角质形成细胞衍生的蛋白酶的制作方法

专利名称：角质形成细胞衍生的蛋白酶的制作方法
背景技术：
蛋白酶是消化蛋白质的酶。蛋白酶在其天然细胞环境外具有各种用途。
例如，在洗涤应用中，蛋白酶用作为使污物降解为水溶性更强的简单形式化合物(然后其易于由水和洗涤剂除去)的有机催化剂；即，它们作为“洗涤剂”而起作用。
此外，据报道，一些蛋白酶可以提供某些皮肤调理益处。角质层是表皮的最外层。角质层的细胞(角膜细胞)表示表皮分化过程的末期。角膜细胞是具有高度抗性的无核细胞，其主要由被交联的蛋白质包膜围绕的角蛋白丝组成。一小部分表皮细胞不断离开增殖基底层，并进行分化。因而，角膜细胞不断再生。在所谓的脱皮过程中，这通过皮肤表面的细胞脱落得到平衡，以产生恒定的和充分调节的角质层厚度。角质层的再生和脱皮速率之间的不平衡可能导致在皮肤表面上形成鳞片。在诸如牛皮癣和鱼鳞病的疾病中通常看到这样的症状。人表皮总的周转期是大约四至六周。每一个表皮细胞在角质层中保持大约两周。脱皮涉及浅层中的角质层细胞内聚力的消除。它必定会以不干扰深层的屏障功能的方式发生，其取决于强大的胞间内聚力。据报道，蛋白酶可能有利于脱皮。
蛋白酶的其它已知用途包括用于食品加工，如使肉嫩化、生产乳酪以及调味；织物加工，如除去羊毛表面的“鳞状物”以防止织物收缩；和用于除去照相胶片表面的明胶。
遗憾的是，这些已知蛋白酶的用途因它们能在敏感个体中造成过敏反应而受到限制，和/或因它们在各种环境中的功效有限而受到限制。这样的过敏反应是由敏感用户使用蛋白酶，如使用护肤产品造成的。另一方面，过敏反应可以发生于制造或包装包含蛋白酶的产品(如洗衣用洗涤剂)而与蛋白酶密切接触的个体之中。
基于以上所述，需要一种替代蛋白酶，该蛋白酶只有很少的免疫原性和/或者可以提供较高的蛋白分解特性。也需要包含这样一种蛋白酶的组合物，如护肤和/或者洗衣用洗涤剂组合物。
发明概述本发明涉及分离的多肽，该多肽实质上包含SEQ ID NO2所显示的氨基酸序列，或者实质上类似于由具有保藏号FERM BP-6129的所有鉴定特征的质粒中的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
本发明还涉及分离的多肽，该多肽实质上包含SEQ ID NO1所显示的氨基酸序列，或者实质上类似于由包含具有保藏号FERM BP-6129的所有鉴定特征的质粒中的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
本发明还涉及包含上述多核苷酸的表达系统。
本发明还涉及包含上述多肽的组合物。
本发明还涉及治疗或防止脱皮的方法，该方法包括局部施用包含上述多肽的组合物。
本发明还涉及特异地结合上述多肽的抗体。
对本领域技术人员来说，通过阅读本发明的说明书，本发明的这些和其它特征、方面以及优点将变得明显。
发明详述虽然说明书后附的权利要求特别指出和清楚要求了本发明，但可以相信读者将通过下列描述而对本发明有更好的了解。
所有引用的参考文献以其整体与本文一并参考。任何参考文献的引用不是对关于它作为现有技术可为本发明所利用的任何确定的承认。
除非以其它方式特别说明，否则所有百分比都是相对于整个组合物重量而言的。
除非以其它方式特别说明，否则所有比率都是重量比。
在这里，“包括”意指可以加入的不影响最终结果的其它步骤和其它组分。这一术语包括术语“由…组成”和“基本上由…组成”。
在这里，“分离的”(关于本发明多肽或者编码该多肽的多核苷酸)意指多肽或者多核苷酸在复杂的细胞环境中自然产生并在该环境之外存在，同时该多肽当可操作地与适当的调节序列连接时可由并不自然表达它的细胞中的多核苷酸表达。具体地说，当应用于多核苷酸(例如DNA)时，就DNA在其中自然产生的复杂的细胞环境而言，“分离的”意指DNA实质上得到分离(即实质上存在于该环境之外)，或者它仅仅存在于其自然产生(例如当克隆或以限制片段形式存在时)的不同核酸背景中。因此，本发明的多核苷酸或多肽可以存在于各种载体和/或各种宿主细胞(或其它环境，如缓冲液、病毒或者细胞提取物)和/或任何种类的组合物中；目前它们仍然在这里所用的意义上来分离，其中这样的载体、宿主细胞或组合物不是多核苷酸或者多肽的天然环境的一部分。
在这里，“KDP”意指角质形成细胞衍生的蛋白酶。
在这里，“实质上如…所显示的”或“实质上类似于”，就多核苷酸来说，意指在编码所需的多肽或基因产物的结构或核苷酸序列上是相同或足够类似的；或者就多肽来说，意指在起主要作用的结构或氨基酸序列上是相同或足够类似的。换句话说，一具体的主题序列(氨基酸或核苷酸序列)，例如由诱变改变的序列，通过一或多个置换、缺失或增加而不同于参考序列，其净效应在于保持参考多肽的生物活性。另外，如果核苷酸序列因其在遗传密码中的简并性而编码实质上类似于参考氨基酸序列的氨基酸序列，那么核苷酸序列及其类似物“实质上类似于”这里所公开的特异性核苷酸序列。此外，“实质上类似”意指多肽将与针对本发明的多肽或得自本发明多肽的肽而产生的抗体进行反应。
本发明涉及新近鉴定的多核苷酸，由这样的多核苷酸编码的多肽，这样的多核苷酸和多肽的用途，这样的多核苷酸和多肽的生产，以及包括这样的多肽的组合物。
本发明的一个实施方案包含在DH10B(pBSIISK(+)-KDP1)，一种携带包含编码KDP多肽的DNA的质粒的大肠杆菌菌株中。这一材料于1997年9月30日保藏在工业科学和技术的生物科学和人类技术研究所(1-3，Higashi 1 chome Tsukuba-shi lbaraki-ken 305，日本)。所保藏的菌株的保藏号为FERM BP-6129。
这里所指的生物保藏物将按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的有关条文来保存。因此，该保藏物可按照此专利申请或其子申请所在国家的专利法的要求获得。然而，申请人对保藏机构发放保藏物样品的许可并不意味或暗示许可实施在对主题专利申请颁发的任何专利或任何其它专利中所要求的发明。提供保藏物仅仅为方便本领域技术人员，而并不是承认实施本发明必须有该保藏材料。在与本文序列的任何描述发生任何冲突的情况下，包含在保藏材料中的多核苷酸的核苷酸序列，以及由此编码的多肽的氨基酸序列与本文一并参考。需要注意的是本领域一般技术人员在由此书面公开部分再现申请人的工作时，利用常规技术可以发现任何这样的测序冲突。
A.多肽本发明的一个方面涉及分离的多肽，该多肽包含实质上显示在SEQID NO2中的氨基酸序列，或者实质上类似于保藏号FERM BP-6129(下文统称为“KDP多肽”)的氨基酸序列。
在这里，“多肽”是指由共同连接而形成肽键(优选形成“前原蛋白质”、前蛋白质、蛋白质或其片段)的氨基酸组成的聚合物。这里的“前原蛋白质”意指由信号序列、前区和成熟区组成的多肽；而“前蛋白质”则意指由前区和成熟区组成的多肽。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或者合成多肽。
在这里，“保藏号FERM BP-6129的氨基酸序列”意指由具有核苷酸序列的多核苷酸所编码的氨基酸序列，该核苷酸序列实质上类似于包含在具有保藏号FERM BP-6129的所有鉴定特征的质粒中的核苷酸序列。
KDP多肽的各种实施方案包括，但不限于，具有如下所示的氨基酸序列或片段的多肽SEQ ID NO2；以及SEQ ID NO2的1-227位置。附加的实施方案包括这样的多肽，该多肽包含SEQ ID NO2的”催化三联体”，即39-43、86-88和177-185位置；更优选包含39-185位置。
在本发明的另一实施方案中，KDP多肽是与SEQ ID NO2所显示的氨基酸序列(如SEQ ID NO2中所显示的上述子序列)或保藏号FERMBP-6129的氨基酸序列有至少大约60％；优选为至少大约75％；更优选为至少大约90％；更优选为至少大约95％；更优选为至少大约99％同源性的氨基酸序列。优选地，这样的同源序列形成这样的多肽，该多肽实质上与具有SEQ ID NO2中所显示的氨基酸序列(如SEQ ID NO2中所显示的上述子序列)或者保藏号FERM BP-6129的氨基酸序列的多肽有相同的蛋白水解活性。
正如以下更详细讨论的，KDP多肽可以是自然纯化的产物，或化学合成过程的产物，或用重组技术由重组宿主产生的产物。KDP多肽可以是糖基化或非糖基化的，这取决于用于重组生产方法中的宿主。KDP多肽也可以包括起始甲硫氨酸的氨基酸残基。
B.多核苷酸本发明的一个方面涉及分离的多核苷酸，该多核苷酸包含实质上显示在SEQ ID NO1中的核苷酸序列，其实质上类似于包含在具有保藏号FERM BP-6129的所有鉴定特征的质粒中的核苷酸序列，或者其编码KDP多核苷酸(下文将其统称为KDP多肽)。
在这里，“多核苷酸”意指DNA或RNA的聚合物，该DNA或RNA可以是单或双链的，可选择地包含合成的、非天然的或者改变的核苷酸碱基，该碱基能够掺入DNA或RNA聚合物中。多核苷酸可以是分离片段形式的，或作为大核苷酸序列构建物的组分，该多核苷酸衍生于以一定的数量或者浓度分离至少一次的核苷酸序列，该数量或者浓度使利用标准生化方法(例如利用克隆载体)能够进行该序列及其组分核苷酸序列的鉴定、操作和回收。这样的序列优选以未被内部非翻译序列(内含子)所间断的开放读框形式提供，其中的内部非翻译序列典型地存在于真核基因(例如cDNA)中。也能利用包含有关序列的基因组DNA。非翻译核苷酸的序列可以存在于开放读框的5′或3′端，其中相同的非翻译核苷酸序列不干扰编码区的操作或者表达。本发明提供的编码多肽的多核苷酸可以自cDNA片段和短的寡核苷酸接头或者一系列寡核苷酸装配，以提供能够在重组体转录单位中表达的合成基因。
本发明的多核苷酸包含具有任一只要能编码KDP多肽的序列的核苷酸序列。由于在遗传密码中的简并性，任何特定的氨基酸序列可以由许多不同的核苷酸序列编码。熟练技术人员将领会到遗传密码的简并性考虑到不同的核苷酸序列以提供相同的多肽。在制备核苷酸序列(其编码相同的肽但不同于天然的核苷酸序列)的某些情况下，提供各种优点，其包括易于测序或合成，增加肽的表达，和/或优先选择用于某些密码子的某些异源宿主。这些实际考虑都是为大家所熟知的，并且能够提供有利于本发明的用户的实施方案。因此，我们将清楚地推断出天然核苷酸序列或列在序列表中的或与本文一并参考的核苷酸序列不是唯一的实施方案或由本发明设想的核苷酸序列。
KDP多核苷酸的各种实施方案包括，但不限于，显示在下列序列或片段中的核苷酸序列SEQ ID NO1；以及SEQ ID NO1的291-1172位置，SEQ ID NO1的536-1172位置，SEQ ID NO1的1-1172位置，或SEQ ID NO1的291-1499位置。KDP多核苷酸的附加实施方案包括这样的核苷酸序列，该核苷酸序列编码SEQ ID NO2的“催化三联体”，即编码SEQ ID NO2的多肽的39-43、86-88和177-185位置。也就是说，这样的实施方案包括SEQ ID NO1的603-617、744-752和1017-1043位置；更优选为这样的实施方案包括SEQ ID NO1的603--1043位置。
在本发明的另一实施方案中，KDP多核苷酸是这样的核苷酸序列，该核苷酸序列与显示在SEQ ID NO1中的、显示在SEQ ID NO1的上述子序列中的或者包含在具有保藏号FERM BP-6129的所有鉴定特征的质粒中的核苷酸序列有至少大约60％同源性；优选为至少大约75％同源性；更优选为至少大约90％同源性；更优选为至少大约95％同源性；更优选为至少大约99％同源性。优选地，这样的同源序列能够编码KDP多肽。
C.表达系统本发明的另一个方面涉及包括KDP多核苷酸的表达系统。这样的表达系统包括包含KDP多核苷酸的重组表达载体，以及利用这样的重组表达载体由遗传工程产生的宿主(“重组宿主”)。
1.载体在这里，“重组表达载体”意指用来表达多核苷酸的DNA构建体，该多核苷酸编码所需多肽(例如KDP多肽)，并包括包含下列组分之集群的转录亚单位1)在基因表达中具有调节作用的遗传因子，例如启动子和增强子，2)转录成mRNA且翻译成蛋白质的结构或编码序列，和3)合适的转录和翻译起始和终止序列。利用本领域熟知的方法，可以构建本发明的重组表达载体。载体的性质不是本发明的关键，并且可以利用任何载体，包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。用于本发明中的可能的载体包括，但不限于，染色体的、非染色体的以及合成的DNA序列，例如SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；得自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，病毒DNA(如牛痘、腺病毒、家禽痘病毒和假狂犬病)。其它的有用载体包括，但不限于对于哺乳动物细胞来说，有pcDNA-1(Invitrogen，San Diego，CA)和pSV-SPORT 1(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)；对于昆虫细胞来说，有pBlueBac III或者pBlueBacHis杆状病毒载体(Invitrogen，SanDiego，CA)；和对于细菌细胞来说，为pET-3(Novagen，Madison，WI)。也可以利用任何其它载体，只要它能在宿主中复制和生存。KDP多核苷酸可以存在于可操作地与调节元件连接的载体中。
可以利用各种各样方法将KDP多核苷酸插入到载体中。一般地，利用本领域所熟知的方法可以将多核苷酸插入到适当的限制性内切酶酶切位点中。一般认为这样的和其它的方法在本领域技术人员所熟知的范围之内。
载体可以优选包括表达元件或可操作地与KDP多核苷酸连接的元件，以提供合适水平的表达。可以利用任何种类的表达元件。一个或多个表达元件可以例如选自启动子、增强子、核糖体结合位点、操纵子和激活序列。这样的表达元件可以是可调节的，例如可诱导的(通过加入诱导物)。有用的启动子的代表性例子包括，但不限于LTR(得自逆转录病毒的长末端重复序列)或者SV40启动子、大肠杆菌lac或trp启动子、噬菌体λPL启动子和其它启动子(已知其控制在原核或真核细胞或它们的病毒中的基因表达)。表达载体也优选包含翻译起始和转录终止子的核糖体结合位点。表达载体也可以包括扩增表达的适当序列。
在优选的实施方案中，表达载体还包含一或多个可选择的标记基因以提供用于选择转化的宿主细胞的表型特征，如用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性或者如用于原核细胞培养物的四环素或氨苄青霉素抗性。
通过将具有合适的翻译起始和终止信号的KDP多核苷酸体插入至具有功能启动子的可操作读框中，可以构建在细菌用途中有用的表达载体。载体将优选包含一或多个表型的选择性标记和复制起点，以确保载体的维持和(如果需要)提供在宿主体内的扩增。
作为一个代表性而非限制性的例子，在细菌用途方面有用的表达载体可以包括选择性标记和细菌复制起点，该细菌复制起点得自包含熟知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的遗传因子的市售质粒。这样的商业载体包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，瑞典)和pGEM1(Promega Biotec，Madison，威斯康星，美国)。这些pBR322“主链”区段与适当的启动子和所要表达的KDP多肽结合。其它合适的细菌载体包括pQE70，pQE60和pQE9(Qiagen)；pbs，pD10，phagescript，psiXl74，pBluescript SK，pbsks，pNH8A，pNH16a，pNH18A和pNH47A(Stratagene)；以及ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540和pRIT5(Pharmacia)。
在利用酵母方面有用的表达载体可以包括酵母复制起点或整合入宿主染色体DNA中所需要的DNA片段，选择性标记，合适的启动子和增强子，以及任一必需的核糖体结合位点，聚腺苷酸化位点，转录终止序列和5′侧翼非转录序列。合适的酵母表达载体包括，但不限于，pPIC3，pPIC3K，pPIC3.5K，pPIC9，pPIC9K，pAO815，pHIL-D2，pHIL-S1，pPICZaA，pPICZaB和pPICZaC(Invitrogen)(优选用于巴斯德毕赤酵母)；pYES2(Invitrogen)，和pRS系列载体(STRATAGENE)(优选用于酿酒酵母)。
哺乳动物表达载体将优选包括复制起点，合适的启动子和增强子，和任何必需的核糖体结合位点，聚腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列，和5′侧翼非转录序列。得自SV40剪接和聚腺苷酸化位点的DNA序列可以用来提供必需的非转录遗传因子。
合适的哺乳动物载体，就其非限制例子来说，包括pWLNEO，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)；pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。
2.宿主可以利用包含KDP多核苷酸以及适当的启动子或控制序列的重组表达载体来转化适当的宿主，从而使重组宿主能够表达KDP多肽。
重组宿主可以包括用本发明的重组表达载体转化的细菌，真菌，昆虫，植物或哺乳动物细胞。重组宿主也可以包括用重组表达载体转化的整个植物，昆虫或非人哺乳动物。用于体外生产的适当的宿主的代表性例子包括细菌细胞，如大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，枯草杆菌和属于假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的各种物种，然而也可以使用其它宿主作为选择的物质；酵母或真菌细胞，如巴斯德毕赤酵母，博伊丁假丝酵母和酿酒酵母；昆虫细胞，如果蝇属和Sf9；动物细胞，如猴子肾成纤维细胞的COS-7细胞系(由Gluzman，细胞，23175(1981)描述)，C127(小鼠)，3T3(小鼠)，CHO(仓鼠)和BHK(仓鼠)；人细胞，如HeLa。另外，在非人哺乳动物体内生产中有用的重组宿主包括，但不限于，母牛，山羊，豚鼠，仓鼠，小鼠，猪，兔和绵羊；昆虫(包括蚕幼虫)；和植物。一般认为根据本文的教导对适当宿主的选择在本领域的技术人员已知的范围之内。
在这里，“转化”意指将DNA引入细胞或有机体中，以便DNA或作为染色体外元件或通过染色体整合体复制。取决于所用的宿主细胞，利用适于这样的细胞的标准技术完成转化。描述在有关文献(Cohen，S.N.，PROC.NATL.ACAD.Sci.(USA)，692110(1972)；Mandel等，生物化学杂志(J.MOL.BIOL.)，53154(1970)；和Lilgestrom等，基因，40241-246(1985))中的、使用氯化钙的钙处理技术一般用于原核生物或其它包含坚固的细胞壁屏障的细胞。对于没有这样的细胞壁的哺乳动物细胞，Graham和van der Eb(病毒学，52456-457(1978))的磷酸钙沉淀方法是优选的。哺乳动物细胞宿主系统转化的一般内容已经由Axel描述在美国专利4,399,216(1983年8月16日授权)中。典型地，按照van Solingen等，J.BACT.，130946(1977)和Hsiao等，PROC.NATL.ACAD.Sci.(USA)，763829(1979)的方法，实现向酵母的转化。另外，通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或者在《分子生物学基本方法》(D.L.Davis和I.M.Battey，(1986))中提出的电穿孔法可以将表达载体引入宿主中。然而，也可以利用将DNA引入细胞的其它方法，如通过核注射或原生质体融合。
D.生产KDP多肽的方法本发明的一个方面涉及生产分离的KDP多肽的方法。该方法包括把KDP多核苷酸插入到合适的重组表达载体(如上所述)中，和然后用这一重组表达载体(如上所述)转化合适的宿主。其后，所转化的宿主用来表达KDP多肽，随后自宿主中纯化出所产生的KDP多肽。
在一优选的实施方案中，该方法包括培养用包含KDP多核苷酸的重组表达载体转化的酵母宿主细胞。其后用培养的细菌宿主细胞来表达KDP多肽，随后自培养基中纯化所产生的KDP多肽。
继转化合适的宿主菌株和宿主菌株生长至适当的细胞密度之后，用适当的方法(例如变温或者化学诱导)诱导所选择的启动子，并将细胞再培养一段时间。典型地，由离心收获细胞，用物理或者化学方法破碎细胞，并保留所产生的粗提物以便进一步纯化。
可以用任何便利方法破碎用于KDP多肽的表达的微生物细胞，包括冻结-解冻循环，超声处理，机械破碎，或者利用细胞溶解剂；这样的方法对本领域技术人员来说是熟知的。
可以利用包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽提、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱在内的各种方法，自重组细胞培养物中回收和纯化KDP多肽。如果必要，在完成成熟蛋白质构型的过程中，可以利用蛋白质重折叠步骤。最后，可以利用高效液态色谱(HPLC)作为最后的纯化步骤。
在可选择的实施方案中，KDP多肽可以由常规肽合成仪合成。
E.抗体本发明的另一方面涉及特异地结合多肽的抗体，该多肽包含实质上显示在SEQ ID NO2中的氨基酸序列，或实质上类似于保藏号FERMBP-6129的氨基酸序列(这里称为“KDP抗体”)。
可以利用多肽、它们的片段或其它衍生物、或其类似物或表达它们的细胞作为免疫原，由此产生抗体。例如，这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体。本发明也包括嵌合、单链和人源化抗体，以及Fab片段或Fab表达文库的产物。可以利用本领域已知的各种方法来生产这样的抗体和片段。
通过向动物直接注射本发明的多肽或者通过施用多肽于动物(优选为非人)身上，可以获得KDP抗体。然后所获得的抗体将与多肽本身结合。按照这一方法，即使只编码多肽的片段的序列也可以用来产生结合完整天然多肽的抗体。然后可以利用这样的KDP抗体使KDP多肽从表达该KDP多肽的组织中分离出来。
对于单克隆抗体的制备，可以利用任一提供由连续细胞系培养产生的抗体的技术。例子包括杂交瘤技术(Kohler和Milstein，自然，256495-497(1975))、trioma技术，人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等，今日免疫学，472(1983)和产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等，单克隆抗体和癌治疗，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96(1985))。
产生单链抗体的技术(美国专利4,946,778)可适用于产生抗本发明的免疫原性多肽产物的单链抗体。
F.包合多肽的组合物本发明的另一方面涉及包含KDP多肽和可接受的载体的组合物。组合物可以是需要蛋白酶组分的任何种类的组合物。尤其优选的是能与人接触(例如通过使用或者制造)的组合物。一般认为，通过使用本发明的KDP多肽，可以减少或消除免疫原性反应，而使用者和/或处理者使用包含已知蛋白酶，尤其是非人源的蛋白酶的类似组合物时也可能经历这种免疫原性反应。优选的组合物是护肤组合物和洗衣用洗涤剂组合物。
在这里，“可接受的载体”包括，但不限于，化妆上可接受的载体、药学上可接受的载体和在清洁组合物用途中可接受的载体。
1.护肤组合物除KDP多肽之外，本发明的护肤组合物还优选包括化妆上或药学上可接受的载体。
在这里，“化妆上可接受的载体”意指一或多种相容的固体或液体填充稀释剂或胶囊化物质，这些物质适于用来与人和低等动物的皮肤接触而无过分的毒性、不相容性、不稳定性、刺激性、变应性反应等等，具有合理的效益/风险比。
在这里，“药学上可接受的”意指一或多种相容的药物、药物成分或惰性成分，这些物质适于用来与人和低等动物的皮肤接触而无过分的毒性、不相容性、不稳定性、刺激性、变应性反应等等，具有合理的效益/风险比。当然，药学上可接受的载体必须具有足够高的纯度和足够低的毒性，以使它们适于施用到需要接受治疗的哺乳动物身上。
在这里，“相容的”意指化妆组合物或药物组合物的组分能够与KDP多肽，并且相互之间以无任何相互作用(该作用实质上会减少组合物在普通使用情况下的化妆或药物功效)的方式混合。
优选地，本发明的护肤组合物是局部施用组合物，即通过将组合物直接施于或涂布于皮肤上而局部施用它们。优选地，这样的局部施用组合物包括化妆上或者药物上可接受的局部载体。
局部施用组合物可以制成各种类型的产品。这些类型包括，但不限于，水剂、乳膏、海滩防晒油、凝胶、棒形物、喷雾剂、软膏、糊状物、摩丝和化妆品；护发组合物，如香波和调理剂(例如用于治疗/预防头皮屑)；和个人清洁组合物。这些产品类型可以包括几个载体系统，这些载体系统包括，但不限于，溶液、乳剂、凝胶和固体。
优选地，载体是化妆上或药物上可接受的含水或有机溶剂。水是优选的溶剂。合适的有机溶剂的例子包括丙二醇，聚乙二醇(200-600)，聚丙二醇(425-2025)，丙二醇-14丁基醚，甘油，1，2，4-丁三醇，山梨醇酯，1，2，6-己三醇，乙醇，异丙醇，丁二醇及其混合物。在本发明中有用的这样的溶液优选包含大约0.001％至大约25％的KDP多肽，更优选从大约0.1％至大约10％；更为优选从大约0.5％至大约5％；和优选为大约50％至大约99.99％的可接受的含水或有机溶剂，更为优选为大约90％至大约99％。
本发明的护肤组合物还可以包括可便利地用于局部施用组合物中的各种附加的油溶性材料和/或水溶性材料，其含量已被本领域所确立。这样的附加组分包括，但不限于增稠剂、颜料、香味剂、湿润剂、蛋白质和多肽、防腐剂、遮光剂、渗透增强剂、胶原、透明质酸、弹性蛋白、水解液、樱草油、西蒙得木油、表皮生长因子、大豆皂甙、粘多糖、维生素A及其衍生物、维生素B2、生物素、泛酸、维生素D及其混合物。
2.清洁组合物除KDP多肽之外，本发明的清洁组合物优选包括表面活性剂。清洁组合物可以具有各种形式，其包括，但不限于，硬表面清洁组合物、餐具清洁组合物和洗衣用洗涤剂组合物。
优选的清洁组合物是洗衣用洗涤剂组合物。这样的洗衣用洗涤剂组合物包括，但不限于，粒状、液态和块状组合物。优选地，洗衣用洗涤剂组合物还包括助洗剂。
本发明的洗衣用洗涤剂组合物包含KDP多肽，其含量为足以提供“清洁有效量”的水平。术语“清洁有效量”意指任一能够对底物(如织物、餐具等等)产生清洁、去污、除尘、漂白、除臭和鲜艳度改善作用的量。从目前的商业制剂的实际方面看，以重量计的每克洗涤剂组合物的活性酶的典型量高达大约5mg，更典型为0.01mg-3mg。也就是说，本文的洗衣用洗涤剂组合物典型地将包括0.001％至5％、优选为0.01％-3％、更优选为0.01％至1％以重量计的粗KDP多肽制剂。在这里，“粗KDP多肽制剂”意指其中KDP多肽在其加入至洗衣用洗涤剂组合物中之前包含在其中的制剂或组合物。优选地，KDP多肽存在于这样的粗KDP多肽制剂中，其含量为每克粗KDP多肽制剂足以提供0.005至0.1个Anson单位(AU)的活性。对于某些洗涤剂，如用于自动洗碟机中的，可能需要增加粗KDP多肽制剂中的活性KDP多肽的含量以便最大限度地减少非催化活性物的总量，进而改善去斑/成膜或其它的最后结果。在高度浓缩的洗涤剂配方中也可能需要更高的活性物含量。
优选地，包括但不限于液态组合物的本发明的洗衣用洗涤剂组合物，可以包含大约0.001％至大约10％、优选为大约0.005％至大约8％、最优选为大约0.01％至大约6％的以重量计的酶稳定体系。酶稳定体系可以是与KDP多肽相容的任何稳定体系，或者是可以包含在组合物中的任何其它附加的去污酶。这样的体系可以由其它配方活性物内在地提供，或者例如由配方设计师或洗涤剂可用酶的制造厂商来单独地加入。例如，这样的稳定体系可以包括钙离子、硼酸、丙二醇、短链羧酸、二羟基甲硼烷及其混合物，并且可以根据洗涤剂组合物的类型和外形来设计以解决不同的稳定化问题。
洗涤剂组合物也包括去污表面活性剂。优选地，洗涤剂组合物包括至少大约0.01％的去污表面活性剂；更优选为至少大约0.1％；更为优选为至少大约1％；更更优选为大约1％至大约55％。
优选的去污表面活性剂是阳离子、阴离子、非离子、两性离子、兼性离子表面活性剂及其混合物，其进一步描述如下。在洗涤剂组合物方面有用的去污表面活性剂的非限定性例子包括常规的C11-C18烷基苯磺酸盐(“LAS”)和一级支链和随机C10-C20烷基硫酸盐(“AS”)，式CH3(CH2)X(CHOSO3-M+)CH3和CH3(CH2)Y(CHOSO3-M+)CH2CH3的C10-C18二级(2，3)烷基硫酸盐(其中x和(y+1)是至少为大约7的整数，优选为至少大约9，且M是水增溶阳离子，尤其是钠)，不饱和硫酸盐(如油基硫酸盐)，C10-C18烷基烷氧基硫酸盐(“AExS”；尤其是EO 1-7乙氧基硫酸盐)，C10-C18烷基烷氧基羧酸盐(尤其是EO 1-5乙氧基羧酸盐)，C10-C18甘油醚，C10-C18烷基多糖苷及其对应的硫酸化多糖苷，以及C12-C18α-磺化脂肪酸酯。如果需要，在总组合物中也可以包括常规非离子和兼性表面活性剂，如C12-C18烷基乙氧基化物(“AE”)，包括所谓的窄峰烷基乙氧基化物和C6-C12烷基酚烷氧基化物(尤其是乙氧基化物和混合的乙氧基/丙氧基)，C12-C18甜菜碱以及磺基甜菜碱，C10-C18胺氧化物等。也可以使用C10-C18N-烷基多羟基脂肪酸酰胺。典型的例子包括C12-C18N-甲基葡糖酰胺。参见WO 9,206,154。其它的糖衍生的表面活性剂包括N-烷氧基多羟基脂肪酸酰胺，如C10-C18N-(3-甲氧基丙基)葡糖酰胺。N-丙基到N-己基C12-C18葡糖酰胺可以用于产生低泡沫。也可以使用C10-C20常规皂类。如果需要产生高泡沫，可以使用支链C10-C16皂类。阴离子和非离子表面活性剂的混合物是尤其有用的。有用的其它常规表面活性剂列在权威教科书中。
洗涤剂助剂也包括在洗衣用洗涤剂组合物中，以有助于控制矿物硬度。可以使用无机和有机助洗剂。助洗剂典型地用于织物洗涤组合物中，以有助于除去颗粒状污垢。
助洗剂的含量可以广泛地变化，这取决于组合物的最终用途及其所需的外形。当存在助洗剂时，组合物典型地包括至少大约1％的助洗剂。液态配方典型地包括大约5％至大约50％、更典型地为大约5％至大约30％的以重量计的洗涤剂助剂。粒状配方典型地包括大约10％至大约80％、更典型为大约15％至大约50％的以重量计的洗涤剂助剂。然而，并非意味着将更低或更高含量的助洗剂排除在外。
无机或含P的洗涤剂助剂包括，但不限于，多磷酸的碱金属、铵和链烷醇铵盐(例如三多磷酸盐、焦磷酸盐和玻璃状聚合偏磷酸盐)，膦酸盐，植酸，硅酸盐，碳酸盐(包括重碳酸盐和倍半碳酸盐)，硫酸盐和硅铝酸盐。然而，在一些情况下需要非磷酸盐助洗剂。重要的是，本文的组合物起着相当惊人的作用，即使存在所谓的“弱”助洗剂(与磷酸盐比较)(如柠檬酸盐)时，或在所谓的“加助剂不足”情况下(可发生于使用沸石或层状硅酸盐助洗剂时)。
硅酸盐助洗剂的例子是碱金属硅酸盐，特别是那些SiO2∶Na2O比值范围为1.6∶1至3.2∶1的层状硅酸盐，如描述在美国专利4,664,839(1987年5月12日授予H.P.Rieck)中的层状硅酸钠。NaSKS-6是由Hoechst推向市场的结晶性层状硅酸盐的商标(本文一般简写为“SKS-6”)。不同于沸石助洗剂，Na SKS-6硅酸盐助洗剂不包含铝。Na SKS-6具有δ-Na2SiO5形态学形式的层状硅酸盐。它可以用如下文献描述的方法制备德国DE-A-3,417,649和DE-A-3,742,043。SKS-6是用于本文的特别优选的层状硅酸盐，但是这里也可以使用其它这样的层状硅酸盐，如那些具有通式NaMSixO2x+1·yH2O(其中M是钠或氢，X是1.9至4的数，优选为2，并且Y是0至20的数，优选为0)的层状硅酸盐。得自Hoechst的各种其它的层状硅酸盐包括作为α、β和γ形式的NaSKS-5、NaSKS-7、NaSKS-11。正如以上所提到的，δ-Na2SiO5(NaSKS-6形式)是最优选用于本文的。其它硅酸盐也可以用于本文，例如硅酸镁，其在粒状配方中可以用作为增脆剂，在氧化漂白中用作为稳定剂，以及用作为泡沫控制体系的组分。
碳酸盐助洗剂的例子是碱土和碱金属碳酸盐，其公开在1973年11月15日公开的德国专利申请2,321,001中。
硅铝酸盐助洗剂在本发明中是有用的。硅铝酸盐助洗剂在大多数目前市售的高效型粒状洗涤剂组合物中是十分重要的，并且也可以是液态洗涤剂配方中重要的助洗剂组分。硅铝酸盐助洗剂包括那些具有下列经验式的助洗剂Mz(zAlO2)Y]·xH2O其中Z和Y是至少6的整数，Z与Y的摩尔比为1.0至大约0.5，X是大约15至大约264的整数。
有用的硅铝酸盐离子交换材料是市售的。这些硅铝酸盐在结构上可以是结晶性的或无定形的，并且可以是天然产生的或人工合成的硅铝酸盐。用于生产硅铝酸盐离子交换材料的方法公开在美国专利3,985,669(1976年10月12日授予Krummel等人)中。这里所用的优选的合成结晶性硅铝酸盐离子交换材料可以沸石A、沸石P(B)、沸石MAP和沸石X的名称获得。在特别优选的实施方案中，结晶性硅铝酸盐离子交换材料具有下式Na12[(AlO2)12(SiO2)12]·xH2O其中X为大约20至大约30，尤其为大约27。这种材料被称为沸石A。脱水沸石(X＝0-10)也可以用于本文。优选地，硅铝酸盐具有大约0.1-10微米直径的粒度。
适于本发明目的的有机洗涤剂助剂包括，但不限于，各种多羧酸盐化合物。如本文所用的，“多羧酸盐”意指具有多个羧酸盐基团的化合物，优选为至少3个羧酸盐基团。一般可以以酸形式将多羧酸盐助洗剂加入组合物中，但是也可以以中性盐形式加入。当以盐形式利用时，碱金属(如钠、钾和锂)或链烷醇铵盐是优选的。
在多羧酸盐助洗剂中包括各种类型的有用材料。多羧酸盐助洗剂的一个重要种类包括醚多羧酸盐，其包括公开在下列文献中的氧丁二酸氢盐美国专利3,128,287(1964年4月7日授予Berg)和美国专利3,635,830(1972年1月18日授予Lamberti)。也参见美国专利4,663,071(1987年5月5日授予Bush等人)的“TMS/TDS”助洗剂。合适的醚多羧酸盐也包括环状化合物，尤其是脂环化合物，如那些在下列文献中描述的化合物美国专利3,923,679(1975年12月2日授予Rapko)；3,835,163(1974年9月10日授予Rapko)；4,158,635(1979年6月19日授予Crutchfield等人)；4,120,874(1978年10月17日授予Crutchfield等人)；和4,102,903(1978年7月25日授予Crutchfield等人)。
其它有用的洗涤剂助剂包括醚羟基多羧酸盐，马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚的共聚物，1，3，5-三羟基苯-2，4，6-三磺酸，和羧甲基氧琥珀酸，多乙酸(如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸)的各种碱金属，铵和取代铵盐，以及多羧酸盐(如苯六羧酸，琥珀酸，氧联二琥珀酸，多马来酸，苯1，3，5-三羧酸，羧基甲基氧琥珀酸和其可溶性盐)。
柠檬酸盐助洗剂，例如柠檬酸及其可溶性盐(尤其是钠盐)，对高效型液态洗涤剂配方来说是特别重要的多羧酸盐助洗剂，因为它们可得自可再生资源并且是可生物降解的。柠檬酸盐也可以用于粒状组合物中，尤其是与沸石和/或层状硅酸盐助洗剂结合起来使用。氧丁二酸氢盐在这样的组合物和结合物中是尤其有用的。
也适用于本发明的洗涤剂组合物中的物质是3，3-二羧基-4-氧杂-1，6-己二酸盐和相关化合物(公开在1986年1月28日授予Bush的美国专利4,566,984中)。有用的琥珀酸助洗剂包括C5-C20烷基和链烯基琥珀酸及其盐。这一类型的特别优选的化合物是十二碳烯基琥珀酸。琥珀酸盐助洗剂的具体例子包括月桂基琥珀酸盐，十四烷基琥珀酸盐，十六烷基琥珀酸盐，2-十二碳烯基琥珀酸盐(优选的)，2-十五碳烯基琥珀酸盐等等。月桂基琥珀酸盐是这一组的优选助洗剂，并且被描述在Barrat等的欧洲专利申请200,263(1986年11月5日公开)中。
其它合适的多羧酸盐公开在美国专利4,144,226(1979年3月13日授予Crutchfield等人)和美国专利3,308,067(1967年3月7日授予Diehl)。也参见美国专利3,723,322(1973年3月27日授予Diehl)。
脂肪酸(例如C12-C18单羧酸)也可以单独地、或者与上述助洗剂(尤其是柠檬酸盐和/或琥珀酸盐助洗剂)结合加入组合物中，以提供附加的助洗剂活性。这样的脂肪酸的使用一般地将导致起泡的减少，对此配方设计师应当加以考虑。
在可以使用含磷助洗剂的情况下，尤其是在用于手洗操作的块状配方中，可以使用各种碱金属磷酸盐，如众所周知的三聚磷酸钠盐、焦磷酸钠和正磷酸钠。也可以使用膦酸盐助洗剂，如乙烷-1-羟基-1，1-二膦酸盐和其它已知的膦酸盐(参见，如1964年12月1日授予Diehl的美国专利3,159,581；1965年10月19日授予Diehl的3,213,030；1968年9月3日授予Quimby的3,400,148；1969年1月14日授予Roy的3,422,021；和1969年1月14日授予Quimby的3,422,137)。
可以用于本发明的洗衣用洗涤剂组合物的附加组分包括，但不限于烷氧基化的多羧酸盐(以提供，例如，附加的去油污性能)，漂白剂，漂白活化剂，漂白催化剂，增白剂，螯合剂，粘土污垢清除/抗再沉积剂，染料转移抑制剂，附加的酶(包括脂肪酶、淀粉酶、水解酶和其它蛋白酶)，织物软化剂，聚合污垢释放剂，聚合分散剂和泡沫抑制剂。
本文的组合物还可以包括一或多种其它的洗涤剂添加材料或有助于或增强清洁性能、对所需清洁底物的处理或者改善洗涤剂组合物的美学特性的其它材料(例如香料、着色剂、染料等等)。
本文的洗涤剂组合物还可以包括其它已知的洗涤剂清洁组分，这些组分包括烷氧基化的多羧酸盐，漂白化合物，增白剂，螯合剂，粘土污垢清除/抗再沉积剂，染料转移抑制剂，酶，酶稳定系统，织物软化剂，聚合污垢释放剂，聚合分散剂，泡沫抑制剂。洗涤剂组合物也可以包括其它组分，这些组分包括载体，水溶助剂，加工助剂，染料或颜料，液态配方的溶剂，块状组合物的固体填料。
G.治疗或预防脱皮的方法本发明的另一方面涉及治疗或者预防脱皮的方法。该方法包括局部施用安全和有效量的包含KDP多肽的组合物。
在这里，“安全和有效量”意指在正确的医学判断范围之内，KDP多肽量高到足以提供对所治疗症状的明显的改善，但低到足以避免严重的副作用(具有合理的效益/风险比)。KDP多肽的安全和有效量将随着所治疗的具体症状、患者年龄和身体况状、病症的严重程度、治疗的持续时间、并行治疗的性质等等的变化而变化。
在主题方法中使用的合适的组合物包括上述护肤组合物，该护肤组合物包括护发组合物(例如用来治疗/预防由脱皮造成的头皮屑)。
下列实施例进一步描述和说明属于本发明范围之内的优选实施方案。给出这些例子只是为了说明的目的，而不作为对本发明的限制，因为可能存在其许多变体而不偏离其精神和范围。
实施例1
这一实施例显示KDP多核苷酸的分离。用化学方法合成一对寡核苷酸引物，并利用人角质形成细胞cDNA文库作为模板，用其由PCR(聚合酶链反应)来扩增人SCCE(角质层胰凝乳蛋白酶样酶)基因的编码区(基于在Hansson等人，生物化学杂志，26919420-19426，1994中提出的基因的DNA序列)。然后将所扩增的SCCE cDNA片段克隆入大肠杆菌载体，并确认它的DNA序列。然后分离所克隆的SCCE DNA片段，用32P放射性标记之，并在Southern杂交实验中将其用作为探针，以筛选具有与SCCE类似的结构的新cDNA克隆。杂交实验在低严格条件下进行，这种条件提供阳性信号，即使核苷酸序列的相似性低至大约70％。在一个具体实验中，自所筛选的1×105λ噬菌体克隆中获得了11个阳性克隆，并且结果是其中的两个阳性克隆(克隆#31和克隆67#)在不同的位置上携带相同的cDNA。我们集中注意力于这两个克隆。由于两克隆都缺乏基因的5′部分，因此由PCR制备了对应于克隆#67的5′末端的短DNA片段，用32P放射性标记之，并利用其来再一次筛选文库，以分离包含缺失部分的克隆。自另一所筛选的1×105克隆中选择出总共12个阳性克隆。DNA测序分析表明在这些克隆中，命名为#TZ--10的克隆包含cDNA的缺失5′部分和最长5′非翻译区。分离克隆#31和#TZ-10的DNA，并使它们在pBluescript II SK+载体中与适当的限制酶一起合并为全长克隆。全长克隆的DNA序列与DNA数据库的比较表明它编码新丝氨酸蛋白酶，因此，我们将其命名为克隆KDP1(角质形成细胞衍生的蛋白酶1)。在蛋白质水平上，KDP1在结构上类似于SCCE、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶(分别为49％、48％和36％)，但彼此之间却明显不同。KDP1具有编码KDP多肽(保藏号FERMBP-6129提出的)的核苷酸序列。
实施例2这一实施例显示KDP多核苷酸的化学合成。利用核苷酸合成仪(如ABI DNA/RNA合成仪模型380A/380B/381A/390Z/391/392/394)，用化学方法合成对应于实施例1的KDP1基因的任一所需部分的单链或双链寡核苷酸。
实施例3这一实施例显示包含KDP多核苷酸的表达载体的形成。通过利用重组PCR技术，使KDP1基因的成熟部分与在5′末端包含六个组氨酸残基的重复片段的人造前序列融合。这一组氨酸标记设计用于在表达之后KDP1蛋白质的快速纯化。前序列也包含肠激酶的特异性切割位点，以便可以在纯化步骤之后通过肠激酶消化来激活重组前KDP1。这一KDP1基因盒在pPIC9载体(Invitrogen)(用于在巴斯德毕赤酵母细胞中的表达)的Xho1和Noti1位点之间得到克隆。克隆位点直接定位于适当读框中的酵母α-因子信号序列的下游，以便设计成使重组前KDP1分泌到培养基中。前KDP1蛋白质的诱导处于AOX1启动子的控制之下，该启动子定位于酵母α-因子信号序列的上游。通过在培养基中加入甲醇来强烈地诱导得自AOX1启动子的转录物，并因此可以由甲醇诱导重组KDP1蛋白质。载体也分别在大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母细胞中包含氨苄青霉素抗性基因和用于选择的HIS4基因。
实施例4这一实施例显示用实施例3的表达系统对宿主的转化。用原生质球方法或电穿孔法完成毕赤酵母细胞的转化。(参考在巴斯德毕赤酵母中表达重组蛋白质的方法的手册(目录号K1710-01)，其由Invitrogen分发)。通过用山梨醇和酶解酶处理GS115、KM71或SMD1168菌株来制备毕赤酵母原生质球。加入10μg表达质粒DNA，以在PEG和CaCl2存在下转化原生质球制备物。然后在28-30℃下将原生质球平板接种在用于选择HIS+转化体的组氨酸-缺失平板上。对于电穿孔法，使毕赤酵母GS115、KM71或SMD1168细胞生长在丰富培养基中，收集并利用1M山梨醇溶液处理它们。在细胞与5-20μg线性化质粒DNA混合之后，将溶液转移至冰冷的0.2cm电穿孔小池(Bio-Rad)中。用Bio-Rad GenePulsar在1,500伏特下以25pF电容和200Ω电阻进行电穿孔。在28-30℃下，将细胞铺展在平板上以获得HIS+转化体。经由在转化DNA和基因组之内的同源区之间的同源重组，线型DNA可以产生巴斯德毕赤酵母的稳定转化体。与双交换事件(置换)相比，单交换事件(插入)更为可能。由于单交换事件不破坏宿主基因组上的AOX1基因，因此这样的转化体可以在含甲醇的平板上充分地生长(HIS+和Mut+表型)。相反，当由AOX1启动子和载体的3′AOX1区与基因组之间双交换事件而引起基因置换时，将导致完全除去AOX1编码区。可以通过它们在含甲醇的平板上的缓慢生长来选择具有所产生的表型(HIS+Muts)的转化体。筛选用于KDP1表达的Mut+和Muts转化体。
实施例5这一实施例显示KDP多肽的表达和纯化。
表达通过摇瓶或发酵培养，使转化体生长在基本或丰富培养基中，直到它们达到它们的最大生长量。对于KDP1基因的诱导，在Muts转化体的情况下，以1％的最大浓度在培养基中加入甲醇。对于Mut+转化体，加入甲醇以使细胞得以保持溶解氧水平在培养基中为20％以上。在开始甲醇诱导之后大约6天，收获培养基，并由离心收集上清液。
纯化将上清液施于镍-螯合柱上，并通过二价阳离子的高亲和性HIS标记来吸附前KDP1。在自柱上洗去培养基中的无关蛋白质之后，由在低pH缓冲液中的洗脱或通过与咪唑或组氨酸的竞争来回收前KDP1蛋白质。由超滤浓缩洗脱物，并用肠激酶反应缓冲液交换缓冲液。通过利用肠激酶处理前KDP1蛋白质来实现它的活化。在活化步骤之后，利用合适的生化方法除去肠激酶，浓缩样品，冻干，并在使用前将其保持在4℃下。
实施例6这一实施例显示简单的局部护肤组合物。利用常规混合技术合并下列组分。组分以组合物重量计的％KDP多肽 5乙醇平衡至100这一组合物以足以沉积大约0.5μg/cm2皮肤的量每天施用两次，历时六个月，以提供皮肤调理益处。
实施例7这一实施例显示简单的局部护肤组合物。利用混合技术常规合并下列组分。组分 以组合物重量计的％KDP多肽0.05去离子水 平衡至100这一组合物每天施用一次，历时六个月。每cm2皮肤足以沉积大约120μg活性物的用量对于提供皮肤调理益处是适当的。
实施例8这一实施例显示通过利用常规混合技术合并下列组分制备的乳膏组合物。组分 以组合物重量计的％--水相--美国药典级H2O 63.03EDTA二钠 0.13甘油 3羟苯甲酸甲酯 0.25--油相--丙二醇二辛酸酯/二癸酸酯 3硬脂酸甘油酯 4鲸蜡醇 1硬脂醇 1乙氧基化鲸蜡基硬脂醇 1.5羟苯甲酸丙酯 0.1--防腐剂相--美国药典级H2O 1.49丁二醇 1.5苄醇 0.5--活性物溶液--KDP多肽 0.03水平衡至100将前三个相与活性物溶液混合。组合物每隔一天施用一次，历时两个月。每cm2皮肤沉积40μg活性物的用量对于提供皮肤调理益处是适当的。
实施例9这一实施例显示用于治疗或防止头皮脱皮的香波组合物。利用常规混合技术合并下列组分。组分 以组合物重量计的％月桂基醚硫酸钠(2EO)21％AD 41.4％月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱30％AD 4椰子脂肪酸二乙醇胺 1.5Oleth-3-磷酸酯(CRODAFOS N 3AcidCroda) 1PEG-15牛脂多胺(POLYQUART HHenkel)50％活性物 1.5防腐剂，着色物质，盐 0.58香料 适量KDP多肽 1水 平衡至100实施例10这一实施例显示用于治疗或防止头皮脱皮的头发调理组合物。利用常规混合技术合并下列组分。组分以组合物重量计的％二甲聚硅氧烷/环甲聚硅氧烷 4.2十八酰氨基丙基二甲胺1鲸蜡醇 0.9二牛脂二甲铵0.75硬脂醇 0.6羟乙基纤维素0.5一硬脂酸甘油酯 0.25无水柠檬酸 0.22防腐剂 0.0005香料0.26KDP多肽 8水 平衡至100实施例11按照本发明制备下列的粒状洗衣用洗涤剂组合物A至D组分以组合物重量计的％A B C D--基本颗粒--沸石A 30 22 24 10硫酸盐 10 5 10 7MA/AA 3 - - -AA - 1.6 2MA/AA(1)- 12 - 6LAS 14 10 9 20C45AS 8 7 9 7C45AES - 1 1硅酸盐 - 1 0.5 10皂 - 2 - -增白剂10.2 0.2 0.2 0.2碳酸盐 6 9 1010PEG 4000 - 1 1.5 -DTPA - 0.4 - ---喷雾于--C25E9 - - - 5C45E7 1 1 - -C23E9 - 1 2.5 -香料 0.2 0.3 0.3 ---干燥添加剂--碳酸盐 5 10188PVPVI/PVNO 5 10188KDP多肽1 1 1 0.5脂肪酶 0.4 - - 0.4淀粉酶 0.1 - - 0.1纤维素酶 0.1 0.2 0.2 0.1NOBS - 4 - 4.5PB11 5 1.5 6硫酸盐 4 5 - 5SRP1 - 0.4 - -泡沫抑制剂 - 0.5 0.5 -混杂/次要组分 平衡至100AA平均分子量为4,500的聚丙烯酸钠聚合物。
淀粉酶淀粉水解酶，具有以重量计的1.6％的活性酶，由NOVOIndustries A/S以Termamyl 120T商品名出售。
漂白剂14，4′-(2-磺基苯乙烯基)联苯二钠。
碳酸盐粒径为200μm至900μm之间的无水碳酸钠。
纤维素酶纤维素水解酶，具有以重量计的0.23％的活性酶，由NOVO Industries A/S以Carezyme商品名出售。
CxyASC1x-C1y烷基硫酸钠。
CxyEz与Z摩尔(平均值)的环氧乙烷缩合的C1x-C1y主要线性的伯醇。
CxyEzS与Z摩尔环氧乙烷缩合的C1x-C1y烷基硫酸钠。
DTPA二亚乙基三胺五乙酸。
LAS线型C11-13烷基苯磺酸钠。
脂肪酶脂解酶，具有以重量计的2.0％的活性酶，由NOVOIndustries A/S以商品名Lipolase出售。
MA/AA1∶4马来酸/丙烯酸的共聚物，平均分子量为大约70,000。
MA/AA(1)4∶6马来酸/丙烯酸的共聚物，平均分子量为大约10,000。
NOBS钠盐形式的壬酰羟苯磺酸酯。
PB1标称式为NaBO2·H2O2的无水过硼酸钠漂白剂。
PEGx分子量为X(典型地为4,000)的聚乙二醇。
PVNO平均分子量为50,000的聚乙烯吡啶N-氧化物聚合物。
PVPVI平均分子量为20,000的聚乙烯吡咯烷酮和乙烯咪唑的共聚物。
硅酸盐无定形的硅酸钠(SiO2∶Na2O＝2.0∶1)。
皂得自80/20的牛脂和椰子脂肪酸的混合物的线型烷基羧酸钠。
SRP1阴离子封端的聚酯。
硫酸盐无水硫酸钠。
沸石A具有0.1至10微米的初级粒径、分子式为Na12(AlO2SiO2)12·27H2O的水合硅铝酸盐钠(重量以无水基准表示)。
可以理解，本文描述的实施例和实施方案只是为了说明本发明，并且基于其的各种改进或变化都可以在不偏离本发明范围的情况下由本领域技术人员想到。
序列表(1)一般信息(i)申请人The Procter & Gamble Company，N/A N/A(ii)发明名称得自人皮肤的蛋白酶基因(iii)序列数2(iv)通讯地址(A)收信人T.David Reed(B)街道5299 Spring Grove Avenue(C)城市Cincinnati(D)州俄亥俄(E)国家美国(F)ZIP45217-1087(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(vi)当前的申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类(viii)律师/代理人信息(A)姓名Reed，T David(B)登记号32,931(C)参考/证书号AA-(ix)联系信息(A)电话513-627-7025(B)传真513-627-6333(2)SEQ ID NO1的信息
(i)序列特征(A)长度1499个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置291...1172(ix)特征(A)名称/关键词成熟肽(B)位置489...1172(ix)特征(A)名称/关键词5′UTR(B)位置1...290(ix)特征(A)名称/关键词3′UTR(B)位置1173...1499(xi)序列描述SEQ ID NO1CGGCCAGGAA GGCACAGGCC TGAGAAGTCT GCGGCTGAGC TGGGAGCAAA TCCCCCACCC60CCTACCTGGG GGACAGGGCA AGTGAGACCT GGTGAGGGTG GCTCAGCAGG AAGGAAGGAG 120AGGTGTCTGT GCGTCCTGCA CCCACATCTT TCTCTGTCCC CTCCTTGCCC TGTCTGGAGG 180CTGCTAGACT CCTATCTTCT GAATTCTATA GTGCCTGGGT CTCAGCGCAG TGCCGATGGT 240GGCCCGTCCT TGTGGTTCCT CTCTACTTGG GGAAATCAGG TGCAGCGGCC ATG GCT 296Met Ala-66 -65ACA GCA AGA CCC CCC TGG ATG TGG GTG CTC TGT GCT CTG ATC ACA GCC 344Thr Ala Arg Pro Pro Trp Met Trp Val Leu Cys Ala Leu Ile Thr Ala-60 -55 -50TTG CTT CTG GGG GTC ACA GAG CAT GTT CTC GCC AAC AAT GAT GTT TCC 392Leu Leu Leu Gly Val Thr Glu His Val Leu Ala Asn Asn Asp Val Ser-45 -40 -35TGT GAC CAC CCC TCT AAC ACC GTG CCC TCT GGG AGC AAC CAG GAC CTG 440Cys Asp His Pro Ser Asn Thr Val Pro Ser Gly Ser Asn Gln Asp Leu-30 -25 -20GGA GCT GGG GCC GGG GAA GAC GCC CGG TCG GAT GAC AGC AGC AGC CGC 488Gly Ala Gly Ala Gly Glu Asp Ala Arg Ser Asp Asp Ser Ser Ser Arg-15 -10 -5ATC ATC AAT GGA TCC GAC TGC GAT ATG CAC ACC CAG CCG TGG CAG GCC 536Ile Ile Asn Gly Ser Asp Cys Asp Met His Thr Gln Pro Trp Gln Ala1 5 10 15GCG CTG TTG CTA AGG CCC AAC CAG CTC TAC TGC GGG GCG GTG TTG GTG584Ala Leu Leu Leu Arg Pro Asn Gln Leu Tyr Cys Gly Ala Val Leu Val20 25 30CAT CCA CAG TGG CTG CTC ACG GCC GCC CAC TGC AGG AAG AAA GTT TTC 632His Pro Gln Trp Leu Leu Thr Ala Ala His Cys Arg Lys Lys Val Phe35 40 45AGA GTC CGT CTC GGC CAC TAC TCC CTG TCA CCA GTT TAT GAA TCT GGG 680Arg Val Arg Leu Gly His Tyr Ser Leu Ser Pro Val Tyr Glu Ser Gly50 55 60CAG CAG ATG TTC CAG GGG GTC AAA TCC ATC CCC CAC CCT GGC TAC TCC 728Gln Gln Met Phe Gln Gly Val Lys Ser Ile Pro His Pro Gly Tyr Ser65 70 75 80CAC CCT GGC CAC TCT AAC GAC CTC ATG CTC ATC AAA CTG AAC AGA AGA 776His Pro Gly His Ser Asn Asp Leu Met Leu Ile Lys Leu Asn Arg Arg85 90 95ATT CGT CCC ACT AAA GAT GTC AGA CCC ATC AAC GTC TCC TCT CAT TGT 824Ile Arg Pro Thr Lys Asp Val Arg Pro Ile Asn Val Ser Ser His Cys100 105 110CCC TCT GCT GGG ACA AAG TGC TTG GTG TCT GGC TGG GGG ACA ACC AAG 872Pro Ser Ala Gly Thr Lys Cys Leu Val Ser Gly Trp Gly Thr Thr Lys115 120 125AGC CCC CAA GTG CAC TTC CCT AAG GTC CTC CAG TGC TTG AAT ATC AGC 920Ser Pro Gln Val His Phe Pro Lys Val Leu Gln Cys Leu Asn Ile Ser130 135 140GTG CTA AGT CAG AAA AGG TGC GAG GAT GCT TAC CCG AGA CAG ATA GAT 968Val Leu Ser Gln Lys Arg Cys Glu Asp Ala Tyr Pro Arg Gln Ile Asp145 150 155 160GAC ACC ATG TTC TGC GCC GGT GAC AAA GCA GGT AGA GAC TCC TGC CAG 1016Asp Thr Met Phe Cys Ala Gly Asp Lys Ala Gly Arg Asp Ser Cys Gln
165 170 175GGT GAT TCT GGG GGG CCT GTG GTC TGC AAT CCC TCC CTG CAG GGA CTC 1064Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asp Gly Ser Leu Gln Gly Leu180 185 190GTG TCC TGG GGA GAT TAC CCT TGT GCC CGG CCC AAC AGA CCG GGT GTC 1112Val Ser Trp Gly Asp Tyr Pro Cys Ala Arg Pro Asn Arg Pro Gly Val195 200 205TAC ACG AAC AAC TGC AAG TTC ACC AAG TGG ATC CAG GAA ACC ATC CAG 1160Tyr Thr Asn Leu Cys Lys Phe Thr Lys Trp Ile Gln Glu Thr Ile Gln210 215 220GCC AAC TCC TGA GTCATCCCAG GACTCAGCAC ACCGGCATCC CCACCTGCTG 1212Ala Asn Ser225CAGGGACAGC CCTGACACTC CTTTCAGACC CTCATTCCTT CCCAGAGATG TTGAGAATGT1272TCATCTCTCC AGCCCCTGAC CCCATGTCTC CTGGACTCAG GGTCTGCTTC CCCCACATTG1332GGCTGACCGT GTCTCTCTAG TTGAACCCTG GGAACAATTT CCAAAACTGT CCAGGGCGGG1392GGTTGCGTCT CAATCTCCCT GGGGCACTTT CATCCTCAAG CTCAGGGCCC ATCCCTTCTC1452TGCAGCTCTG ACCCAAATTT AGTCCCAGAA ATAAACTGAG AAGTGGC 1499(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度294个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ala Thr Ala Arg Pro Pro Trp Met Trp Val Leu Cys Ala Leu Ile-66 -65 -60 -55Thr Ala Leu Leu Leu Gly Val Thr Glu His Val Leu Ala Asn Asn Asp-50 -45 -40 -35Val Ser Cys Asp His Pro Set Asn Thr Val Pro Ser Gly Ser Asn Gln-30 -25 -20Asp Leu Gly Ala Gly Ala Gly Glu Asp Ala Arg Ser Asp Asp Ser Ser-15 -10 -5Ser Arg Ile Ile Asn Gly Ser Asp Cys Asp Met His Thr Gln Pro Trp1 5 10Gln Ala Ala Leu Leu Leu Arg Pro Asn Gln Leu Tyr Cys Gly Ala Val15 20 25 30Leu Val His Pro Gln Trp Leu Leu Thr Ala Ala His Cys Arg Lys Lys35 40 45Val Phe Arg Val Arg Leu Gly His Tyr Ser Leu Ser Pro Val Tyr Glu50 55 60Ser Gly Gln Gln Met Phe Gln Gly Val Lys Ser Ile Pro His Pro Gly65 70 75Tyr Ser His Pro Gly His Ser Asn Asp Leu Met Leu Ile Lys Leu Asn80 85 90Arg Arg Ile Arg Pro Thr Lys Asp Val Arg Pro Ile Asn Val Ser Ser95 100 105 110His Cys Pro Ser Ala Gly Thr Lys Cys Leu Val Ser Gly Trp Gly Thr115 120 125Thr Lys Ser Pro Gln Val His Phe Pro Lys Val Leu Gln Cys Leu Asn130 135 140Ile Ser Val Leu Ser Gln Lys Arg Cys Glu Asp Ala Tyr Pro Arg Gln145 150 155Ile Asp Asp Thr Met Phe Cys Ala Gly Asp Lys Ala Gly Arg Asp Ser160 165 170Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Ser Leu Gln175 180 185 190Gly Leu Val Ser Trp Gly Asp Tyr Pro Cys Ala Arg Pro Asn Arg Pro195 200 205Gly Val Tyr Thr Asn Leu Cys Lys Phe Thr Lys Trp Ile Gln Glu Thr210 215 220Ile Gln Ala Asn Ser22权利要求
1.一种包含氨基酸序列的分离的多肽，该氨基酸序列a)实质上显示在SEQ ID NO2中；b)实质上类似于由质粒中的核苷酸序列 编码的氨基酸序列，其中的质粒具有保藏号FERM BP-6129的所有鉴定特征；或者c)实质上类似于包含SEQ ID NO2的位置39-43、86-88和177-185的氨基酸序列。
2.权利要求1的分离的多肽，其中的氨基酸序列显示在下列序列或片段中a)SEQ ID NO2，b)SEQ ID NO2的位置1-227，或者c)SEQ ID NO2的位置39-185。
3.一种包含核苷酸序列的分离的多核苷酸，该核苷酸序列a)实质上显示在SEQ ID NO1中；b)实质上类似于包含在质粒中的核苷酸序列，其中的质粒具有保藏号FERM BP-6129的所有鉴定特征；或者c)实质上类似于包含SEQ ID NO1的位置603-617、744-752和1017-1043的核苷酸序列。
4.权利要求3的分离的多核苷酸，其中的核苷酸序列显示在下列序列或片段中a)SEQ ID NO1，b)SEQ ID NO1的291-1172位置c)SEQ ID NO1的536-1172位置，d)SEQ ID NO1的1-1172位置，e)SEQ ID NO1的291-1499位置，或者f)SEQ ID NO1的603-1043位置。
5.一种编码权利要求1或2之任一的多肽的分离的多核苷酸。
6.一种包含权利要求3-5之任一的多核苷酸的表达系统。
7.一种包含权利要求1或2之任一的多肽的组合物。
8.权利要求7的组合物，其中的组合物是护肤组合物。
9.权利要求8的组合物，其中的组合物是洗衣用洗涤剂组合物。
10.一种治疗或防止脱皮的方法，该方法包括局部施用包含权利要求1或2之任一的多肽的组合物。
11.一种特异地结合权利要求1或2之任一的多肽的抗体。
全文摘要
本发明公开了分离的角质形成细胞衍生的蛋白酶,该蛋白酶包含实质上类似于由质粒(具有保藏号FERM BP－6129的所有鉴定特征)中的核苷酸序列所编码的氨基酸序列的氨基酸序列。本发明还公开了包含上述多肽的护肤和洗衣用洗涤剂组合物。
文档编号A61K38/43GK1276011SQ97182443
公开日2000年12月6日 申请日期1997年10月3日 优先权日1997年10月3日
发明者北出治子, 吉川秋胜, 材生朋子 申请人:普罗克特和甘保尔公司