专利名称：一种产角质酶基因工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
一种产角质酶基因工程菌及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术：
角质酶是一种多功能酶，属于丝氨酸酯酶的一种，既可水解长链、短链脂肪酸酯、 乳化的甘油三酯和可溶性的合成酯，还能参与酯化、转酯化等，由于角质酶的特殊结构，还 可以水解角质。因此其在纺织工业、食品工业以及生物催化、化工工业等诸多领域有着广泛 的应用前景。角质酶的发酵工艺研究主要集中在野生菌的培养条件优化以及对重组真菌 角质酶采用不同的基因工程宿主细胞(如酿酒酵母、大肠杆菌和曲霉属)进行高效表达，优 化生产工艺，降低生产成本等方面。但由于酵母培养成本高、生长周期长的缺点，以及/^ solani pisi角质酶重组菌稳定性差的问题，至今未有角质酶工业化生产的报道。本实验室陈晟等(ChenS, Tong X，Woodard Rff, Du GC, Wu J, Chen J, Identification and Characterization of Bacterial Cutinase, The Journal of Biological Chemistry, 2008, 283 (28)25854-25862)报道的 力i/ii/a角质 酶热稳定性好，PH稳定范围宽，最适作用温度60°C，最适作用pH 8. 0，符合纺织用角质酶应 用要求。在此基础上通过发酵优化，3L罐发酵30h，酶活达500U/mL (吴敬，吴丹，张瑶，陈 坚，陈晟，一种重组角质酶的发酵工艺，中国专利，申请号200910259651. 1)。但是存在两点 不足在复合培养基的基础上进行补料，成份复杂，不便于发酵调控；采用II型分泌途径， 两步跨越大肠杆菌内外膜，转运效率较低，发酵过程中通过加入一定量的甘氨酸改变细胞 壁通透性来增加胞外分泌水平，这就增加了发酵生产成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种产角质酶基因工程菌。所述基因工程菌是通过构建重组质粒Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)，并转化大 肠杆菌万.coli BL21 (DE3)，得到重组大肠杆菌 Tfu_0883_hlyAs/pET20b (+) /E. coli BL21(DE3)。所述产角质酶基因工程菌的构建方法如下
1)以本实验室前期构建的Tfu_0883/pET20b (+)质粒为模板扩增角质酶Tfu_0883基
因；
2)以五coliCFT073总DNA为模版扩增hlyAs的基因(中国专利申请 200910260984. 6)；
3)以Tfu_0883基因和hlyAs基因PCR割胶回收片断为模板，PCR扩增得到 Tfu_0883-hlyAs 基因；
4)pET20b(+)和Tfu_0883-hlyAs进行双酶切，割胶产物回收转化五co7iJM109感受态 细胞，得到质粒 Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+)；5)重组质粒Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+)转化大肠杆菌五coli BL21 (DE3)，得到大肠 杆菌 Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+) /E. coli BL21 (DE3)。所述Tfu_0883/ pET20b (+)来源(Chen S, Tong X，Woodard Rff, Du GC, Wu J, Chen J, Identification and Characterization of Bacterial Cutinase, The Journal of Biological Chemistry, 2008，283 (28) 25854-25862)
所述质粒 pET20b(+)、菌株五 coli BL21(DE3)购自 Novagen 公司，五 coli CFT073 (ATCC 700928)，购于 ATCC。本发明还要解决的技术问题是提供一种上述产角质酶基因工程菌发酵生产角质 酶的方法。为解决上述问题，具体生产方法如下
1)发酵过程温度维持在36_38°c，通过增减搅拌转速或通入富氧空气使溶解氧维持 20-40 %，通过补加氨水控制生长阶段pH 7. 0-7. 2、诱导产酶阶段pH 6. 4-6. 6 ；
2)发酵5-6h或溶解氧浓度升至〉70%时，以初始3. 5-5. O mL ·厂1 · IT1的流速补 加500g/L的甘油，以后通过指数补料方式流加甘油控制菌体比生长速率在0. 15-0. 22 之间；
3)发酵12-13h或OD600达到25-35时，加入终浓度0. 02-0. 04 mM/L IPTG进行诱 导，同时以8-10 mL .L-1 .h—1的速度补加50g/L的乳糖，停止补加氨水，待pH降至6. 4-6. 6 后通过补加氨水控制PH 6. 4-6. 6 ；
4)发酵15-17h或诱导3-4 h，甘油流速恒定，约为25-35 mL · L-1 · h-1 ；
5)发酵19-21h或OD6tltlF再增加时，将乳糖流速降至2-4 mL · L—1 · h—1，甘油流速6_8 h内逐步下降至步骤4)流速的一半。所述种子培养条件为将_80°C包藏的菌种接入种子培养基，初始pH7. 0-7. 2，回转 恒温摇床37°C、200 rpm培养7-8 h ；种子培养基组成为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，氨苄青霉素浓度为100mg/L。所述发酵过程接种量4%_8%。所述发酵培养基组成为蛋白胨lg/L、酵母粉2g/L、(NH4)2HPO4 4 g/L,KH2PO4 13. 5 g/L，MgSO4 · 7H20 4. lg/L，柠檬酸0. 85 g/L，甘油8g/L，微量元素液5 mL/L，氨苄青霉素浓 度为100mg/L ；发酵过程接种量4%-8%。所述微量元素液组成为=HCl5M/L，FeSO4 · 7H20 10 g/L, ZnSO4 · 7H20 2. 25 g/L, CuSO4 · 5H20 1. 0 g/L, MnSO4 · 4H20 0. 5 g/L, Na2B4O7 · IOH2O 0. 23 g/L, CaCl2 · 2H20 2. 0 g/ L，(NH4)6Mo7O24 0. 1 g/L。本发明构建的产角质酶基因工程菌Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)/BL21 (DE3)摇瓶 培养60小时，角质酶产量达到274 U/mL;采用本发明提供的发酵方法，培养30-34 h，酶活 达到700-750 U/mL，本发明还具有发酵培养基价格低廉，菌种易于调控等优点，适合在角质 酶的工业化生产中应用。
具体实施例方式以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本 发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。菌株和质粒质粒pET20b(+)，菌株五 coli BL21(DE3),^. coli CFT073、 Ε. co7iJM109o材料和方法所用限制性内切酶，T4 DNA连接酶，pMD18-T simple载体，PCR试剂， DNA Marker等均购于TaKaRa宝生物公司；大肠杆菌感受态细胞万.co/iJM109，引物，质粒提 取试剂盒，PCR产物纯化试剂盒均购于上海生工生物工程公司；电转仪购自Bio-Rad公司。实施例1 :Tfu_0883-hlyAs-pET20b(+)/五 coli BL21 (DE3)构建 根据角质酶、hlyAs的基因设计引物两对引物Pl、P2和P3、P4。Pl :5’ -GTAATCCATATGGCCAACCCCTACGAGCGC-3’ P2 :5’ - GACTTCCATAGGCTAAGAACGGGCAGGTGGAG - 3’ P3 :5’ - CTCCACCTGCCCGTTCTTAGCCTATGGAAGTC - 3’ P4 :5’ - CCGCTCGAGTTATGCTGATGCTGTCAAAG - 3’
以质粒Tfu_0883/ pET20b(+)DNA为模板，以PI、P2为引物，PCR扩增角质酶的基因 Tfu_0883。以五coli CFT073总DNA为模版，以P3、P4为引物，PCR扩增hlyAs的基因。PCR反应在50 μ L体系中进行，反应条件为94°C变性Imin后开始循环，然后94°C 变性30s，60°C退火30s，72°C分别延伸Imin和20s，共30个循环后，再于72°C延伸IOmin0 分别扩增得到783 bp和180 bp的PCR片段，割胶回收。然后再以Tfu_0883和hlyAs基因PCR割胶回收片断为模板，以PI、P4为引物，再 进行PCR反应。扩增得到96;3bp的PCR片段，割胶回收，回收片段与pMD18_T simple载体 连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100 mg/L氨苄青霉素的LB固体平板， 经37°C培养过夜，挑选单克隆，接入含100 mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基，37°C，200rpm 培养8-10 h后提取质粒。将此质粒进行序列测定，结果表明此基因全长963个核苷酸，和 Tfu_0883及hlyAs基因的序列均完全相同。将pET20b (+)质粒和Tfu_0883-hlyAs基因进行Nde I和Β ο I双酶切，酶切产物 割胶回收后，再用T4连接酶16°C连接过夜，连接产物转化五coliMim感受态细胞，转化 产物涂布含100 mg/L氨苄青霉素的LB固体平板，经37°C培养过夜，挑选转化子于含100 mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基进行培养，然后抽提质粒，得到富集的Tfu_0883-hlyAs/ pET20b (+)质粒。将所述重组质粒Tfu_0883_hlyAs/pET20b (+)转化万.coli BL21 (DE3) 宿主菌，在含氨苄青霉素(100 mg/L) LB平板上经37 °C培养8-10h，挑选转化子 (Tfu_0883-hlyAs-pET20b(+)/ Ε. coli BL21 (DE3))。实施例2 大肠杆菌 Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+) /E. coli BL21 (DE3)摇瓶发酵 菌株大肠杆菌 Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+) /E. coli BL21 (DE3)。种子培养将-80°C包藏的菌种接入种子培养基，初始pH7. 0-7. 2，回转恒温摇床 37200 rpm培养7-8 h。种子培养基组成为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，氨 苄青霉素浓度为100mg/L。发酵产酶发酵接种量5% ；发酵培养基组成为甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏 24g/L, K2HPO4 12. 54g/L，KH2PO4 2. 31g/L ； 37°C培养 2 h 后加入终浓度 0. 4 mM IPTG 诱导， 降温至25°C培养，60 h产酶达274 U/mL。
实施例3 大肠杆菌 Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)/五 coli BL21 (DE3)发酵工艺 菌株大肠杆菌 Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+) /E. coli BL21 (DE3)。种子培养将-80°C包藏的菌种接入种子培养基，初始pH7. 0-7. 2，回转恒温摇床 37200 rpm培养7-8 h。种子培养基组成为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，氨 苄青霉素浓度为100mg/L。发酵接种量4%_8%。发酵培养基组成为蛋白胨lg/L、酵母粉 2g/L、(NH4)2HPO4 4 g/L，KH2PO4 13. 5 g/ L，MgSO4 · 7H20 4. lg/L，柠檬酸0. 85 g/L，甘油8g/L，微量元素液5 mL/L，氨苄青霉素浓度 为 100mg/L ；微量元素液组成为=HCl 5M/L，FeSO4 · 7H20 10 g/L, ZnSO4 · 7H20 2. 25 g/L, CuSO4 · 5H20 1. O g/L, MnSO4 · 4H20 0. 5 g/L, Na2B4O7 · IOH2O 0. 23 g/L, CaCl2 · 2H20 2. O g/ L，(NH4)6Mo7O24 0. 1 g/L。1)发酵过程温度维持在36_38°C，通过增减搅拌转速或通入富氧空气使溶解氧维 持20-40 %，通过补加氨水控制生长阶段pH 7. 0-7. 2、诱导产酶阶段pH 6. 4-6. 6 ；
2)发酵5-6h或溶解氧浓度升至〉70%时，以初始3. 5-5. O mL · L—1 · IT1的流速补加 500g/L的甘油，以后通过指数补料方式流加甘油控制菌体比生长速率在0. 15-0. 22 之 间；
3)发酵12-13h或OD6c 达到25-35时，加入终浓度0.02-0. 04 mM/L IPTG进行诱导， 同时以8-10 mL · L-1 · h-1的速度补加50g/L的乳糖，停止补加氨水，待pH降至6. 4-6. 6后 通过补加氨水控制PH 6. 4-6. 6 ；
4)发酵15-17h或诱导3-4 h，甘油流速恒定，为25-35 mL · L-1 · h-1 ；
5)发酵19-21h或OD6tltlF再增加时，将乳糖流速降至2-4 mL · L—1 · h—1，甘油流速6_8 h内逐步下降至步骤4)流速的一半。发酵30-34 h，酶活达到 700-750 U/mL。序列表 <110>江南大学
<120> 一种产角质酶基因工程菌及其应用 <160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>根据基因序列设计用于扩增 <400> 1
gtaatccata tggccaaccc ctacgagcgc <210> 2 <211> 32 <212> DNA
30<213>人工合成序列 <220>
<223>根据基因序列设计用于扩增 <400> 2
gacttccata ggctaagaac gggcaggtgg ag32
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>根据基因序列设计用于扩增 <400> 3
ctccacctgc ccgttcttag cctatggaag tc32
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>根据基因序列设计用于扩增 <400> 4
ccgctcgagt tatgctgatg ctgtcaaag29
权利要求
1.一种产角质酶基因工程菌，是将角质酶Tfu_0883基因和hlyAs基因导入大肠杆菌。
2.一种产角质酶基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌是携带重组质粒 Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+)的大肠杆菌五 coli BL21 (DE3)。
3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，具体构建方法如下 以质粒Tfu_0883 /pET20b (+)为模板扩增角质酶Tfu_0883基因；以五coli CFT073总DNA为模版扩增hlyAs的基因；以Tfu_0883基因和hlyAs基因PCR割胶回收片断为模板，PCR扩增得到 Tfu_0883-hlyAs 基因；pET20b (+)和Tfu_0883-hlyAs进行双酶切，割胶产物回收转化五coliJM109感受态细 胞，构建质粒 Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+)；重组质粒Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+)转化大肠杆菌五coli BL21 (DE3)，得到大肠杆 菌 Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+)/E. coli BL21 (DE3)。
4.一种权利要求1所述基因工程菌生产角质酶的方法，包括如下步骤发酵过程温度维持在36-38°C，通过增减搅拌转速或通入富氧空气使溶解氧维持20-40 %，通过补加氨水控制生长阶段PH 7. 0-7. 2、诱导产酶阶段pH 6. 4-6. 6 ；发酵5-6 h或溶解氧浓度升至〉70%时，以初始3. 5-5. 0 mL .L—1 .h—1的流速补加500g/ L的甘油，以后通过指数补料方式流加甘油控制菌体比生长速率在0. 15-0. 3 h—1之间；发酵12-13 h或OD600达到25-35时，加入终浓度0. 02-0. 04 mM/L IPTG进行诱导，同 时以8-10 mL · L-1 · h-1的速度补加50g/L的乳糖，停止补加氨水，待pH降至6. 4-6. 6后通 过补加氨水控制PH 6. 4-6. 6 ；发酵15-17 h或诱导3-4 h，甘油流速恒定，25-35 mL · L-1 · h-1 ； 发酵19-21 h或OD6tltlF再增加时，将乳糖流速降至2-4 mL·!^·!!—1，甘油流速6-8 h 内逐步下降至步骤4)流速的一半。
5.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述种子培养基组成为蛋白胨10g/L，酵 母粉5g/L，NaCl 10g/L，氨苄青霉素浓度为100mg/L。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基组成为蛋白胨lg/L、酵 母粉 2g/L、(NH4)2HPO4 4 g/L，KH2PO4 13. 5 g/L，MgSO4 · 7H20 4. lg/L，柠檬酸 0. 85 g/L，甘 油8g/L，微量元素液5 mL/L，氨苄青霉素浓度为100mg/L。
7.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述其特征在于微量元素液组成为HC1 5M/L, FeSO4 · 7H20 10 g/L, ZnSO4 · 7H20 2. 25 g/L, CuSO4 · 5H20 1. 0 g/L, MnSO4 · 4H20 0. 5 g/L, Na2B4O7 · IOH2O 0. 23 g/L, CaCl2 · 2H20 2. 0 g/L, (NH4)6Mo7O24 0. 1 g/L。
全文摘要
本发明公开了一种产角质酶基因工程菌及其应用，属于生物工程技术领域。构建重组质粒Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)，并转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，得到重组大肠杆菌Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)/E.coliBL21(DE3)。采用补料分批发酵的方式控制一定的比生长速率，发酵培养30-34h，发酵上清酶活达到700-750U/mL。本发明以甘油为主要原料，采用半合成培养基，具有稳定性好，便于调控等优点，适于大规模生产。
文档编号C12N1/21GK102080063SQ20101057892
公开日2011年6月1日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者吴丹, 吴敬, 王蕾, 陈坚 申请人:江南大学