专利名称：Microbacterium属细菌耐热尿酸氧化酶基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物酶工程领域。具体地说，本发明从一株微杆菌(Microbacterium sp.)基因组中分离得到一个耐热尿酸氧化酶(U0X，EC 1.7.3.3)的基因。该基因经克隆后可在工程菌中高效表达，产生性质优良的耐热尿酸氧化酶。
背景技术：
尿酸(2，4，6-三羟基嘌呤，简称UA)是次黄嘌呤和黄嘌呤代谢的直接产物。人体血液中尿酸水平与痛风、高血压、糖尿病、肾脏病及许多临床综合征相关。血尿酸水平可能反映并整合了不同的危险因子和它们可能的相互作用。故在临床上尿酸指标的分析是非常重要的。尿酸氧化酶是生物体内嘌呤降解代谢途径中的一种酶，它以氧作为受体，能够催化尿酸氧化生成尿囊素、二氧化碳和过氧化氢。该酶的这一催化特性可被应用于尿酸临床诊断中。由于此酶专一性强，反应效率高，酶法尿酸检测试剂盒已研制成功并在临床诊断中得到广泛应用。此外尿酸氧化酶还可用于治疗因肿瘤化疗引起的急性高尿酸血症和痛风引起的慢性高尿酸血症。尽管现有的尿酸氧化酶在上述领域中的应用均有所报导，但在实际生产及应用中由于现有尿酸氧化酶其热稳定性普遍较差，在治疗急性高尿酸血症和痛风引起的慢性高尿酸血症时使酶的半衰期太短，也会对酶法尿酸检测试剂盒的保存及使用不利结果，从而影响了该酶应用的效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种Microbacterium属细菌耐热尿酸氧化酶基因及其用途，将该基因克隆入大肠杆菌中进行诱导表达后，可得到高活性的耐热尿酸氧化酶。为了解决上述技术问题，本发明提供一种Microbacterium属细菌耐热尿酸氧化酶基因，其具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。作为本发明的Microbacterium属细菌耐热尿酸氧化酶基因的改进核苷酸序列还包括在SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。本发明还同时提供了上述基因编码的蛋白质，其具有SEQ IDNo. 2所示的氨基酸序列。作为本发明的蛋白质的改进氨基酸序列还包括在SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。本发明还同时提供了上述Microbacterium属细菌耐热尿酸氧化酶基因的用途， 将该基因克隆入载体中进行诱导表达后，可得到高活性的耐热尿酸氧化酶。
本发明通过这样的技术方案来实现的首先从土壤中筛选出一株能产耐热尿酸氧化酶的菌株，通过优化发酵条件进行发酵、提纯得到纯酶；通过酶性质的分析确定该酶具有优良的热稳定性；然后通过PCR技术得到耐热尿酸氧化酶基因的核酸序列(SEQ ID No. 1)， 并据此得到耐热尿酸氧化酶的氨基酸序列(SEQ ID No. 2)。最后将该基因克隆入大肠杆菌中进行高效表达，到高活性的耐热尿酸氧化酶。 该基因可在大肠杆菌中高表达，产生高活性耐热的尿酸氧化酶。实现本发明的具体技术步骤如下一、产耐热尿酸氧化酶菌株的分离与鉴定将土壤中的微生物接种于以尿酸为唯一碳源的富集培养基中培养，然后划线分离，再将分离得到的菌株接种到分离培养基中，测定菌株的耐热尿酸氧化酶活性。最终分离得到一株产耐热尿酸氧化酶的菌株ZZJ4-1。二、耐热尿酸氧化酶的纯化与性质研究1、耐热尿酸氧化酶的提纯在最佳培养条件下进行发酵得到产酶发酵液，离心收集菌体，高压破裂菌体，离心取上清为粗酶液。粗酶液再经过盐析、DEAE-Cellulose离子交换层析、Toyopearl HW-65C 疏水层析和Si^phadex G-75柱层析，得到纯化的酶。2、耐热尿酸氧化酶性质的研究分别在不同温度、pH下测定尿酸氧化酶的最适反应条件，该酶最佳催化条件为 温度30°C (图3)，pH 8. 5(图5)。通过将酶在不同温度、pH和化学物质的条件下处理一段时间后测定剩余酶活，确定酶的热稳定性(图2)、pH稳定性(图4)以及不同化学物质对酶稳定性的影响。通过Lineweaver-Burk作图法求得尿酸氧化酶的米氏常数Km值为0. 31mmol/ L(图6)，根据所测定得的尿酸氧化酶的比活和相对分子量，计算出该酶的Kcat约为3. 01/
So三、耐热尿酸氧化酶基因的克隆、测序及分析在NCBI数据库中查找与菌株ZZJ4-1亲缘关系较近的微生物的uox序列，通过序列比对找出保守序列，并以此设计引物，以菌株ZZJ4-1的基因组DNA为模板进行PCR扩增， 测序得到uox基因的部分片段。根据已知序列，使用DNA Walking SpeedUpTM Premix KitII 试剂盒对未知部分进行扩增，分别得到uox已知序列的上下游两端序列，最终拼接得到UOX 的全序列，并根据uox序列翻译得到耐热尿酸氧化酶UOX的氨基酸序列。本发明的Microbacterium属细菌耐热尿酸氧化酶基因目前所知的产生最耐热的尿酸氧化酶的基因，其具有优良的热稳定性及催化特性，使该酶能用于酶法测定尿酸及高尿酸血症的治疗中。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是SDS-PAGE测定耐热尿酸氧化酶分子量结果M是标准蛋白Marker，U是耐热尿酸氧化酶；图2是耐热尿酸氧化酶热稳定性研究结果；图3是耐热尿酸氧化酶最适反应温度研究结果；
图4是耐热尿酸氧化酶pH稳定性研究结果； 图5是耐热尿酸氧化酶最适反应pH研究结果； 图6是耐热尿酸氧化酶的Lineweaver-Burk图。
具体实施例方式以下本发明所用的各种培养基均需要按照常规方式进行高温高压灭菌。实施例1、产耐热尿酸氧化酶菌株的分离取2. 0克土(取自杭州周边地)接种于IOmL以尿酸为唯一碳源的富集培养基中 (尿酸，5. Og ；酵母膏，0. 5g ；NaCl，0. Ig ；MgSO4. 7H20，0. 5g ；K2HPO4, 2. Og ；KH2PO4,0. 5g ；H2O, 定容至IOOOmL ；pH 7. 5，按照常规方式进行高温高压灭菌)，于30°C摇床振荡培养。三天后，取ImL培养液接种于IOml已灭菌的上述相同培养基上，继续培养(于 30°C摇床振荡培养3天)。如此重复三次(即重复上述继续培养步骤2次)后用接种环蘸取一环富集培养物，在固体分离培养基(尿酸，3. Og ；酵母膏，3. Og ；NaCl, 0. Ig ；MgSO4. 7H20，0. 5g ；K2HPO4, 2. Og ；KH2PO4,0. 5g，琼脂20g ；H2O定容至IOOOmL ；pH 7. 5，按照常规方式进行高温高压灭菌)中，进行平板划线分离，待菌落形成后，挑取单个菌落。反复划线分离，得到纯化分离菌株。富集得到的菌株接种至富集培养基(同上)中于30度进行摇瓶培养到对数生长后期， 然后进行酶活测定。将待测的菌体细胞用超声波进行破壁，离心(IOmin)后取上清酶液0. ImL加入到含有 0. 6mL 尿酸(4mM，ρΗ8· 5)，0. 15mL4_ 氨基铵替比林(3mM)，0. ImL 苯酚(1.5%)禾口 0. 05mL过氧化物酶(1000U)的混合体系中于30°C反应20min后加入1. OmL无水乙醇终止反应，在540nm处测定其OD值，以测定其尿酸氧化酶活性。产酶经以上鉴定，筛选得到5株产尿酸氧化酶的菌株，分别为ZZJ2-1、ZZJ3-4、 ZZJ4-1、ZZJ5-2 和 ZZJ9-2。之后，对筛选到的5株菌株所产生的尿酸氧化酶做进一步研究，分别对它们的热稳定性进行测定。在25°C 80°C的温度范围内，每隔5°C将酶液在不同温度下处理30min， 再测定其剩余酶活力，确定酶的热稳定性。结果显示，菌株ZZJ4-1所产的尿酸氧化酶具有最高的热稳定性(在70°C处理30min还可保留64%的酶活力)，比其它菌株所产生的酶热稳定性高20-25度。经形态学、生理生化、DNA G+C含量、16S rDNA序列和系统发育分析，鉴定该菌为一株微杆菌(Microbacterium sp.)。实施例2、耐热尿酸氧化酶的纯化以产酶发酵条件(培养基组成为尿酸，3g ；玉米浆，IOg ;Κ2ΗΡ04 ‘ 3H20, 2g ；KH2PO4, 0. 5g ；MgS04'7H20,0. 5g ；NaCl, Ig ；水，IOOOmL ；pH 7. 5。最适培养条件为培养温度 30°C,) 培养IOL发酵液，具体为取IOml的菌液加入IOOml的培养基中，于30°C发酵培养1天；合并后得IOL发酵液。5000rpm离心30min收集菌体，用50mmol/L，pH7. 5的磷酸盐缓冲液洗细胞两次后， 将其悬浮于2倍体积的缓冲液中。以高压细胞破碎机将细胞破碎后，5000rpm离心50min去除细胞碎片，得到粗酶液。
在粗酶液中加入固体硫酸铵，使固体硫酸铵的饱和度分别达到65%和80%，分别离心后收集，分别得到2种蛋白沉淀。以2倍体积的相同缓冲液分别溶解上述2种蛋白沉淀，分别测定蛋白浓度和酶活力，计算比活力。尿酸氧化酶可在硫酸铵饱和度65% 80% 之间大部分沉淀下来。将酶液在PH7. 0，10mmol/L的磷酸盐缓冲液中透析，每隔12h更换 缓冲液至透析完全(可通过测定溶液的电导率得知)。将透析过的酶液上到预先用磷酸缓冲液平衡好的DEAE-纤维素层析柱 (5. 5X85cm)中，用含0 1. 5mol/L KCl的缓冲液进行线性梯度洗脱，分别收集流出液，测定酶活力与蛋白浓度，合并比活力高的部分。将收集到的酶液中加入硫酸铵至65%的饱和度，施于经含65%硫酸铵的缓冲液平衡好的Toyopearl HW-65C疏水层析柱(5. 5cmX85cm) 上端，用含65% O硫酸铵的缓冲液反向梯度洗脱，分别收集，并测定酶活力和蛋白浓度， 合并比活力高的部分。向经过疏水层析的酶液加硫酸铵到90%饱和度，离心收集沉淀，用缓冲液溶解、透析，得到50mL的酶液，上样到预先用lOmmol/L，pH7. O的磷酸缓冲液平衡好的 Sephadex G-75分子筛层析柱，用含有lOOmmol/L KCl的上述相同缓冲液洗脱，分管收集，每隔5管测定酶活力与蛋白浓度，合并比活力最高的部分。经过以上几步纯化后尿酸氧化酶的比活力达到5. 3U/mg，提纯倍数为20倍，得率为31%。纯化后的尿酸氧化酶在SDS-PAGE中显示为单一的条带(图1)，通过与标准蛋白的比较计算，得到其分子量为34000Da。实施例3 酶的热稳定性及最适反应温度在pH 8. 5的硼酸钠缓冲液中不同温度处理30min后测定剩余酶活力。结果如图 2所示，该酶在70°C处理30min还可保留64%的酶活力。在不同温度下测定尿酸氧化酶活力，结果见图3，酶作用的最适温度为30°C。酶的pH稳定性与酶反应最适pH 在不同pH值的不同缓冲液(pH 3. 0-6. 0 0. IM柠檬酸缓冲液；pH 6. 0-8. 5 0. IM 磷酸缓冲液；PH 8. 5-9. 5 0. 05M硼酸缓冲液；pH 9. 5-11. 0 0. 05M硼砂缓冲液)中加入酶液，于室温保温18h，测定剩余酶活力。结果如图4显示，该酶在pH 7.0 10.0稳定。在 pH 3. 0 11. 0的缓冲液中测定酶活力，结果见图5，尿酸氧化酶反应的最适pH为8. 5。实施例4 尿酸氧化酶全基因的测定根据NCBI数据库中尿酸氧化酶序列的比对设计了 6对引物，进行如下所示的PCR
程序Step 1 :94°C 变性 5 分钟；Step 2 :94°C 变性 1 分钟；45°C退火1分钟；72°C延伸1分钟；Step 2进行35个循环；St印3 :72°C 延伸 10 分钟。最终6号引物(上游引物5，-3，:CTCGGCSARAACCAGTA ；下游引物5，-3， AGGTCVACCAGGAAGT)扩增得到约为750bp的条带，经测序与其它的尿酸氧化酶基因比对后确定为UOX的部分片段。之后根据DNA Walking SpeedUpTM Premix Kit II试剂盒说明书的所介绍的操作方法，利用该试剂盒最终在上下游分别扩增出500bp和400bp条带。将三段序列进行拼接得到U0x的核酸序列(SEQ ID No. 1，即序列表第1条)，并以此推出UOX的氨基酸序列(SEQ IDNo. 2，即序列表第2条)，注其后面还有一个终止密码子。该酶与现有的尿酸氧化酶有显著的差异，与现有以NCBI数据库中的尿酸氧化酶比对结果显示蛋白序列的最高相似性为69% (Arthrobacterphenanthrenivorans Sphe3)。 核酸序列最高相似性为 77% (Arthrobacter phenanthrenivorans Sphe3)。实施例5、基因的克隆及表达1、构建重组质粒 根据SEQ ID No. 1序列设计带有NdeI和BamHI酶切位点的引物(上游引物5，_3， CAGCTCGGCATATGACCAACATCATTCTG ；下游引物 5，-3，CTAATGGATCCTCAGGCAGAAGCCTGCG)，进行高保真PCR扩增，割胶回收含有SEQ ID No. 1序列的目的片段。所述扩增体系和扩增条件如下ddH20 38. 5 μ L，10 XPCR 缓冲液(含 Mg2+) 5 μ L，dNTP (5mmol/L) 1 μ L，上下游引物 (10mmol/L)各 2 μ L，模板 DNAl μ L，Taq 酶 0· 5 μ L。PCR 反应程序如下94°C 预变性 5min ； 941变性11^11，521退火 lmin，72°C延伸 lmin，循环 30 次；72°C延伸 IOmin ；4°C保温 lOmin。然后分别采用限制性内切酶NdeI和BamHI对纯化好的PCR产物(割胶回收目的片段)及pET-15b质粒进行酶切，所述酶切体系如下
质粒或PCR产物30 μ 1
IOXBuffer10 μ 1
BamHI2 μ 1
NdeI2μ 1
超纯水56 μ 1
总体积100 μ 1将双酶切好的PCR产物和质粒纯化后进行琼脂糖凝胶电泳，以确定其浓度比例， 按照《PET系统担任手册》中的方法进行联接，构建表达质粒。2、重组质粒的转化，依次进行以下步骤(1)将大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS100 μ L感受态细胞放置于冰上融化；(2)在步骤(1)的所得物中加入5μ L连接体系(上述步骤1的构建重组质粒所得)，轻轻吹勻，放置于冰上30分钟；(3)将步骤⑵所得的感受态细胞放置于42°C的水浴锅中，精确保温90秒；(4)取出步骤(3)所得的感受态细胞，冰浴1分钟；(5)再加入600 μ L LB培养基，立即放置于37°C水浴锅中保温5分钟；(6)再将其放入37°C摇床中，轻微摇动(转速40转/分钟)45分钟；(7)吸取100 μ 1，涂补于含有100 μ g/mL氨苄青霉素和34 μ g/mL氯霉素的LB平板，之后将平板放置于37°C培养箱进行培养，直到长出单菌落。之后，进行以下的菌落PCR，测定细胞是否含有SEQ ID No. 1序列(1)用无菌牙签从平板上挑取菌落。将细菌转移至装有50 μ 1无菌水的离心管中。震荡使细胞分散。(2)将管置于沸水5分钟使细胞裂解。(3) 12000rpm离心1分钟以去除细胞裂片。(4)取10 μ 1上清液加入以下PCR反应体系中ddH20 29. 5 μ L，10 X PCR 缓冲液(含 Mg2+) 5 μ L，dNTP (5mmol/L) 1 μ L，前文所述 SEQ IDNo. 1序列的上，下游引物(10mmol/L)各，Taq酶0.5 μ L。(5)PCR 反应程序如下94°C预变性 5min ；94°C变性 lmin，52°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，循环 30 次；72°C延伸 IOmin ；4°C保温 IOmin0(6)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，筛选出能够扩增出目的条带的阳性克隆(如果能扩增出SEQ ID No. 1序列就说明构建成功工程菌)。3、重组尿酸氧化酶基因在大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS中的诱导表达挑取直径为Imm的构建好工程菌单菌落一个于20mL含有100 μ g/mL氨苄青霉素、 2. 5mmol/L甜菜碱和0. lmmol/L山梨醇的LB培养基中，37°C培养10小时。当0D600达到
0.6左右时，加入IPTG，使其(IPTG)终浓度为lmmol/L开始诱导。25°C培养20小时后，离心收集菌体，用超声波进行破碎细胞，离心去除细胞碎片，收集上清测定尿酸氧化酶活性。结果显示培养液的尿酸氧化酶酶活为9. 55U/mL。(作为比较，原始的菌株ZZJ4-1尿酸氧化酶的发酵产酶活性是0. 8u/ml.)4、工程菌所得尿酸氧化酶的热稳定性的测定实验以工程菌所产的尿酸氧化酶溶解于0. IM的焦磷酸钠缓冲溶液(pH8. 5)中，于55， 60，65，70，75度的水浴中处理60分钟后测定剩余酶活。其结果与野生菌株所产生的尿酸氧化酶热稳定性相同。5、工程菌产的尿酸氧化酶对尿酸的测定反应体系组成R1 :4-氨基安替比林0. 5mmol/L，3-羟基-2，4，6-三溴苯甲酸
1.Ommol/L ；RII 尿酸酶 1. OU/mL，过氧化酶 0. 8U/mL, tris 缓冲液 50mmol/L(pH 7. 5)。尿酸测定时取RI 1ml，加入RII 0. 5ml，于37度保温5分钟后加入不同浓度尿酸样品0. 05ml，于37度保温10分钟后测定OD51tl值，以水作为空白。结果如下表1 :表 权利要求
1.一种Microbacterium属细菌耐热尿酸氧化酶基因，其特征是具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的Microbacterium属细菌耐热尿酸氧化酶基因，其特征是所述核苷酸序列还包括在SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。
3.如权利要求1所述基因编码的蛋白质，其特征是具有SEQID No. 2所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的蛋白质，其特征是所述氨基酸序列还包括在SEQID No. 2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。
5.如权利要求1或2所述的Microbacterium属细菌耐热尿酸氧化酶基因的用途，其特征是将该基因克隆入载体中进行诱导表达后，可得到高活性的耐热尿酸氧化酶。
全文摘要
本发明公开了一种Microbacterium属细菌耐热尿酸氧化酶基因，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明还同时公开了该基因编码的蛋白质，其具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明还同时公开了上述Microbacterium属细菌耐热尿酸氧化酶基因的用途将该基因克隆入载体中进行诱导表达后，可得到高活性的耐热尿酸氧化酶。
文档编号C12N15/70GK102220354SQ20111011120
公开日2011年10月19日 申请日期2011年5月1日 优先权日2011年5月1日
发明者卢向锋, 周学来, 孙玲艳, 张鹏程, 李倩延, 马晓航 申请人:浙江大学