专利名称：：组合纳米材料优化pcr的方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，尤其是一种组合纳米材料优化PCR的方法。
背景技术：
：PCR即聚合酶链式反应，又称体外酶促基因扩增，是一种在体外模拟DNA体内复制的基因扩增技术，该技术由K.Mullis于1985年发明，能在耐热DNA聚合酶的作用及特异性引物的引导下，在很短的时间里就能在一个试管内实现基因的大量复制，一般来说，在数小时内就可以将目的基因扩增至百万倍。在过去的20多年的时间里，PCR技术在不断进步和发展中逐渐成熟，形成了一套完整的技术体系。常规PCR技术因操作简便以及成功率很高的特性在遗传学、微生物学乃至整个生命科学领域的研究中都得到了广泛应用。目前PCR技术仍存在着不少缺点，如扩增的副反应多、扩增产物的产量少、保真度不高等，虽然近年来越来越多的功能强大的引物设计软件被开发出来，但高特异性引物只是提高PCR反应效率的一个方面，而反应体系及反应条件进行优化组合则是解决这一问题的关键。多年来各国科学家的研究成果发现，通过向PCR反应体系中添加一定量的添加剂可以在不同程度上减少或消除副反应的发生，这些添加剂包括匿S0，Betain，BSA，甘油，Tween-20，NP-40，甲酰胺等，但这些添加剂都有各自的局限性，在各种不同的情况下效果差异也很大，因此开发更多更新的PCR反应优化剂是发展PCR技术过程中一项很重要的工作。在后基因组时代基因扩增技术还有很大的改进空间，比如目前没有人可以很简便地扩增lOOkb长度的DNA序列。近年来，纳米技术与生物技术的结合越来越紧密，纳米材料作为一种新型的PCR优化剂已经得到应用。在2004年15期的Nanotechnology杂志上，DaxiangCui等人首次对单壁碳纳米管(SWCNT)作为新型的PCR增效剂做了初步的探讨。在2005年9月的《德国应用化学》杂志上，HaikuoLi等人首次报道了应用胶体金作为PCR优化剂的研究。在全球范围内应用纳米技术改进基因扩增技术还处于早期阶段，大量的纳米材料值得用来探索增进PCR效率的新方法。据检索，发现有两篇专利与本专利申请相关，其中专利CN101240265公开了一种耐热聚合酶的优化方法，其包括下列步骤①可优化的耐热聚合酶及其活性单位根据DNA产物量随聚合酶浓度增大变化的曲线来选择；②确定优化剂纳米金的用量得到具有有效优化作用的纳米金的用量与耐热聚合酶活性单位用量之间的比例；③耐热聚合酶的优化根据步骤②比例来混合耐热聚合酶及纳米金。专利CN101134975涉及纳米碳粉提高聚合酶链式反应(PCR)扩增效果的优化方法，该方法是在现有的PCR扩增方法基础上通过向体系中添加一定量的纳米碳粉来实现的。经过比较，上述两个专利与本专利有本质区别，取得的效果有显著差异。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种使用简便、成本低、易于掌握的组合纳米材料优化PCR的方法，本方法采用纳米材料与有机试剂结合的组合物来提高核酸聚合酶链式反应扩增目的基因的特异性，优化效果明显。本发明的目的是通过以下技术方案实现的—种组合纳米材料优化PCR的方法，步骤包括(1)组合纳米材料的制备；(2)PCR体系的配置；(3)组合纳米材料加入到PCR体系中；(4)PCR条件的设定与运行；(5)PCR产物检测；所述组合纳米材料包括纳米材料和有机试剂，所述纳米材料的终浓度0.1-2.0ug/111，所述有机试剂的终浓度5_15%(V/V)。而且，所述纳米材料包括非金属纳米材料、纳米金属材料、有机纳米材料中的一种或者两种以上的混合物。而且，所述纳米材料的最佳备用浓度为10mg/mL。而且，所述纳米金属材料为胶体HAuCl4，其粒径10nm，在体系终浓度为0.001%(W/V)。而且，所述有机试剂包括乙二醇或1，2-丙二醇。而且，所述的PCR包括常规PCR、低拷贝数DNA扩增、长片段PCR、复杂模板PCR、高GC含量的PCR或反复扩增的PCR，以及含有较多重复序列的DNA片段的扩增。本发明的优点和有益效果是本发明作为纳米技术与生物技术结合的新成果，与现有技术相比，本发明通过向扩增体系中添加一定量的纳米材料及有机试剂来实现扩增目的基因的特异性，效果非常明显，且应用成本低、使用简便、易于掌握。图1为本发明实施例1的凝胶色谱图，PCR扩增中添加的组合纳米材料为纳米材Bll(纳米碳粉(<30nm，终浓度1.3ug/ul)+乙二醇(终浓度13%V/V))料优化扩增片段长度约为700bp的DNA片段的结果；图2为本发明实施例2的凝胶色谱图，PCR扩增中添加的组合纳米材料为纳米材料B17(多壁纳米碳管(终浓度1.3ug/ul)+l，2-丙二醇(终浓度13XV/V))优化扩增片段长度约为700bp的DNA片段的结果；图3为本发明实施例3的凝胶色谱图，PCR扩增中添加的组合纳米材料为纳米材料B18(多壁纳米碳管(外径<8nm，终浓度1.3ug/ul)+乙二醇(终浓度13%V/V))优化扩增片段长度约为700bp的DNA片段的结果；图4为本发明实施例4的凝胶色谱图，PCR扩增中添加的组合纳米材料为纳米材料B28(纳米碳粉(<30nm，终浓度1.3ug/ul)+多壁纳米碳管(外径<8nm，终浓度1.3ug/ul)+乙二醇(终浓度13%V/V))优化扩增片段长度约为700bp的DNA片段的结果；图5为本发明实施例5的凝胶色谱图，PCR扩增中添加的组合纳米材料为纳米材料B38(多壁纳米碳管(外径<8nm，终浓度1.3ug/ul)+1，2-丙二醇(终浓度13%V/V)+纳米金(10nm，终浓度0.001%HAuCl4W/V)优化扩增片段长度约为700bp的DNA片段的结果；图6为本发明实施例6的凝胶色谱图，PCR扩增中添加的组合纳米材料为纳米材料B39(多壁纳米碳管(外径<8nm，终浓度1.3ug/ul)+乙二醇(终浓度13%V/V)+纳米金(10nm，终浓度0.001%HAuCl4W/V))优化扩增片段长度约为700bp的DNA片段的结果；图7为本发明实施例7的凝胶色谱图，PCR扩增中添加的组合纳米材料为纳米材料B49(纳米碳粉(<30nm，终浓度1.3ug/ul)+多壁纳米碳管(外径<8nm，终浓度1.3ug/ul)+乙二醇(终浓度13%V/V)+纳米金(10nm，终浓度0.001%HAuCl4W/V))优化扩增片段长度约为700bp的DNA片段的结果.具体实施例方式本发明通过以下实施例进一步详述，但以下实施例为说明性的，而不是限定性的，不应依此来局限本发明的保护范围。本发明所涉及的PCR技术的优化方法是通过向PCR体系中添加组合纳米材料以及有机溶剂来实现的，以下实施例中涉及的相关实验操作方法及具体操作方法如下1、纳米材料悬浮溶液的制备纳米材料固体粉末或胶体可以用市售产品，以配置浓度为(W/V)10mg/mL的纳米碳粉悬浮溶液为例，先精确称取10mg已灭菌的纳米碳粉置于已灭菌的1.5mL的小离心管中，用移液器缓慢加入灭菌水至体积为lmL;随后盖紧离心管盖置于超声波振荡器中超声处理一定时间，具体的超声功率及超声时间应以纳米碳粉完全悬浮且在室温下可静止放置至少10min不发生聚积沉淀现象为佳。2、组合纳米材料悬浮溶液的制备纳米材料悬浮液与有机试剂各自作为单一组分进行组合配伍，比如纳米碳粉、单壁纳米碳管、多壁纳米碳管、纳米金、乙二醇和1，2-丙二醇六种单一组分进行组合，总共有56种不同的组合，其中至少包含两种单一组分且至少一种是纳米材料以及一种有机溶剂。在化学结构、制备方法或尺寸上有所不同的纳米材料在本发明中都属于不同种类的纳米材料。3、PCR体系的配置PCR体系根据现有的技术，由待扩增DNA片断的不同而各不相同，具体表现在dNTP、模板、Mg2+、引物的添加量应根据不同的模板和不同的扩增片段长度来选择；PCR反应体系中的H20为双蒸水及以上级别水，或者实验室自制纯水，体系中水的添加量应根据组合纳米材料悬浮溶液添加的体积进行调整，即应扣除相应添加的组合纳米材料悬浮溶液的体积。4、PCR体系的优化在上述PCR反应体系中加入一定体积的组合纳米材料悬浮溶液。5、PCR条件的设定与运行PCR反应条件中的预变性，变性及退火各阶段的温度和对应时间应根据不同模板和引物融解温度来选择；其中的延伸温度根据所用聚合酶的合适温度来选择；其中的延伸时间根据所扩增片段的长度来选择；其中的循环次数根据个人试验目的和需要进行选择。6、PCR产物的检测5—般用琼脂糖凝胶电泳技术进行检测，琼脂糖凝胶的浓度及PCR产物的上样体积需根据具体情况而定。所述的琼脂糖凝胶电泳技术依照已有方法概括如下(1)制备所需要浓度的琼脂糖凝胶，具体浓度大小应根据扩增DNA片段的大小来确定。(2)吸取一定体积的PCR产物上电泳槽点样，同时点上合适分子量标记作为参照。(3)加上适当数值的电压进行电泳。(4)待指示剂到合适位置时，取出胶板于凝胶成象系统下观察并照相记录。所述的组合纳米材料悬浮溶液的浓度为可以根据需要配置不同浓度大小的悬浮液，浓度的单位为质量体积比(W/V)，纳米材料组分在组合前的推荐浓度为10mg/mL，有机试剂可以直接使用原液(V/V浓度在50-100%)进行组合配伍，不管是固体纳米材料，胶体纳米材料或有机试剂。所述的纳米材料是指(l)各类非金属纳米材料，包括碳纳米材料；(2)纳米金属材料；(3)有机纳米材料。所述的PCR扩增是指包括常规PCR、低拷贝数DNA扩增、长片段PCR、复杂模板PCR、高GC含量的PCR以及反复扩增的PCR等等。实施例1—种组合纳米材料优化PCR的方法，步骤如下组合纳米材Bl1(纳米碳粉(<30nm，终浓度1.3ug/ul)+乙二醇(终浓度13%V/V))料优化扩增片段长度约为700bp的DNA片段。l.PCR反应体系的配置按以下顺序和添加量配置体系于薄壁PCR管中IOXPCR缓冲液1.5iiLdNTP底物(2.5mM)1.2iiL引物a(2.OiiM)1iiL引物b(2.OiiM)1iiL模板(0.1yg/yL)0.3iiLMgCl2(25mM)1.2iiLTaq酶(5U/iiL)0.2iiL组合纳米材料悬浮液6iiL灭菌纯水2.6iiL其中，模板为人类基因组DNA，Taq酶购自上海生工(Sangon)。共配置PCR体系6管(1、2、3，l'、2'、3')。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.在第l'、2'、3'管分别依次加入组合纳米材料悬浮溶液6iiL。最后用灭菌纯水补足总体积为15yL，对照管1、2、3管纳米材料悬浮液6L用灭菌纯水6L替代。3.按以下条件在PCR仪上设定条件进行热循环。预变性92°C变性92°C退火57°C延伸72°C完全延伸72°C7min4.对扩增完成后的PCR产物进行琼酯糖凝胶电泳检测。具体扩增结果如图1所示，在图中标记M代表分子量标准带的位置，此图中分子量标准为LambdaDNA/Hindl11(分别为:23.13，9.42，6.56，4.36，2.32，2.03，0.56，0.13kb)，从图中可以看出，与未加任何优化剂的PCR体系扩增的结果相比，组合纳米材料能显著提高扩增特异性。实施例2—种组合纳米材料优化PCR的方法，步骤如下组合纳米材料B17(多壁纳米碳管(终浓度1.3ug/ul)+l，2-丙二醇(终浓度13%V/V))优化扩增片段长度约为7Q0bp的DNA片段的结果。l.PCR反应体系的配置按以下顺序和添加量配置体系于薄壁PCR管中IOXPCR缓冲液1.5iiLdNTP底物(2.5mM)1.2iiL引物a(2.0iiM)1iiL引物b(2.0iiM)1iiL模板(0.1yg/yL)0.3iiLMgCl2(25mM)1.2iiLTaq酶(5U/iiL)0.2iiL组合纳米材料悬浮液6iiL灭菌纯水2.6iiL其中，模板为人类基因组DNA，Taq酶购自上海生工(Sangon)。共配置PCR体系6管(1、2、3，l'、2'、3')。3min30s30s30s30循环<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2.在第l'、2'、3'管分别依次加入组合纳米材料悬浮溶液6iiL。最后用灭菌纯水补足总体积为15yL，对照管1、2、3管纳米材料悬浮液6L用灭菌纯水6L替代。3.按以下条件在PCR仪上设定条件进行热循环。预变性92°C变性92°C退火57°C延伸72°C完全延伸72°C7min4.对扩增完成后的PCR产物进行琼酯糖凝胶电泳检测。具体扩增结果如图2所示，在图中标记M代表分子量标准带的位置，此图中分子量标准为LambdaDNA/Hindl11(分别为23.13，9.42，6.56，4.36，2.32，2.03，0.56，0.13kb)。从图中可以看出，与未加任何优化剂的PCR体系扩增的结果相比，组合纳米材料能显著提高扩增特异性。实施例3—种组合纳米材料优化PCR的方法，步骤如下组合纳米材料B18(多壁纳米碳管(外径<8nm，终浓度1.3ug/ul)+乙二醇(终浓度13%V/V))优化扩增片段长度约为700bp的DNA片段的结果。0102]l.PCR反应体系的配置0103]按以下顺序和添加量配置体系于薄壁PCR管中0104]IOXPCR缓冲液1.5iiL0105]dNTP底物(2.5mM)1.2iiL0106]引物a(2.OiiM)1iiL0107]引物b(2.OiiM)1iiL0108]模板(0.1yg/yL)0.3iiL0109]MgCl2(25mM)1.2iiL0110]Taq酶(5U/iiL)0.2iiL0111]组合纳米材料悬浮液6iiL0112]灭菌纯水2.6iiL0113]其中，模板为人类基因组DNA，Taq酶购自上海生工(Sangon)。0114]共配置PCR体系6管(1、2、3，l'、2'、3')。0115]<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2.在第l'、2'、3'管分别依次加入组合纳米材料悬浮溶液6iiL。最后用灭菌纯水补足总体积为15yL，对照管1、2、3管纳米材料悬浮液6L用灭菌纯水6L替代。3.按以下条件在PCR仪上设定条件进行热循环。预变性变性退火延伸完全延伸92°C92°C57°C72°C72°C3min30s30s30s7min>30循环4.对扩增完成后的PCR产物进行琼酯糖凝胶电泳检测。具体扩增结果如图3所示，在图中标记M代表分子量标准带的位置，此图中分子量标准为LambdaDNA/Hindl11(分别为23.13，9.42，6.56，4.36，2.32，2.03，0.56，0.13kb)。从图中可以看出，与未加任何优化剂的PCR体系扩增的结果相比，组合纳米材料能显著提高扩增特异性。0121]实施例40122]—种组合纳米材料优化PCR的方法，步骤如下0123]组合纳米材料B28(纳米碳粉(<30nm，终浓度1.3ug/ul)+多壁纳米碳管(外径<8nm，终浓度1.3ug/ul)+乙二醇(终浓度13%V/V))优化扩增片段长度约为700bp的DNA片段的结果。l.PCR反应体系的配置按以下顺序和添加量配置体系于薄壁PCR管中IOXPCR缓冲液1.5iiLdNTP底物(2.5mM)1.2iiL引物a(2.OiiM)1iiL引物b(2.OiiM)1iiL模板(0.1yg/yL)0.3iiLMgCl2(25mM)1.2iiLTaq酶(5U/iiL)0.2iiL组合纳米材料悬浮液6iiL灭菌纯水2.6iiL其中，模板为人类基因组DNA，Taq酶购自上海生共配置PCR体系6管(1、2、3，l'、2'、3')。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2.在第l'、2'、3'管分别依次加入组合纳米材料悬浮溶液6iiL。最后用灭菌纯水补足总体积为15yL，对照管1、2、3管纳米材料悬浮液6L用灭菌纯水6L替代。3.按以下条件在PCR仪上设定条件进行热循环。预变性92°C变性92°C退火57°C延伸72°C完全延伸72°C7min4.对扩增完成后的PCR产物进行琼酯糖凝胶电泳检测。具体扩增结果如图4所示，在图中标记M代表分子量标准带的位置，此图中分子量标准为LambdaDNA/Hindl11(分别为23.13，9.42，6.56，4.36，2.32，2.03，0.56，0.13kb)。从图中可以看出，与未加任何优化剂的PCR体系扩增的结果相比，组合纳米材料能显著提高扩增特异性。实施例5—种组合纳米材料优化PCR的方法，步骤如下组合纳米材料B38(多壁纳米碳管(外径<8nm，终浓度1.3ug/ul)+l，2-丙二醇(终浓度13%V/V)+纳米金(10nm，终浓度0.001%HAuCl4W/V)优化扩增片段长度约为700bp的DNA片段的结果。0147]l.PCR反应体系的配置:0148]按以下顺序和添加量配置体系于薄壁PCR管中0149]IOXPCR缓冲液1.5iiL0150]dNTP底物(2.5mM)1.2iiL0151]引物a(2.OiiM)1iiL0152]引物b(2.OiiM)1iiL0153]模板(0.1yg/yL)0.3iiL0154]MgCl2(25mM)1.2iiL0155]Taq酶(5U/iiL)0.2iiL0156]组合纳米材料悬浮液6iiL0157]灭菌纯水2.6iiL0158]其中，模板为人类基因组DNA，Taq酶购自上海生工(Sangon)。0159]共配置PCR体系6管(1、2、3，l'、2'、3')。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2.在第l'、2'、3'管分别依次加入组合纳米材料悬浮溶液6iiL。最后用灭菌纯水补足总体积为15yL，对照管1、2、3管纳米材料悬浮液6L用灭菌纯水6L替代。3.按以下条件在PCR仪上设定条件进行热循环。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>完全延伸72°C7min4.对扩增完成后的PCR产物进行琼酯糖凝胶电泳检测。具体扩增结果如图5所示，在图中标记M代表分子量标准带的位置，此图中分子量标准为LambdaDNA/Hindl11(分别为23.13，9.42，6.56，4.36，2.32，2.03，0.56，0.13kb)。从图中可以看出，与未加任何优化剂的PCR体系扩增的结果相比，组合纳米材料能显著提高扩增特异性。实施例6—种组合纳米材料优化PCR的方法，步骤如下组合纳米材料B39(多壁纳米碳管(外径<8nm，终浓度1.3ug/ul)+乙二醇(终浓度13%V/V)+纳米金(10nm，终浓度0.001%HAuCl4W/V))优化扩增片段长度约为700bp的DNA片段的结果。l.PCR反应体系的配置按以下顺序和添加量配置体系于薄壁PCR管中。IOXPCR缓冲液1.5iiLdNTP底物(2.5mM)1.2iiL引物a(2.OiiM)1iiL引物b(2.OiiM)1iiL模板(0.1yg/yL)0.3iiLMgCl2(25mM)1.2iiLTaq酶(5U/iiL)0.2iiL组合纳米材料悬浮液6liL灭菌纯水2.6iiL其中，模板为人类基因组DNA，Taq酶购自上海生工(Sangon)。3min30s30s30s30循环共配置PCR体系6管(1、2、3，l'、2'、3')。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.在第l'、2'、3'管分别依次加入组合纳米材料悬浮溶液6iiL。最后用灭菌纯水补足总体积为15yL，对照管1、2、3管纳米材料悬浮液6iiL用灭菌纯水6iiL替代。3.按以下条件在PCR仪上设定条件进行热循环。预变性92°C变性92°C退火57°C延伸72°C完全延伸72°C7min4.对扩增完成后的PCR产物进行琼酯糖凝胶电泳检测。具体扩增结果如图6所示，在图中标记M代表分子量标准带的位置，此图中分子量标准为LambdaDNA/Hindl11(分别为23.13，9.42，6.56，4.36，2.32，2.03，0.56，0.13kb)。从图中可以看出，与未加任何优化剂的PCR体系扩增的结果相比，组合纳米材料能显著提高扩增特异性。实施例7—种组合纳米材料优化PCR的方法，步骤如下组合纳米材料B49(纳米碳粉(<30nm，终浓度1.3ug/ul)+多壁纳米碳管(外径<8nm，终浓度1.3ug/ul)+乙二醇(终浓度13%V/V)+纳米金(10nm，终浓度0.001%HAuC14W,/V))优化扩增片段长度约为700bp的DNA片段的结果。l.PCR反应体系的配置按以下顺序和添加量配置体系于薄壁PCR管中IOXPCR缓冲液1.5iiLdNTP底物(2.5mM)1.2iiL引物a(2.OiiM)1iiL引物b(2.OiiM)1iiL模板(0.1yg/yL)0.3iiLMgCl2(25mM)1.2iiLTaq酶(5U/iiL)0.2iiL组合纳米材料悬浮液6iiL灭菌纯水2.6iiL3min30s30s30s30循环其中，模板为人类基因组DNA，Taq酶购自上海生工(Sangon)共配置PCR体系6管(1、2、3，l'、2'、3')。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2.在第l'、2'、3'管分别依次加入组合纳米材料悬浮溶液6iiL。最后用灭菌纯水补足总体积为15yL，对照管1、2、3管纳米材料悬浮液6L用灭菌纯水6L替代。3.按以下条件在PCR仪上设定条件进行热循环。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>4.对扩增完成后的PCR产物进行琼酯糖凝胶电泳检测。具体扩增结果如图7所示，在图中标记M代表分子量标准带的位置，此图中分子量标准为LambdaDNA/Hindl11(分别为23.13，9.42，6.56，4.36，2.32，2.03，0.56，0.13kb)。从图中可以看出，与未加任何优化剂的PCR体系扩增的结果相比，组合纳米材料能显著提高扩增特异性。权利要求一种组合纳米材料优化PCR的方法，步骤包括(1)组合纳米材料的制备；(2)PCR体系的配置；(3)组合纳米材料加入到PCR体系中；(4)PCR条件的设定与运行；(5)PCR产物检测；其特征在于所述组合纳米材料包括纳米材料和有机试剂，所述纳米材料的终浓度0.1-2.0ug/ul，所述有机试剂的终浓度5-15％(V/V)。2.根据权利要求1所述的组合纳米材料优化PCR的方法，其特征在于所述纳米材料包括非金属纳米材料、纳米金属材料、有机纳米材料中的一种或者两种以上的混合物。3.根据权利要求1或2所述的组合纳米材料优化PCR的方法，其特征在于所述纳米材料的最佳备用浓度为10mg/mL。4.根据权利要求2所述的组合纳米材料优化PCR的方法，其特征在于所述纳米金属材料为胶体HAuCl4，其粒径10nm，在体系终浓度为0.001%(W/V)。5.根据权利要求1所述的组合纳米材料优化PCR的方法，其特征在于所述有机试剂包括乙二醇或1，2-丙二醇。6.根据权利要求1所述的组合纳米材料优化PCR的方法，其特征在于所述的PCR包括常规PCR、低拷贝数DNA扩增、长片段PCR、复杂模板PCR、高GC含量的PCR或反复扩增的PCR，以及含有较多重复序列的DNA片段的扩增。全文摘要本发明涉及一种组合纳米材料优化PCR的方法，其方法的步骤如下(1)组合纳米材料的制备；(2)PCR体系的配置；(3)组合纳米材料加入到PCR体系中；(4)PCR条件的设定与运行；(5)PCR产物检测；组合纳米材料包括纳米材料和有机试剂。本发明作为纳米技术与生物技术结合的新成果，与现有技术相比，本发明通过向扩增体系中添加一定量的纳米材料及有机试剂来实现扩增目的基因的特异性，效果非常明显，且应用成本低、使用简便、易于掌握。文档编号C12P19/34GK101792787SQ20101013958公开日2010年8月4日申请日期2010年4月6日优先权日2010年4月6日发明者张治洲申请人:山东大正医疗器械股份有限公司