一种高效、广谱角蛋白酶及其基因的制作方法

专利名称：一种高效、广谱角蛋白酶及其基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种角蛋白酶及其基因。
角蛋白酶可应用于饲料工业，将羽毛、猪毛等废弃物转化为高营养饲料蛋白。角蛋白是禽类加工过程中产生的废弃物—羽毛中的主要组分，羽毛粉中蛋白质含量高达90％以上，必需氨基酸含量极高，是动物饲料中的优良蛋白源，但它以半胱氨酸二硫键高度互连而形成，不溶于水、不能被一般蛋白酶所降解，因而它在动物体内难以被消化利用。如何将羽毛发酵物转化为动物可利用的蛋白源是目前亟待解决的问题。以往用蒸煮或化学的方法处理，一方面使营养物质被大量破坏，另一方面还造成了环境污染。利用角蛋白酶可有效地解决这一问题，它的优点在于更为经济，同时产品营养价值好，而且无污染。羽毛废弃物资源极为丰富，仅在美国北卡罗拉州一年的羽毛废弃物就超过10万吨，我国是单胃畜禽养殖大国，每年的羽毛废弃物超过60万吨，目前这部分优良的蛋白源未能得到有效利用，造成了资源浪费并污染环境，而我国又是饲料蛋白资源严重匮乏的国家，按照我国饲料工业发展规划，到2010年饲料蛋白的缺口将达到800万吨，羽毛废弃物的有效开发利用对我国这种蛋白资源极度匮乏的国家有着重要的意义。
角蛋白酶还可应用于食品工业，如可使角蛋白降解为氨基酸和短肽，作为营养学药物；用来生产鱼露、肉胨等高营养食品，或作为肉类嫩化剂。在皮毛加工工业中，它可替代普通蛋白酶或与普通蛋白酶配合使用，提高处理效果并降低处理成本。在洗涤剂行业，可用于加酶洗涤剂。在美容保健上，角蛋白酶可溶解皮肤表层皮屑和黑斑，使皮肤柔软、光滑，并能去除头皮屑、软化头发和毛发等。在医药上，角蛋白酶可促使伤口愈合、去痂和上皮再生，是外科手术和皮肤烧伤、创伤的特效药，也是治疗高胱氨酸尿的特效药。
角蛋白酶的研究工作已有几十年的历史，自然界中许多微生物均能分泌角蛋白酶，目前国内外已有多种产角蛋白酶的真菌和细菌得到分离，国内的如曲霉(张道海，生物技术，411-14，1994；罗文等，微生物学通报，20209～212，1993)、链霉菌(涂国全，江西农业大学学报，16399～403，1994；丁正民等，微生物学报，33227～232，1993)等。国外分离到的角蛋白酶产生菌也主要集中在链霉菌和真菌上，如弗氏链霉菌(Noval，J Bacteriol，77251，1959)，真菌Cylindrocarpon、Graphium和Microsporum等(Malviya，Indian J Experiment Biol.30103，1992)。对产生的角蛋白酶也进行了初步的酶学性质研究，但由于这些菌株产生的酶大部分未进行纯化，不能确定这些菌株分解角蛋白的能力是由一种酶实现的还是由包括角蛋白酶在内的混合蛋白酶完成的。
1992年美国Lin等(Appl Environ Microbiol，583271，1992)分离到一株产角蛋白酶的芽孢杆菌PWD-1，并对所产的角蛋白酶进行了分离纯化和酶学性质研究，发现此角蛋白酶无需别的蛋白酶配合就能降解角蛋白，它的分子量约为30kD，最适pH为7.5，比活性为5990U/mg酶蛋白，酶具有自我催化裂解作用，稳定性较差，在室温下的半衰期仅有4～5天。它除了能降解角蛋白外，还可降解多种动植物蛋白。
到目前为止，国内外还未有角蛋白酶的商品化生产和广泛的实际应用，其最主要的原因在于1.天然菌株中角蛋白酶的产量太低，使生产成本高昂，难以商品化生产；2.分离到的角蛋白酶的有效性不够好，作用缓慢，如一般需数天乃至数十天才能将羽毛杆完全水解，限制了它的实际应用。在高效角蛋白酶的筛选和分离上，目前国内外分离到的各种角蛋白酶的有效性均不令人满意，国外也正在尝试通过蛋白质工程来进行分子改造以提高酶的有效性，但还未取得突破。
国内外已意识到基因工程的方法有望大副度提高角蛋白酶的单位产量。近年来国外已进行了尝试，但到目前为止，国外仅分离克隆到了一个角蛋白酶编码基因(Shih，US Patent 5712147，1998；Wo Patent95/33056)，此基因来源于地衣芽孢杆菌PWD-1，结构基因全长1140bp，编码379个氨基酸。1997年成功地将此基因在重组枯草芽孢杆菌中进行了表达，表达的角蛋白酶具有正常的生物学活性，在最高摇床水平上最高的重组子其角蛋白酶表达量比原始菌株提高了3倍(Lin，J IndMicrobiol Biotechnol，19134，1997)，对重组枯草芽孢杆菌的实验室发酵研究表明，角蛋白酶的表达量达到300～500U/mL发酵液(Wang，JInd Microbiol Biotechnol，22608～616，1999)。由于构建的枯草芽孢杆菌基因工程菌株比原始天然菌株单位产量还低，同时此角蛋白酶存在自溶现象，极不稳定，因此还达不到大规模生产的要求。国内虽然开展角蛋白酶研究工作较早，但均集中在菌株分离上，目前还未分离出一个角蛋白酶编码基因，更谈不上构建基因工程高效菌株。
本发明人筛选到一种天然菌株，它所产生的角蛋白酶具有优良的性质。本发明筛选到的角蛋白酶来源于真菌发癣菌Trichophyton sp.95，具有高的比活性。其比活性为7000U/mg，高于国内外报道中的各种角蛋白酶，如来源于Bacillus licheniformis PWD-1的角蛋白酶(6000U/mg)(Applied Environ.Microbio.583271-3275，1992)和来源于链霉菌的角蛋白酶(124.8U/mg)(江西农业大学学报，19(4)60-65)。本发明人筛选分离到的此角蛋白酶同时对α-角蛋白(如羊毛和头发)和β-角蛋白(如羽毛)有高效降解作用，而目前国内外报道的各种来源的角蛋白酶一般只能降解β-角蛋白；此角蛋白酶的最适pH为7.0，有效作用pH值较宽，为4～10，具有很好的热稳定性，在70℃下处理1小时，其酶活性还维持在90％左右，并且酶本身无自我催化裂解作用，优于报道中的各种角蛋白酶。如来源于Bacillus licheniformis PWD-1的角蛋白酶的最适pH值为7.9，耐热性差，且会自我催化裂解(Applied Environ.Microbio.583271-3275，1992)。来源于链霉菌的角蛋白酶有效作用pH值为7～10，在70℃下处理0.5小时，其酶活性只维持在70％左右(江西农业大学学报，19(4)60-65)。
本发明分离克隆到此角蛋白酶的编码基因，它具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，为此基因的改造并在各种外源基因表达系统中高效表达提供优良的基因材料。通过PCR的方法分离克隆了这一角蛋白酶基因kerB，DNA全序列分析结果表明，此角蛋白酶全长1434核苷酸，编码477个氨基酸，与国外唯一克隆到的角蛋白酶基因kerA(来源于Bacilluslicheniformis PWD-1)的氨基酸序列无同源性，是一个新角蛋白酶基因，其氨基酸序列示于SEQ ID NO2。
采用羽毛角蛋白为唯一N源，连续富集培养的方式筛选角蛋白酶产生菌。腐烂羽毛土样样品按常规稀释后接种到筛选培养液(1.5g/LKH2PO4、0.025g/L MgSO4.7H2O、0.025g/L CaCl、0.015g/L FeSO4.7H2O、0.005g/L ZnSO4、0.5g/L羽毛粉，pH6.0)中，30℃培养10～15d，挑取繁殖生长的菌液连续在此培养液中培养3轮，再在筛选培养基平板上涂布分离，挑取单菌落重新接种到筛选培养液中，生长良好的菌株再重复平板分离和液体筛选培养，使菌株纯化。通过此方法筛选到分泌角蛋白酶的菌株24株。
为了进一步证实筛选到的菌株能分泌角蛋白酶，对菌株培养液进行酶活性测定。酶学测定方法与Lin报道的相同(Appl.Environ.Microbiol，583271～3275)。将5mg的叠氮角蛋白加入到0.8mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，加入0.2mL酶稀释液，50℃水浴振荡15分钟，加入0.2mL 10％TCA终止反应，反应液过滤后在450nm处测OD值。对照为先加入酶稀释液和TCA后再加入底物。酶活性定义为酶反应15分钟后OD值增加0.01为1U。通过酶活性测定，挑选有角蛋白酶活性的菌株，其中最高的一株酶活性达到64U/mL培养液，初步鉴定为Trichophyton sp.95，并做为进一步研究的材料。
实验二本实验说明角蛋白酶的纯化程序。
首先进行角蛋白酶的硫酸铵沉淀，菌株在筛选培养基中摇床培养6～7天后，离心取上清酶液，将粗酶液置于冰浴中，边搅拌边缓慢加入硫酸铵至50％饱和度，置冰上2小时，然后13000rpm离心30min，取沉淀，沉淀用0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)重溶，成为浓缩酶液。接着进行离子交换层析纯化，将浓缩酶液上HiTrap_Q_Sepharose_XL(amersham pharmacia biotech预装柱)阴离子柱。加样0.5ml，先用pH8.5、0.02mol/L的Tris-HCl缓冲溶液洗脱平衡柱子，改用相同缓冲液配制的0～1mol/L NaCl梯度洗脱，流速为2ml/min，分部收集，每管1ml。然后对收集管中的溶液测酶活并进行蛋白电泳分析。最后进行凝胶层析分离，将经离子交换柱层析后的检测有酶活的收集样再经一次分子筛Superdex_75_HR_10/30(amersham pharmacia biotech预装柱)，加样0.5ml，用pH5.5醋酸缓冲液洗脱，流速为0.4ml/min，分部收集，每管1ml，得到纯角蛋白酶KERB。
分别测定了以上各步样品的酶活力、蛋白质含量并进行了SDS-PAGE。纯化结果见表1，粗酶液经几步纯化后，比活性从88.4/mg提高到7020.6/mg，纯化倍数为79.4倍。蛋白电泳结果(

图1)表明，纯化后的角蛋白酶成熟蛋白在电泳上为单一条带，分子量约为43kD。
表1角蛋白酶KERB纯化步骤及结果比活性(U/mg)纯化倍数粗酶液 88.41浓缩液 548.1 6.2过离子柱 4172.5 47.2过分子筛 7020.6 79.4注蛋白质浓度用考马斯亮兰法测定实验三本实验说明角蛋白酶的酶学性质的测定方法。
角蛋白酶的最适pH测定方法如下经纯化的角蛋白酶在不同的pH值下进行酶促反应以测定其最适pH。底物角蛋白在不同pH的缓冲液中50℃下进行角蛋白酶活力测定。结果(图2)表明，KERB的最适pH为7.0，在pH4～10的范围内，酶活性均维持在最大酶活性的60％以上。
角蛋白酶的最适温度及热稳定性测定方法如下角蛋白酶的最适温度的测定为在Tris-HCl缓冲液(pH7.0)体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为角蛋白酶在70℃下处理不同时间，再在50℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明，其最适温度为60℃。酶的热稳定性试验表明(图4)，70℃处理30min后，剩余酶活还有95％左右，处理60min后，酶活性依然维持在90％以上。
在pH7.0的Tris-HCl缓冲液中分别加入洗干净的鸡羽毛和人头发，再加入300U的角蛋白酶，50℃下水浴振荡3小时，可观察到羽毛和头发均完全溶解，这说明此角蛋白酶不但能降解β-角蛋白(如羽毛)，还能降解α-角蛋白(头发)。
KERB的普通蛋白酶活性按中华人民共和国行业标准QB/T1803-93进行测定。结果表明，KERB能高效地降解酪蛋白，1U的角蛋白酶活性相当于1.2U的蛋白酶活性。同时，KERB对可溶性的牛血清白蛋白(BSA)、不容性的胶原蛋白等均有降解作用。
对纯化后的KERB成熟蛋白N端进行了氨基酸序列测定，结果表明其N-端的前8个氨基酸序列为A-E-S-T-L-G-A-A。
实验四本实验说明角蛋白酶编码基因kerB的分离克隆程序菌株总DNA的提取采用中性裂解法，菌株培养5天后收集菌体，用液氮冷冻并研磨成粉状，10mg菌体中加入10mL SDS-TE缓冲液(4％SDS、10mmol/LTris、0.1mmol/LEDTA，pH8.0)在室温下裂解5min，用等体积的酚、酚-氯仿、氯仿依次抽提，乙醇沉淀。
根据测定的此角蛋白酶N端氨基酸序列合成简并引物，分别与20个随机引物组对PCR扩增角蛋白酶成熟蛋白的编码序列。含有成熟酶编码序列的PCR片段电泳回收后分别克隆到PGEM-T载体上，进行序列分析。根据序列分析的结果，再合成反向PCR引物，分别与随机引物组对后扩增基因5′端信号肽编码序列。
根据此成熟酶N端氨基酸序列合成简并引物，设计的简并引物为P1 5′GC(C/T/A/G)GA(G/A)AG(T/C)AC(G/A)CT(G/A/T/C)GG 3′另一端的引物采用20个随机引物，分别与引物P1组对，以总DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应参数为94℃变性1min、50℃退火45sec、72℃延伸1min；循环30轮后72℃保温10min。其中仅一组引物扩增到了约1.6kb的PCR片段。根据测定的此蛋白的分子量，推断此酶蛋白的编码基因长度不超过1.4kb，如果此PCR片段为角蛋白酶编码基因，应该包括完整的结构基因3′端。挑取此1.6kb的PCR片段，将它克隆到pGEM-T载体上，进行序列测定。结果表明，在此片段有一个长1359bp的阅读框架，5′端编码的6个氨基酸与氨基酸序列测定结果相一致，初步判断为我们拟克隆的目的基因。
为了克隆酶蛋白N-端的信号肽编码序列，我们根据上述测定的序列结果，设计合成一段反向PCR引物P25′GTTGAACTCACGGCTCGC 3′，同样与随机引物组对，进行PCR扩增，得到一约600bp的PCR片段，将它克隆到pGEM-T质粒上，进行序列分析。
综合这两段序列的结果，得到完整的角蛋白酶的结构编码基因nphy(图5)，此基因全长1434个核苷酸，编码477个氨基酸，根据信号肽序列的结构规则推断，N-端的25个氨基酸为信号肽，信号肽的切割位点在+25位的Gly之后，这一结果与成熟酶的N端氨基酸序列测定结果一致。此角蛋白酶的基因序列与目前唯一报道的角蛋白酶基因kerA(来源于Bacillus licheniformis PWD-1)的氨基酸序列无同源性，是一个新角蛋白酶基因。
序列表<110>中国农业科学院饲料研究所<120>一种高效、广谱角蛋白酶及其基因<130>I2001258<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1434<212>DNA<213>Trichophyton<220><221>CDS<222>(1)..(1431)<223><220><221>sig_peptide<222>(1)..(75)<223><220><221>mat_peptide<222>(76)..()<223><400>1atg ggc tcg tac gcc ctt ccc aga tcc ggt atc cgc cgg aag atc cac 48Met Gly Ser Tyr Ala Leu Pro Arg Ser Gly Ile Arg Arg Lys Ile His-25 -20 -15 -10ggc ctg ctg ctg acg ctg gtc gtc ggc gtc ctc ggc acg gtc acc gca 96Gly Leu Leu Leu Thr Leu Val Val Gly Val Leu Gly Thr Val Thr Ala-5 -1 1 5ctg gtg gcg ccg ccg acc gca cac gcc gcc gag agc acg ctc ggc gcc 144Leu Val Ala Pro Pro Thr Ala His Ala Ala Glu Ser Thr Leu Gly Ala10 15 20gcg gcg gca cag agc ggc cgc tac ttc ggc acc gcc atc gcc tcg ggc 192Ala Ala Ala Gln Ser Gly Arg Tyr Phe Gly Thr Ala Ile Ala Ser Gly25 30 35aag ctg ggc gac tcg gcg tac acg acg atc gcg agc cgt gag ttc aac 240Lys Leu Gly Asp Ser Ala Tyr Thr Thr Ile Ala Ser Arg Glu Phe Asn40 45 50 55atg gtg acg gcc gag aac gag atg aag atc gac gcc acc gaa ccg cag 288Met Val Thr Ala Glu Asn Glu Met Lys Ile Asp Ala Thr Glu Pro Gln60 65 70cgg ggc cag ttc aac ttc tcc gcc ggt gac cgc gtc tac aac tgg gcg 336Arg Gly Gln Phe Asn Phe Ser Ala Gly Asp Arg Val Tyr Asn Trp Ala75 80 85gtg cag aac ggc aag cag gtg cgc ggc cac acc ctg gcc tgg cac tcc 384Val Gln Asn Gly Lys Gln Val Arg Gly His Thr Leu Ala Trp His Ser90 95 100cag cag ccc ggc tgg atg cag agc ctc agc ggc agc aca ctg cgc cag 432Gln Gln Pro Gly Trp Met Gln Ser Leu Ser Gly Ser Thr Leu Arg Gln105 110 115gcg atg atc gac cac atc aac ggc gtg atg ggc cac tac aag ggc aag 480Ala Met Ile Asp His Ile Asn Gly Val Met Gly His Tyr Lys Gly Lys120 125 130 135atc gcc cag tgg gac gtc gtg aac gag gcc ttc tcg gac gac ggt tcg 528Ile Ala Gln Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Phe Ser Asp Asp Gly Ser140 145 150ggc ggc cgc cgg gat tcc aac ctg cag cgc acc ggc aac gac tgg atc 576Gly Gly Arg Arg Asp Ser Asn Leu Gln Arg Thr Gly Asn Asp Trp Ile155 160 165gag gtc gcc ttc cgc acc gcg cgc gcc gcc gac ccg gcg gcc aag ctc 624Glu Val Ala Phe Arg Thr Ala Arg Ala Ala Asp Pro Ala Ala Lys Leu170 175 180tgc tac aac gac tac aac atc gag aac tgg acc tgg gcg aag acc cag 672Cys Tyr Asn Asp Tyr Asn Ile Glu Asn Trp Thr Trp Ala Lys Thr Gln185 190 195ggc gtg tac aac atg gtc cgc gac ttc aag cag cgc ggc gtg ccg atc 720Gly Val Tyr Asn Met Val Arg Asp Phe Lys Gln Arg Gly Val Pro Ile200 205 210 215gac tgc gtc ggc ttc cag tcg cac ttc aac agc ggc agc ccc tac aac 768Asp Cys Val Gly Phe Gln Ser His Phe Asn Ser Gly Ser Pro Tyr Asn
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权利要求
1.一种角蛋白酶，它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2.一种编码权利要求1所述的角蛋白酶的基因。
3.按照权利要求2所述的角蛋白酶的基因，它具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明提供了一种角蛋白酶及其编码基因。此角蛋白酶比活性高、热稳定性好、作用pH范围宽、同时对α－角蛋白和β－角蛋白均有高效降解作用。除了角蛋白酶活性外，还具有普通蛋白酶的特性，可降解动植物来源的多种蛋白质。做为一种新型的酶制剂，可广泛应用于饲料、食品、洗涤、毛纺、制药、化妆品、皮革加工等行业。
文档编号C12N15/57GK1405305SQ0114181
公开日2003年3月26日 申请日期2001年9月19日 优先权日2001年9月19日
发明者姚斌, 王亚茹, 操时树, 史秀云, 袁铁峥, 范云六 申请人:姚斌, 范云六