专利名称：一种高温角质酶及其基因序列的制作方法
一种高温角质酶及其基因序列技术领域一种高温角质酶及其基因序列，本发明属于酶基因工程和酶工程领域。具体地说涉及一种编码嗜热子囊菌(77zwmo6折必ykyca)高温角质酶的DNA序列及其表达。
背景技术：
角质酶是一种多功能酶，能水解角质多聚物分子以及各种合成聚酯的酯键 使其降解为单体和小分子寡聚体，同时也能水解各种不溶性甘油三酯和水溶性 酯类。角质酶作用底物的广泛性使其在食品、化工、纺织等领域具有良好的应 用前景。纺织工业是我国的传统产业和支柱产业，在国内生产总值和外贸出口总值 中占有重要比例。但我国纺织工业总体存在产业集中度不高、工艺技术装备落 后和资源利用率低等问题。特别值得注意的是，纺织业是产生污染非常严重的 工业，在前处理和后整理过程中，传统工艺消耗大量的水和化学品，不仅耗费 资源，同时造成环境污染并破坏生态平衡，这对我国实施可持续发展战略极为 不利。从20世纪80年代开始，国外掀起了生物酶在纺织品染整加工中应用的研 究热潮。我国近几年也出台一些新政策推动"绿色纺织品"和生态纺织业的发 展，而纺织前处理工艺全酶化已成为卖现生态纺织的重要手段。角质酶作为纺织前处理工艺中一种重要的酶制剂，在棉织物前处理过程中 的作用，主要是去除具有疏水性的棉纤维表皮层-角质层，以增加棉纤维的润湿 性。近年来，角质酶在合成纤维前处理工艺中的应用成为热门，通过角质酶对 PET等合成纤维疏水表面进行改性，可以很大程度地提高染整效果。将角质酶 用于纤维表面的处理和改性，可取代传统的碱煮工艺，具有处理条件温和、对纤 维损伤小、资源消耗低、对环境污染小等诸多优点的同时，还能显著提高纺织 品加工的品质。国外对角质酶的研究已有三十多年历史。自70年代起，从自然界中筛选到 产角质酶菌种(主要为真菌)，进行野生酶分离纯化和生理生化性质研究。90年 代，为深入了解角质酶的催化特性、分子机理，奠定其开发应用的理论基础， 研究者构建了 Fi^7n、m so/am' cDNA文库，投入大量精力鉴定了该真菌角质酶 的编码基因，并进行了克隆表达。随后，以实验室制备的重组酶为研究材料， 广泛开展了真菌角质酶的理论和应用基础研究。分子水平的理论研究包括晶体结构解析、分子定性、催化机制等。在应用基础研究方面，研究了酶发酵提纯 技术以及采用蛋白质工程技术对酶功能进行修饰，使改造后的酶适应不同的工 业用途。近年来，为开发角质酶的大规模工业化生产，研究热点集中在采用不 同的基因工程宿主细胞(如酿酒酵母&7cc/z"ram_ycas cereWw'ae、大肠杆菌 五"/jehc&a.co/f和曲霉属^ype/^7/船sp.)进行高效表达，优化生产工艺，降低 生产成本等方面的研究。国内对角质酶的研究较少，只有少数几所高校开展了野生菌的筛选和摇瓶 条件的优化，没有工业化生产和应用的实例。综合国内外的研究发现，国外对角质酶的研究主要还是集中在真菌角质酶 上，而对细菌角质酶的报道很少，其主要原因是国外仍旧侧重于开发生化性 质研究已很深入的真菌角质酶，对细菌角质酶的研究没有足够重视；细菌角质 酶编码基因还没有被阐明，无法采用基因重组技术获得大量产品作为研究材料。 但和真菌角质酶相比，细菌角质酶具有比真菌角质酶催化效率高、对环境适应 能力强、以及基因工程表达技术等方面优势，因此，研究细菌角质酶具有极其 重要的价值。 发明内容本发明的一个目的是提供一种高温角质酶，其具有SEQ ID NO: 2所示的氨 基酸序列。本发明的另一个目的是提供一种编码本发明的高温角质酶的DNA分 子，所述的DNA分子具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。 本发明的再一个目的是提供包含本发明基因的表达载体。 本发明的又一个目的是提供包含本发明表达载体的宿主细胞。 本发明的技术方案 一种高温角质酶，它具有SEQIDNO:2所示的氨基酸 序列。所述的高温角质酶的基因，它具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。 所述的高温角质酶基因的表达方法由嗜热子囊菌(r/2^mo^y^a /wm) WSH03-11总DNA获得高温角质酶基因SEQ ID NO:l，角质酶基因以质粒 pET20b(+)为表达载体，以co" BL21 Rosetta (DE3) PlysS为表达宿主，实现高 温角质酶基因的高效表达；(1)嗜热子囊菌7T7^7m^:/Ma/^ca WSH03-11总DNA的提取。 77zemoZ^必/w^a WSH03-11菌株(该菌株巳在化工进展2006年第25 巻第5期公开)，在LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L， NaC110g/L) 中培养2天，10000rpm离心收集菌体，无菌水洗涤，收集沉淀悬浮于500^L Tris-EDTA(三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸)缓冲液，加入15pL溶菌酶，37°C 下保温30 min，再加入5(iL RNA酶，37。C下保温30 min,加入30|iL 10%SDS (十二烷基硫酸钠)和15i^L蛋白酶K， 37。C下保温60min，加入100|iLNaCl(5M)和80|iLCTAB (十六烷基三甲基溴化铵)，65。C下保温20 min，用700pL 的酚氯仿异戊醇体积比25 : 24 : 1混合溶剂抽提，10000rpm离心，上清液 用700pL的氯仿异戊醇体积比24 : 1抽提，10000rpm离心，上清液用140(VL 体积的冰异戊醇混合，-20'C沉淀30min， 10000rpm离心，沉淀加200(aL70。/o乙 醇清洗，10000rpm离心，沉淀用Tris-EDTA缓冲液溶解，即为ryksca WSH03-11 总DNA。(2) 高温角质酶编码基因的克隆以7T^mo&:/^a/^ca WSH03-11总DNA为模版，以下列核苷酸序列作为引 物，下划线为酶切位点7VcoI和五coRI， PCR扩增高温角质酶基因。引物1: 5, — ggAATACCATATgT￡￡^IggCCAACCCCTACgAgCgCgg — 3 ， 引物2: 5， - CATCTCgAgAg^HCgggAACgggCAggTggAgCg - 3， PCR反应在50pL体系中进行，反应条件为在95 'C变性5min后开始循环， 然后95 。C变性lmin， 55 。C退火lmin， 72 。C延伸lmin，共35个循环后，再于 72 。C延伸10min，扩增得到780 bp的PCR片段，割胶回收，回收片断与pMD18画T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100 mg/L氨 苄青霉素的LB平板，经37'C培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，10 h 后提取质粒，命名为CUT-pMD18-Tsimple。将此质粒进行序列测定。(3) 高温角质酶基因的改造以CUT-pMD18-T simple为模板进行定点突变PCR，设计引物 引物3: 5 ， —CATgggCCACTCAATgggCggCggCggC - 3 ， 引物4: 5 ， —gCCgCCgCCgCCCATTgAgTggCCCATg — 3' PCR反应在50pL体系中进行，反应条件为在95 。C变性5min后开始循环， 然后95 °。变性lmin， 55 。C退火lmin， 72 。C延伸4min，共35个循环后，再于 72。C延伸10min，将PCR产物转化￡.co//JM109感受态细胞，转化后的菌体涂 布100 mg/L氨苄青霉素LB平板，挑选单菌落接入100 mg/L氨苄青霉素LB液 体培养基经37X:过夜培养，抽提质粒，将突变后的质粒进行序列测定。(4) 高温角质酶基因在表达载体上的构建 用于构建表达载体的质粒是pET20b(+)，带有pelB信号肽和His-tag标记，将pET20b(+)质粒和角质酶基因进行iVco I和五coR I双酶切，酶切产物割胶回 收后，再用T4连接酶16"C连接过夜，连接产物转化￡.0 /^^[109感受态细胞， 经37"C培养过夜，挑选转化子于100mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后 抽提质粒，得到富集的CUT-pET20b(+)质粒；(5) 大肠杆菌宿主转化和筛选重组菌将质粒CUT-pET20b(+)热击转化￡. co// BL21 Rosetta (DE3) PlysS宿主菌， 再在含氨苄青霉素(100mg/L)和氯霉素(50mg/L)的LB平板上经37。C培养过夜，挑选转化子(重组菌CUT-pET20b(+)/五co//BL21 Rosetta (DE3) PlysS)在 TB培养基(甘油5 g/L，蛋白胨12 g/L，酵母膏24 g/L，K2HP04 12.54 g/L， KH2P04 2.31 g/L)中37'C液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基37'C培养至OD达 1.5后用终浓度4pMIPTG(异丙基硫代PD半乳糖苷)诱导，降温至24匸培养， 64h时产酶达69U/mL。(6)重组高温角质酶的纯化和特性。将上述角质酶发酵液于4 °C， 10000rpm离心20 min除菌体。上清液中加 入70%固体硫酸铵盐析过夜，4 。C， 10000 rpm离心20 min，取沉淀物用适量缓 冲液A (20mM磷酸钠，0.5M氯化钠。20mM咪唑，pH7.4)溶解，并在缓冲 液A中透析过夜后，通过0.22pm膜过滤后制成上样样品。Ni亲和柱用缓冲液A平 衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用缓冲液A 含480mM咪唑 的缓冲液A梯度洗脱，流速lmL/min，检测波长为280nm，分部收集含角质酶 酶活的洗脱液。活力组分用10000道尔顿膜离心浓縮，得纯化角质酶酶制品。纯 化后角质酶达到电泳纯，表观分子量30000道尔顿。纯化过程电泳图见图l。本发明的有益效果本发明提供了高温角质酶基因的高效表达方法。提取 rferwoZny^a/k ca WSH03-11总DNA，设计引物PCR得到编码高温角质酶的基 因，它具有SEQIDNO: l所示的核苷酸序列，全长783个核苷酸，编码261个 氨基酸。以质粒pET20b(+)为表达载体，以BL21 Rosetta (DE3) PlysS为表 达宿主，可实现高温角质酶基因的高效表达，重组酶具有角质酶活性。该高温 角质酶的最适温度为60°C，最适pH 8，在6(TC具有很高的稳定性，半衰期为 45 h。此酶非常适合纺织工业应用的需要。
图1重组角质酶分离纯化SDS-PAGE图谱1、发酵上清液；2、通过Ni柱纯化后样品；3、标准蛋白分子量。 图2高温角质酶最适温度(对硝基苯丁酸酯pNPB为底物) 图3高温角质酶最适pH (对硝基苯丁酸酯pNPB为底物) pH 6-7，使用磷酸钾缓冲液；pH 7-9，使用Tris-HCl (三羟甲基氨基甲垸-盐酸)缓冲液。图4高温角质酶6(TC稳定性研究(对硝基苯丁酸酯pNPB为底物)具体实施方式
实施例1本实施例说明嗜热子囊菌TTzermo&y^a/wca WSH03-11总DNA的提取。 T7zemw6^<i"/wca WSH03-11菌株在LB液体培养基(蛋白胨10 g/L ，酵母 膏5g/L， NaC110g/L)中培养2天，10000ipm离心收集菌体，无菌水洗漆，收 集沉淀悬浮于500jiLTris-EDTA (三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸)缓冲液，加入15pL溶菌酶，37'C下保温30 min，再加入5pLRNA酶，37匸下保温30min， 加入30^iL10。/。SDS (十二烷基硫酸钠)和15]iL蛋白酶K， 37。C下保温60 min， 加入100pLNaCl (5M)和80fiL CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)，65。C下保温 20 min，用700pL的酚氯仿异戊醇体积比25 : 24 : 1混合溶剂抽提， 10000rpm离心，上清液用700pL的氯仿异戊醇体积比24 : 1抽提，10000rpm 离心，上清液用1400(iL体积的冰异戊醇混合，-20匸沉淀301^11， 10000rpm离 心，沉淀加200|iL 70%乙醇清洗，10000rpm离心，沉淀用Tris-EDTA缓冲液溶 解，即为TTzerwoZj^^/wca WSH03-11总DNA。 实施例2本实施例说明高温角质酶编码基因的克隆程序。以77^mo^y^a/wc"WSH03-11总DNA为模版，以下列核苷酸序列作为引 物，下划线为酶切位点A^oI和五coRI， PCR扩增高温角质酶基因。引物1: 5' — ggAATACCATATgT^AIggCCAACCCCTACgAgCgCgg - 3' 引物2: 5 ， — CATCTCgAgAgMIiegggAACgggCAggTggAgCg — 3 ， PCR反应在50(iL体系中进行，反应条件为在95 "C变性5min后开始循环， 然后95 。C变性lmin， 55 。C退火lmin， 72 。C延伸lmin，共35个循环后，再于 72 "C延伸10min。扩增得到780 bp的PCR片段，割胶回收。回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100 mg/L氨 苄青霉素的LB平板。经37t:培养过夜，平板上长了大约十几个菌落，挑四个 菌落，接入LB液体培养基，10h后提取质粒，命名为CUT-pMD18-T simple。 将此质粒进行序列测定，结果表明插入片段含有一个长783bp的开放阅读框 (ORF)，编码一个由261个氨基酸编码的蛋白质。 实施例3本实施例说明高温角质酶基因的改造程序。由于在目标基因内部存在一个iVco I酶切位点，而基因两端分别为AAco I和 五coRl位点，所以设计引物将7VcoI位点突变去除，以方便下步的克隆表达。 以连接了角质酶基因的CUT-pMD18-T simple为模板进行定点突变PCR，设计引 物引物3: 5 ， —CATgggCCACTCAATgggCggCggCggC — 3 ， 弓I物4: 5, -gCCgCCgCCgCCCATTgAgTggCCCATg - 3' PCR反应在50|iL体系中进行，反应条件为在95 "C变性5min后开始循环， 然后95 。C变性lmin， 55 ""C退火lmin， 72。C延伸4min，共35个循环后，再于 72。C延伸10min。将PCR产物转化￡.co//JM109感受态细胞。转化后的菌体涂 布100 mg/L氨苄青霉素LB平板，挑选单菌落接入100 mg/L氨节青霉素LB液 体培养基经37t过夜培养，抽提质粒，将突变后的质粒进行序列测定，结果正确，验证了已经成功突变去除WcoI位点。 实施例4本实施例说明高温角质酶基因在表达载体上的构建程序。用于构建表达载体的质粒是pET20b(+)，带有pelB信号肽和His-tag标记。 将pET20b(+)质粒和角质酶基因进行Wco I和￡coR I双酶切，酶切产物割胶回 收后，再用T4连接酶16T:连接过夜，连接产物转化五.o /!'JM109感受态细胞， 经37X:培养过夜，挑选转化子于100 mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后 抽提质粒，得到富集的CUT-pET20b(+)质粒。实施例5本实施例说明大肠杆菌宿主转化和筛选重组菌的程序。 将质粒CUT-pET20b(+)热击转化co/z' BL21 Rosetta (DE3) PlysS宿主菌， 再在含氨苄青霉素(100mg/L)和氯霉素(50mg/L)的LB平板上经37。C培养 过夜，挑选转化子(重组菌CUT-pET20b(+)/五.co/z'BL21 Rosetta (DE3) PlysS )在 TB培养基(甘油5 g/L，蛋白胨12 g/L，酵母膏24 g/L，K2HP04 12.54 g/L， KH2P04 2.31 g/L)中37"C液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基37"C培养至OD达 1.5后用终浓度4^MIPTG(异丙基硫代(3D半乳糖苷)诱导，降温至24。C培养， 64h时产酶达69U/mL。 实施例6本实施例说明重组高温角质酶的纯化和特性。将上述角质酶发酵液于4 。C， 10000 rpm离心20 min除菌体。上清液中加 入70%固体硫酸铵盐析过夜，4 °C， 10000 rpm离心20 min，取沉淀物用适量缓 冲液A (20 mM磷酸钠，0.5M氯化钠。20mM咪唑，pH7.4)溶解，并在缓冲 液A中透析过夜后，通过0.22pm膜过滤后制成上样样品。Ni亲和柱用缓冲液A平 衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用缓冲液A 含480mM咪唑 的缓冲液A梯度洗脱，流速lmL/min，检测波长为280nm，分部收集含角质酶 酶活的洗脱液。活力组分用10000道尔顿膜离心浓縮，得纯化角质酶酶制品。纯 化后角质酶达到电泳纯，表观分子量30000道尔顿。纯化过程电泳图见图l。将重组酶进行底物水解试验，发现重组酶可水解角质、甘油三酯和可溶性 酯，结果表明角质酶基因实现高效表达。以可溶性酯对硝基苯丁酸酯(pNPB)为底物时，高温角质酶的最适温度为 60°C (图2)，最适pH8 (图3)，在6(TC具有很高的稳定性，半衰期为45 h (图 4)。序列表SEQ ID NO: 1gccaacccctacgagcgcggCCCC￡L￡lCCCgaccgacgccctgctcgaagcccgcagcggc60cccttctccgtgagtga卿acgggcctcccgcttxggtgctgacggtttcggcggcggc120accatctactacccgcgggag犯ca^c3cctacggtgccgtggcgatctcccccggctac180accggcacccaggcctctgtcgcctggctgggcgagcgcatcgcctcccacggcttcgtc240gtcatcaccatcgscacc3acaccaccctcg織agccggacagccgggcccgccagctc300aacgccgcgctggactacatgatc^cgacgcctcgtccgcggtgcgcagccggatcgac360agcagccgactggcggtcatgggCCELCtCC"鹏cggcggcggcaccctgcgtctggcc420tcccagcgtcccgacctgaaggccgccatcccgctcaccccgtggcacctc犯c犯g犯c480tggeigcagtgtgcgggttcccaccctcatcatcggtgctgacctggacaccatcgctccg540gtcctcacccSLCgCCCggCCcttctacaacagcctcccgacctcgatcagcaaggccteic600ctggagctggacggcgc犯cccacttcgccccgaacatxccc犯ca^gatcatcggcaag660tacagcgtcgcctggctcaagcggttcgtcgacaacgacacccgctacacccagttcctc720tgccccggacCgCgCgELCggactcttcggcgaggtcg犯gagtaccgctccacctgcccc780ttctag786SEQ ID NO: 2Ala Asn Pro Tyr Glu Arg Gly Pro Asn Phe Thr Asp Ala Leu Leu5 10 15Glu Ala Arg Ser Gly Pro Phe Ser Val Ser Glu Glu Arg Ala Ser20 25 30Arg Phe Gly Ala Asp Gly Phe Gly Gly Gly Thr lie Tyr Tyr Pro35 40 45Arg Glu Asn Asn Thy Tyr Gly Ala Via Ala lie Ser Pro Gly Tyr50 55 60Thr Gly Thr Gin Ala Ser Val Ala Trp Leu Gly Glu Arg leu Ala65 70 75Ser His Gly Phe Val Val lie Thr Asn Asp Thr lie Thr Thr LeuAsp Gin Pro Asp Ser Arg Ala Arg Gin Leu Asn Ala Ala Leu Asp80859095100105Tyr Met lie Asn Ser Ser Arg Leu Thr Leu Arg Leu Pro Leu Thr Pro Val Pro Thr Leu Val Ala Thr His lie Ser Lys Ala Pro Asn lie Pro Leu Lys Arg Phe Cys Pro Gly Pro Arg Ser Thr CysAsp110Ala125Ala140Trp155lie170Ala185Tyr200Asn215Val230Arg245Pro.260AlaValSerHislieArgLeuLysAspAspPhe 261Ser Ser Met Gly Gin Arg Leu Asn Gly Ala Pro Phe Glu Leu lie lie Asn Asp Gly LeuAla His Pro Lys Asp Tyr Asp Gly Thr PheVal 115 Ser 130 Asp 145 Asn 160 Leu 175 Asn 190 Gly 205 Lys 220 Arg 235 Gly 250Arg Met Leu Trp Asp Ser Ala Tyr Tyr GluSer Gly Lys Ser Thr Leu Thr Ser Thr ValArg GlylieGlyAla AlaSer Vallie AlaPro ThrHis PheVal AlaGin PheGlu GluAsp 120 Gly 135 lie 150 Arg 165 Pro 180 Ser 195 Ala 210 Trp 225 Leu 240 Tyr 25权利要求
1. 一种高温角质酶，它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2、 一种编码权利要求l所述的高温角质酶的基因，它具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。
3、 一种如权利要求2所述的高温角质酶基因的表达方法，其特征是由嗜热 子囊菌(77zemo&:/^a /附ca) WSH03-11总DNA获得高温角质酶基因SEQ ID NO:l ，角质酶基因以质粒pET20b(+)为表达载体，以五.co/f BL21 Rosetta (DE3) PlysS为表达宿主，实现高温角质酶基因的高效表达；(1) 嗜热子囊菌77^mo^/^a/Msca WSH03-11总DNA的提取 77zermo^y^a/^ca WSH03-11菌株在LB液体培养基中培养2天，10000rpm离心收集菌体，无菌水洗涤，收集沉淀悬浮于500(iL Tris-EDTA缓冲液，加入 15pL溶菌酶，37。C下保温30 min,再加入5^L RNA酶，37。C下保温30 min， 加入3(VL 10%十二烷基硫酸钠和15(iL蛋白酶K， 37X:下保温60 min，加入 1 OOjxL 5M的NaCl和80pL十六烷基三甲基溴化铵，65 。C下保温20 min，用700pL 的酚氯仿异戊醇体积比25 : 24 : 1混合溶剂抽提，10000rpm离心，上清液 用700(iL的氯仿异戊醇体积比24 : 1抽提，10000rpm离心，上清液用1400^L 的冰异戊醇混合，-20°。沉淀301^11， 10000rpm离心，沉淀加200|aL 70%乙醇清 洗，10000rpm离心，沉淀用Tris-EDTA缓冲液溶解，即为7T^rmo&y^a/^ca WSH03-11总DNA;(2) 高温角质酶编码基因的克隆以TT^mo&yWa/z^ca WSH03-11总DNA为模版，以下列核苷酸序列作为引 物，下划线为酶切位点脸oI和五coRI， PCR扩增高温角质酶基因；引物1: 5 ， — ggAATACCATATgT^IggCCAACCCCTACgAgCgCgg — 3 ， 引物2: 5 ， - CATCTCgAgAgMEiegggAACgggCAggTggAgCg - 3 ， PCR反应在50pL体系中进行，反应条件为在95 "C变性5min后开始循环， 然后95 。C变性lmin， 55 'C退火lmin， 72 。C延伸lmin，共35个循环后，再于 72 。C延伸10min，扩增得到780 bp的PCR片段，割胶回收，回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100 mg/L氨 苄青霉素的LB平板，经37i:培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，10 h 后提取质粒，命名为CUT-pMD18-Tsimple,将此质粒进行序列测定；(3) 高温角质酶基因的改造以CUT-pMD18-T simple为模板进行定点突变PCR，设计引物 引物3: 5 ， 一CATgggCCACTCAATgggCggCggCggC - 3, 弓I物4: 5 ， 一gCCgCCgCCgCCCATTgAgTggCCCATg _ 3'PCR反应在50|iL体系中进行，反应条件为在95 t:变性5min后开始循环， 然后95 。C变性lmin， 55'C退火lmin， 72 。C延伸4min，共35个循环后，再于 72'C延伸10min，将PCR产物转化五.co//JM109感受态细胞，转化后的菌体涂 布100 mg/L氨苄青霉素LB平板，挑选单菌落接入100 mg/L氨苄青霉素LB液 体培养基经37"C过夜培养，抽提质粒，将突变后的质粒进行序列测定；(4) 高温角质酶基因在表达载体上的构建 用于构建表达载体的质粒是pET20b(+)，带有pe旧信号肽和His-tag标记，将pET20b(+)质粒和角质酶基因进行iVco I和￡coR I双酶切，酶切产物割胶回 收后，再用T4连接酶16i:连接过夜，连接产物转化五.co"'JM109感受态细胞， 经37匸培养过夜，挑选转化子于100mg/L氨节青霉素LB进行液体培养，然后 抽提质粒，得到富集的CUT-pET20b(+)质粒；(5) 大肠杆菌宿主转化和筛选重组菌将质粒CUT-pET20b(+)热击转化co/z' BL21 Rosetta (DE3) PlysS宿主菌， 再在含100 mg/L氨苄青霉素和50 mg/L氯霉素的LB平板上经37匸培养过夜， 挑选重组菌CUT-pET20b(+)/￡. co/z' BL21 Rosetta (DE3) PlysS转化子在TB培养基 中37'C液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基37。C培养至OD达1.5后用 终浓度4 ^M异丙基硫代p D半乳糖苷诱导，降温至24X:培养，64h时产酶达 69U/mL;(6) 重组高温角质酶的纯化和特性将上述角质酶发酵液于4 °C、 10000 rpm离心20 min除菌体；上清液中加 入70%固体硫酸铵盐析过夜，4 'C、 10000 rpm离心20 min，取沉淀物用适量 含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑、pH 7.4的缓冲液A溶解，并在 缓冲液A中透析过夜后，通过0.22pm膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓 冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用缓冲液A 含 480mM咪唑的缓冲液A梯度洗脱，流速lmL/min，检测波长为280 nm，分部 收集含角质酶酶活的洗脱液；活力组分用10000道尔顿膜离心浓縮，得纯化角 质酶酶制品。
全文摘要
一种高温角质酶及其基因序列，本发明属于酶基因工程和酶工程领域。本发明由嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)WSH03-11总DNA获得高温角质酶基因SEQ ID NO1，角质酶基因以质粒pET20b(+)为表达载体，以E.coli BL21 Rosetta(DE3)PlysS为表达宿主，实现高温角质酶基因的高效表达；该角质酶基因全长783个核苷酸，编码261个氨基酸，构建了原核表达质粒，转化大肠杆菌表达角质酶。重组酶具有角质酶活性。该高温角质酶的最适温度为60℃，最适pH 8，在60℃具有很高的热稳定性，半衰期为45h。此酶非常适合纺织工业应用的需要。
文档编号C12N15/55GK101250509SQ20081002012
公开日2008年8月27日 申请日期2008年3月28日 优先权日2008年3月28日
发明者敬 吴, 坚 陈, 晟 陈 申请人:江南大学