专利名称：一种耐热角质酶-cbd融合酶及其突变体和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种耐热角质酶-CBD融合酶及其突变体和其在涤纶纤维改性中的应用，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术：
涤纶作为当今世界的三大合成纤维之一，与天然纤维相比，表现出良好的物理性能(如强度、弹性、韧性、硬度和耐磨性等)、染色性能和耐高温、耐化学品等特性。然而，由于涤纶纤维是疏水性纤维，其结晶度高，吸湿性差，且易起静电，不仅影响穿着舒适性，而且还限制了复合物改性剂、着色剂、阻燃剂等在加工处理过程中的应用。因此，为了达到优良的润湿性和染色效果，必须对涤纶纤维进行改性。目前，国内采用传统的强碱性或酸性剂处理方法不仅需要消耗大量的能源和化学品(粘合剂，偶联剂等)，而且对生态环境造成了严重威胁。相比于化学改性，生物酶应用于纤维改性是提高合成纤维质量和加工性能的有效途径，顺应了纤维改性工业可持续发展的要求。角质酶是一种多功能的水解酶，它不仅水解植物表皮的角质层，也能水解很多酯类结构包括甘油三酯和合成聚酯等。近来，角质酶在涤纶纤维改性中有潜在的应用价值。然而，角质酶处理大分子聚酯类底物(如涤纶)时存在亲和力差、可及度低的问题，大大降低角质酶的作用效果。国外对角质酶的研究主要集中于真菌来源角质酶，但真菌角质酶热稳定性差，也不适合于纺织工业中的应用。本实验室研究开发的嗜热子囊菌(Thermobifida fusca )可产耐热角质酶，并能有效水解角质、PET等聚酯(陈坚，吴敬，陈晟.一种耐热角质酶及其编码基因和表达.申请号200710026074. 2)。另外，我们采用一种新方法将纤维素结合域(CBD)融合到角质酶上，从而提高角质酶对棉纤维的结合效率及精练效果(吴敬，陈坚，张瑶，陈晟.一种耐热角质酶-CBD的制备及其在棉纤维精练中的应用.申请号200910033667.0)。为了使角质酶-CBD能有效地作用于涤纶纤维，通过对CBM进行结构模拟，结合涤纶纤维结构特点，利用定点突变方法提高角质酶-CBD对涤纶纤维的改性效果。这种提高酶催化效率的结合位点改造策略目前国内外未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种耐热角质酶-CBD融合酶，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种耐热角质酶-CBD融合酶的突变体， 包括一个相应于嗜热子囊菌力i/ii/a /iAsca)的角质酶-CBD结合位点的氨基酸残基的取代，突变成与涤纶聚酯结构类似的氨基酸，与角质酶-CBD融合酶相比具有更强的涤纶纤维水解效率。所述角质酶-CBD突变体是在CBD上的第68位色氨酸Trp突变为亮氨酸Leu，命名为W68L ；突变为酪氨酸Tyr，命名为W68Y。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述突变体的制备方法。为解决上述问题，本发明的技术方案是其特征是在纤维素结合域模拟结构的基础上确定突变位点；设计定点突变引物，以携带角质酶-CBD基因的pET20b ( + )载体为模板构建突变质粒W68L-pET20b和W68Y_pET20b ；将突变质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中， 挑选阳性克隆进行发酵培养，30°C培养48 h ；发酵上清液经硫酸铵沉淀、亲和色谱纯化角质酶-CBD突变体W68L和W68Y。所述耐热角质酶-CBD融合酶及其突变体应用于涤纶纤维改性亦为本发明要求保护的范围。本发明提供了一种耐热角质酶-CBD融合酶及两种具有涤纶纤维高水解效率的耐热角质酶-CBD突变体及其制备方法；突变体W68L和W68Y对涤纶纤维的吸附效率比角质酶-CBD分别提高14%和17%，而对涤纶纤维的水解效率分别是天然角质酶-CBD的1. 4倍和 1. 5倍，非常适宜涤纶纤维改性中应用。
图1耐热角质酶-CBD突变体分离纯化SDS-PAGE图谱
1，W68L发酵上清液；2，W68Y发酵上清液；3，W68L Ni柱纯化结果；4，W68Y Ni 柱纯化结果
图2耐热角质酶-CBD突变体50°C稳定性研究图3耐热角质酶-CBD突变体对涤纶水解效率分析。
具体实施例方式实施例1角质酶-CBD融合酶的制备方法
通过基因全合成的方法获得编码角质酶-CBD的融合基因，序列如SEQ ID NO: 1。角质酶-CBD基因以质粒pET20b (+)为表达载体，以E. coli BL21 (DE3)为表达宿主，实现耐热角质酶-CBD基因的高效表达。其发酵和纯化方法同角质酶-CBD突变体。实施例2角质酶-CBD融合酶对棉纤维的作用效果
在10 mL反应体系中，分别加入ImL角质酶-CBD(或天然角质酶)的酶液(酶活力100U/ mL)，ImL果胶酶液(酶活力100U/mL)，8mL 25mM磷酸钾(pH 8.0),0. 5g原棉纤维和50μ 渗透剂ΤΧ-10。对照与上述条件一致但处理液中不加棉纤维。在室温下反应，定时取样。取出的样品经离心3 min后按照测定酶活的方法测上清液中酶活。被吸附的酶量为对照溶液中的酶活减去上清液中的酶活。结果表明，在与果胶酶互作下，天然角质酶对棉纤维的吸附率为10%，而角质酶-CBD对棉纤维的吸附率为55%。IOmL反应体系包括0. 5g原棉纤维、8mL 25 mM磷酸钾缓冲液(pH 8. 0)、ImL角质酶-CBD (或天然角质酶)酶液(酶活力100U/mL)，ImL果胶酶液(酶活力100U/mL)和50μ 渗透剂ΤΧ-10，在50°C保温。不同时间取样，用0.02mol/L NaOH溶液滴定生成的脂肪酸。结果显示，天然角质酶1 达到反应平衡，生产脂肪酸为ieOMfliol ；角质酶-CBD 6h达到反应平衡时，生成脂肪酸为ISOMfflol。实施例3角质酶-CBD突变体突变位点的确定
纤维素结合域与纤维素结合的关键氨基酸是高度保守的色氨酸残基。通过对第二家
4族CBD多重序列比对，结合涤纶纤维的结构特点，从以上两方面将两个关键点突变成与涤纶聚酯结构类似的氨基酸，以增强酶与底物的疏水作用，从而提高催化效率。具体突变如下(1)将色氨酸突变成亮氨酸，增强与聚酯结构中烷基链的疏水作用，以提高与底物的亲和力；(2)将色氨酸突变成酪氨酸，提高与聚酯结构中苯环的疏水作用，并且羟基产生氢键作用以增强与底物的结合力。实施例4角质酶-CBD突变体的制备方法
利用一步PCR定点突变方法构建W68L-pET20b和W68Y_pET20b突变质粒。W68L-pET20b 和 W68Y_pET20b 突变质粒是以 cutinase_CBMCenA/pET20b 质粒为模板(Yao Zhang, Sheng Chen, Meng Xu, Artur Cavaco-Paulo, Jing ffu, Jian Chen. Characterization of Thermobifida fusca Cutinase-Carbohydrate-Binding Module Fusion Proteins and Their Potential Application in Bioscouring. Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(20) : 6870-6876)，分别用 W68L 和 W68Y 的突变引物通过PCR得到大小为5000bp产物，然后将PCR产物经过Dpn I处理后转化大肠杆菌 JM109，再筛选转化子。测序结果证明除所需位点外，无其他位点突变。因此，突变质粒W68L_pET20b和 W68Y-pET20b构建成功。定点突变互补引物如下所示(突变位点斜体加粗) UW68Y突变
Primer-F GTCACCAGCCTGCCCT^TTVACGGCAGCATCCCG Primer-R: CGGGATGCTGCCGTT^T^GGGCAGGCTGGTGAC 2.W68L突变
Primer-F GTCACCAGCCTGCCC/T^AACGGCAGCATCCCG Primer-R CGGGATGCTGCCGTT^GGGCAGGCTGGTGAC PCR反应体系(50 yL)如下
ddH203710XPrimeSTAR GCBuffer5dNTPMixture (2. 5mM)4Mg2+ (250mM)1Primer-F1Primer-R1质粒0. 5PrimeSTAR HSDNAPolymerase (2. 5U/u L)0. 5
PCR反应程序为94 ° C预变性5 min ；95 ° C变性30 s，55 ° C退火60 s，72 °C延伸6 min ；共循环30次；72 °C延伸10 min ；4 °C保存。核酸电泳检测目的条带大小。
实施例5角质酶-CBD突变体的表达及纯化
将突变质粒W68L-pET20b和W68Y_pET20b转化大肠杆菌BL21 (DE3)。筛选出正确的阳性克隆，在 TB (甘油 5 g/L，蛋白胨 12 g/L，酵母膏 M g/L，K2HP04 12. 54 g/L，KH2P04 2.31 g/L)发酵液体培养基30°C培养48 h时产酶达40-45 U/mL。 将上述耐热角质酶-CBD突变体发酵液于4 0CuOOOO rpm离心10 min除菌体； 上清液中加入50 %固体硫酸铵盐析过夜，所得沉淀用缓冲液A (含50 mM磷酸钠、0. 5 M 氯化钠、10 mM咪唑，pH 7.4)溶解，并在缓冲液A中透析过夜后，通过0. 22 μ m膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，用缓冲液(含50 mM磷酸钠、0.5 M氯化钠、0 -500 mM咪唑，pH 7.4)线性梯度洗脱，流速1 mL/ min，检测波长为观0 nm，分部收集含角质酶酶活的洗脱液；活力组分用30000道尔顿膜离心浓缩，得纯化角质酶-CBD突变体制品；纯化后角质酶达到电泳纯，表观分子量45000道尔顿。纯化过程电泳图见图1。实施例6角质酶-CBD突变体的热稳定性
以可溶性酯对硝基苯丁酸酯(PNPB)为底物时，角质酶-CBD突变体在50°C下保温M h， 酶活仍可达70%以上(图2)。实施例7角质酶-CBD突变体对涤纶纤维的吸附效果测定
将涤纶纤维在60 水浴振荡清洗30 min后于室温晾干。在10 ml反应体系中，分别加入Iml角质酶-CBD突变体(或天然角质酶-CBD)的酶液(酶活力100U/ml)，9 ml 25mM 磷酸钾(pH 8.0),0.5 g预处理的涤纶纤维。对照与上述条件一致但处理液中不加涤纶纤维。在25°g，60 rpm下处理1 h后，取出的样品经离心3000 rpm离心2 min，测定上清液中的酶活。被吸附的酶量为对照溶液中的酶活减去上清液中的酶活。结果表明，突变体W68L 和W68Y对涤纶纤维的吸附效率分别比角质酶-CBD提高14%和17%。实施例8角质酶-CBD突变体对涤纶纤维的改性效果
IOml反应体系包括0. 5g预处理的涤纶纤维、9 ml 25 mM磷酸钾缓冲液(pH 8. 0),1 ml 角质酶-CBD突变体(或天然融合酶CBD)的酶液(酶活力100U/ml)，在50°C，200 rpm下反应。用紫外分光光度计测试不同处理时间下MO nm处的紫外吸光度值。参比样为相同条件下不加入涤纶纤维的角质酶-CBD处理液。结果显示(图3)，随着处理时间的延长，紫外吸光度逐渐上升，当处理时间达到20 h时，紫外吸光度的增加逐渐趋于平缓达到平衡。突变体W68L和W68Y释放的产物量比角质酶-CBD有了较明显的提高，分别提高了 1. 4倍和1.5 倍。
权利要求
1.一种耐热角质酶-CBD融合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.编码权利要求1所述的耐热角质酶-CBD的基因，其核苷酸序列如SEQID NO. 2所7J\ ο
3.权利要求1所述耐热角质酶-CBD融合酶的突变体，其特征是包括一个相应于融合酶中CBD结合位点的氨基酸残基突变成与涤纶聚酯结构类似的氨基酸。
4.权利要求3所述的突变体，其特征在于所述突变为CBD第68位氨基酸色氨酸。
5.权利要求4所述的突变体，其特征在于所述突变为CBD第68位氨基酸色氨酸突变为亮氨酸。
6.权利要求4所述的突变体，其特征在于所述突变为CBD第68位氨基酸色氨酸突变为酪氨酸。
7.权利要求1或3或4所述的耐热角质酶-CBD突变体应用于涤纶纤维改性。
全文摘要
本发明公开了一种耐热角质酶-CBD融合酶及其突变体和其在涤纶纤维改性中的应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明提供了一种嗜热子囊菌(Thermobifidafusca)角质酶-CBD及其突变体的制备方法，突变体包括一个位于嗜热子囊菌(Thermobifidafusca)角质酶-CBD融合酶中CBD上的结合位点的取代。突变体W68L和W68Y对涤纶纤维的吸附效率比角质酶-CBD分别提高14%和17%，而对涤纶纤维的水解能力是角质酶-CBD的1.4倍和1.5倍。这两种角质酶-CBD突变体更适合在涤纶纤维改性中应用。
文档编号C12N15/62GK102358896SQ20111029538
公开日2012年2月22日 申请日期2011年10月8日 优先权日2011年10月8日
发明者吴丹, 吴敬, 夏泽华, 张瑶, 陈坚, 陈晟 申请人:江南大学