重组腈水合酶基因的重组基因工程经诱导培养后获得的 湿菌体为催化剂，以PH5. 0?8. 0的磷酸缓冲液为反应介质，以敌草腈（2, 6-二氯苯甲腈） 为底物，在25°C下进行反应，反应结束后，获得含2, 6-二氯苯甲酰胺的反应液，将反应液分 离纯化，获得2, 6-二氯苯甲酰胺；所述催化剂的用量以湿菌体的重量计为10?50g/L缓冲 液（优选25. 2g/L)，所述底物的终浓度为0· 05?0· 5mol/L缓冲液（优选0· 2mmol/L)。
[0015] 本发明所述催化剂按如下方法制备：将含耐热重组腈水合酶基因的重组基因工程 种接于含100 μ g/ml Kan的LB液体培养基中，37°C，200rpm振荡培养10?14h ;取培养液 以体积浓度5 %的接种量转接至含50 μ g/ml Kan的新鲜LB液体培养基中，37°C，200rpm振 荡培养至菌体密度（OD6J达到0. 6-1. 0时，加入IPTG至终浓度为0. ImM，18?37°C下诱导 12?18h，将诱导培养液离心，收集湿菌体，即获得催化剂。
[0016] 本发明所述催化剂更优选按如下步骤制备：将基因工程菌E. coli pET28a (+) -NH05甘油保藏菌种接于5mL含100 μ g/ml Kan的LB液体培养基中，37 °C， 200rpm振荡培养10?14h ;取2mL培养液转接至IOOmL含50 μ g/ml Kan的新鲜LB液体培 养基中，37°C，200rpm振荡培养至菌体密度（OD6J达到0. 8左右时，加入IPTG至终浓度为 0· ImM，18?37°C下诱导12?18h，在5000?IOOOOXg条件下离心5?IOmin收集细胞 (即催化剂），用磷酸缓冲液（50?200mM，pH5. 0?8. 0)洗涤两次，重悬于磷酸缓冲液。
[0017] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明实现了源自慢生型大豆 根瘤菌USDA 110中假定腈水合酶基因的功能表达，证明了一种重组腈水合酶的活化元件 在表达过程中的关键作用。同时，本发明提供了一种在大肠杆菌内构建重组腈水合酶基因 工程菌的方法，使腈水合酶基因在活化元件的参与下获得具有高表达量和高活性的腈水合 酶。 (四）
【附图说明】
[0018] 图1为本发明慢生型大豆根瘤菌USDA 110和耐热重组腈水合酶基因的PCR扩增 电泳图；M :核酸Marker ;1 :慢生型大豆根瘤菌USDA 110基因组；2 :耐热重组腈水合酶基因 的PCR扩增产物。
[0019] 图2为本发明重组质粒pET28a⑴-NH05的图谱。
[0020] 图3为本发明基因工程菌株E. coli BL21(DE3)/pET28a(+)-NH05诱导表达产物 的SDS-PAGE电泳图；M :低分子量标准蛋白质；I :E. coli BL21(DE3)/pET-28a(+)空载质粒 对照菌体破碎上清液；2 :基因工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET28a(+)-NH05诱导后菌体破碎 液；3 :基因工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET28a(+)-NH05诱导菌体破碎上清液；4 :基因工程 菌E. coli BL21 (DE3)/pET28a (+)-NH05诱导菌体破胞沉淀，箭头指示腈水合酶的位置。
[0021] 图4为重组腈水合酶NH05纯化的SDS-PAGE电泳图；M :低分子量标准蛋白质；1 : 基因工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET28a(+)-NH05诱导后菌体破碎上清液；2 :重组腈水合酶 NH05经镍柱纯化获得的纯酶液；3 :重组腈水合酶蛋白粉。 (五）
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0023] DNA聚合酶、DNA Marker、限制性内切酶（Nde I、Hind III)和T4DNA连接酶菌购 自宝生物工程（大连）有限公司（Takara?)。
[0024] 细菌基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒和DNA凝胶回收纯化试剂盒购自康宁生 命科技有限公司（Axygen?)。
[0025] E. coli DH5a、E. coli BL21(DE3)和质粒 pET-28a(+)购自 Novagen 公司；低分子 量蛋白质