专利名称：角质形成细胞生长因子的治疗制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及冻干的角质形成细胞生长因子的制剂和生产包含角质形成细胞生长因子的冻干的组合物的方法。
背景技术：
角质形成细胞生长因子(KGF)是在人类胚胎的肺成纤维细胞系的条件培养基中首先鉴定的上皮细胞特异的生长因子[Rubin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86802-806(1989)]。KGF的信使RNA的表达已经在几种来自各种发育阶段的上皮组织的基质成纤维细胞系中检测到。在从正常的成年人肾脏和胃肠道的器官提取的RNA中，KGF的转录产物也是明显的[Finch et al.，Science 245752-755(1989)]。KGF从培养的成纤维细胞分泌并且在真皮中而不是表皮中体内表达的证据表明，KGF可能是角质形成细胞增殖的重要的正常旁泌性效应物。研究显示，在刺激组织培养物中原发或继发性人类角质形成细胞的增殖方面，KGF与表皮生长因子(EGF)一样有效[Marchese et al.，J.Cell.Phys.144326-332(1990)]。KGF是由许多器官的上皮细胞附近的间充质细胞产生的，这些器官包括表皮、口腔、低位胃肠上皮细胞、胰腺、肝脏、肺、尿道上皮、前列腺上皮细胞等[Finch et al，supra，Housley et al.，J Clin Invest.941764-77，(1994)；Yi et al.，Am J Path.14580-85，(1994)；Pierce et al.，J Exp.Med.179831-40，(1994)；Yi etal，J Urol.1541566-70，(1995)；和Ulich et al.，J Clin Invest.931298-1306，(1994)].
在国际专利公开WO 90/08771中描述了从人类胚胎成纤维细胞系的条件培养基纯化KGF，以及纯化的KGF的部分氨基酸测序，KGF基因的克隆和在细菌细胞中表达基因来产生生物学活性的重组KGF。这个出版物还公开了KGF或KGF样多肽作为烧伤的伤口愈合试剂或刺激移植的角膜组织。
在正常的成年动物中的体外和体内研究显示，KGF-1(以下“KGF”)产生了毛囊形态发生、肝细胞增殖和在肺、乳腺、胰腺、胃、小肠和大肠中的上皮细胞增殖方面的改变[Panos et al.，J.Clin.Invest.92969-977(1993)；Ulich et al.，Am.J.Path.144862-868(1994)；Yi et al.，Am.J.Path.14580-85(1994)；和Ulich et al.，J.Clin.Invest.931298-1306(1994)].KGF在胚胎或新生儿发育中的作用当前正在研究中；然而，已经记录了KGF是新生小鼠中精囊发育的重要介体[Alarid et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 911074-1078(1994)].此外，在肝细胞中过量表达KGF的小鼠展现出多囊肾[Nguyen et al.，Oncogene 122109-19，(1996)]，而使用表面活性物启动子在肺中过量表达KGF产生了具有肺部囊腺瘤的小鼠[Simonet et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9212461-65，(1995)]，表明KGF在正常的肾脏和肺部发育中的重要性。
KGF已经显示了当将重组KGF局部施用到兔耳或猪皮肤中手术诱导的伤口时提高了上皮重新形成和提高上皮细胞的厚度[Pierce et al.，J.Exp.Med.179831-840(1994])；和Staiano-Coico et al.，J.Exp.Med.178865-878(1993)]。Bosch等[J.Clin.Invest.982683-2687(1996)]报道了施用角质形成细胞生长因子将诱导肝细胞的增殖。
一般地，纯化的多肽仅在含水状态是勉强稳定的，并在加工和保存期间经历引起生物学活性损失的化学和物理降解。此外，水溶液中的多肽组合物经历水解作用，例如脱酰胺作用和肽键断裂。这些效果对于意图在根据生物学活性定义的剂量范围内向人类施用的治疗活性多肽是严重的难题。
施用纯化的角质形成细胞生长因子是治疗许多影响人类群体的疾病的有前途的候选物。然而，KGF在各种保存条件下随着时间保持为稳定的药物组合物并且对于患者在体内是有效的能力还未被解决。因而，本领域中需要提供稳定的制剂中的角质形成细胞生长因子，其作为治疗剂来治疗将受益于KGF介导的上皮细胞生长刺激的各种疾病是有用的。
发明概述本发明提供了对于产生高稳定KGF产物的角质形成细胞生长因子(KGF)的冻干有用的新制剂。稳定的KGF产物作为治疗剂在患有可受益于KGF施用的失调或状况的个体治疗中是有用的。
在一个方面，本发明提供了冻干的角质形成细胞生长因子组合物，包含组氨酸、填充剂(bulking agent)、表面活性剂和糖类(sugar)，例如稳定化糖类(stabilizing suger)。
在一个实施方式中，KGF组合物包含SEQ ID NO2的氨基酸序列或其变体。KGF蛋白的变体包括等位变异，或者氨基酸的缺失、替换或插入，包括天然KGF的片段、嵌合或杂交分子。例如，本发明预期KGF是ΔN23 KGF(SEQ ID NO3)，其中天然KGF的前23个氨基酸被缺失。变体包括在此描述的那些分子，例如电荷改变的多肽，其中天然KGF(SEQ ID NO2)的氨基酸残基41-154的一个或多个被缺失，或用选择来使蛋白具有降低的正电荷的中性残基或带负电残基替换。KGF的更进一步的实例包括但不限于，通过用具有更高的环形成潜力的至少一个氨基酸替换天然KGF的Ash115-His116-Tyr117-Asn118-Thr119的环形成区域中的至少一个氨基酸产生的蛋白质。更进一步的实例包括在天然KGF的氨基酸123-133(SEQ ID NO2的氨基酸154-164)的区域内具有一个或多个氨基酸替换、缺失或添加的蛋白质。
在一个方面，本发明预期使用填充剂/渗透性调节剂。填充剂可以是晶体的(例如，甘氨酸、甘露醇)或无定形的(例如，L-组氨酸、蔗糖、聚合物如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素和乳糖)。在一个实施方式中，所述填充剂是甘露醇。在进一步的实施方式中，所述甘露醇以约2％到约5％w/v的浓度掺入。在进一步的实施方式中，所述浓度是约3％到约4.5％w/v。在另一个实施方式中，甘露醇是4％w/v的浓度。
在另一个方面，本发明提供了包含稳定化糖类的组合物。预期使用的糖类包括但不限于，蔗糖、海藻糖或甘氨酸。在一个实施方式中，所述糖类是蔗糖。在相关的实施方式中，所述蔗糖是约1-3％w/v的浓度。在进一步的实施方式中，所述蔗糖是2％的浓度。
预期的是本发明的组合物被调节到约5.0到约8.0范围内的pH值。在一个实施方式中，所述KGF组合物具有约6.0到约8.0范围内的pH值。在另一个实施方式中，所述组合物具有约6.0到约7.0范围内的pH值。在进一步的实施方式中，所述组合物具有约6.5的pH值。
在进一步的方面，所述组合物预期使用表面活性剂。预期的是所使用的表面活性剂包括但不限于，聚山梨酯20或聚山梨酯80.在一个实施方式中，所述表面活性剂是聚山梨酯20(polysorbate 20).在相关的实施方式中，聚山梨酯20浓度在约0.1％到约0.004％w/v的范围内。在进一步的实施方式中，聚山梨酯20浓度是约0.01％w/v。
在一个方面，本发明预期冻干的角质形成细胞生长因子组合物，其包含10mM组氨酸、4％甘露醇、2％蔗糖和0.01％聚山梨酯20，其中所述组合物是6.5的pH值。
本发明进一步提供了生产冻干的角质形成细胞生长因子的方法，包括步骤a)制备组氨酸、填充剂、稳定化糖类；和表面活性剂的溶液；和b)冻干所述KGF.在相关的方面，本发明预期生产冻干的角质形成细胞生长因子的方法，进一步包括在冻干步骤之前b)调节所述溶液的pH值到约6.0和约8.0之间；c)制备含有角质形成细胞生长因子的溶液；d)缓冲液交换步骤(c)的溶液成步骤(b)的溶液；e)添加适合数量的表面活性剂，和f)冻干来自步骤(e)的混合物。进一步预期的是，所述KGF可以是SEQ ID NO2、SEQ ID NO3中列出的KGF蛋白质，或其变体。
在一个方面，本发明的方法预期使用填充剂/渗透性调节剂，其中所述填充剂可以是晶体的(例如，甘氨酸、甘露醇)或无定形的(例如，L-组氨酸、蔗糖、聚合物如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素和乳糖)。在一个实施方式中，所述填充剂是甘露醇。在另一个实施方式中，所述甘露醇是约2％到约5％w/v的浓度。在相关的实施方式中，所述甘露醇是约3％到约4.5％w/v的浓度。在进一步的实施方式中，所述甘露醇是4％w/v的浓度。
在另一个方面，本发明的方法提供了包含糖类的组合物，其中所述糖类是稳定化糖类。预期用于本发明的方法糖类包括但不限于，蔗糖、海藻糖或甘氨酸。在一个实施方式中，所述糖类是蔗糖。在相关的实施方式中，所述蔗糖是约1％到约3％w/v的浓度。在进一步的实施方式中，所述蔗糖是2％的浓度。
本发明的方法预期的是调节pH值到生理pH值。在一个实施方式中，所述pH值被调节到约5.0到约8.0的范围。在另一个实施方式中，所述pH值被调节到约6.0到约8.0的范围。在进一步的实施方式中，所述pH值被调节到约6.0到约7.0的范围。在更进一步实施方式中，所述pH值被调节到6.5的pH值。
在进一步的方面，本发明的方法预期使用表面活性剂。预期的是所使用的表面活性剂包括但不限于，聚山梨酯20或聚山梨酯80。在一个实施方式中，所述表面活性剂是聚山梨酯20。在相关的实施方式中，聚山梨酯20浓度在约0.1％到约0.004％w/v的范围内。在进一步的实施方式中，聚山梨酯20浓度是约0.01％w/v。
在一个方面，本发明预期生产冻干的角质形成细胞生长因子组合物的方法，所述组合物包含10mM组氨酸、4％甘露醇、2％蔗糖和0.01％(w/v)聚山梨酯20，其中所述组合物是约6.5的pH值。
本发明进一步预期通过提高KGF介导的上皮细胞生长刺激来治疗疾病的方法，包括向受试者施用有效量的本发明的冻干的角质形成细胞生长因子组合物。
预期的是要治疗的疾病是肠毒性；粘膜炎；烧伤或其他部分和完全的深层损伤；毛囊、汗腺和皮脂腺的再生；附件结构增生；大疱性表皮松解、化学疗法诱导的脱发；男性型秃发；胃溃疡；十二指肠溃疡；糜烂性胃炎、食管炎或食管回流；炎症性肠病；透明膜病；烟雾吸入损伤；肺气肿；肝硬化、肝衰竭、急性病毒性肝炎，对肝脏的其他毒性损害；或移植物抗宿主疾病(GVHD)。
本发明还预期的是用于制备含水药物组合物的药盒，其包含具有冻干的角质形成细胞生长因子组合物的第一容器，和具有用于冻干的组合物的具有生理学可接受的重构溶液的第二容器。预期的是，所述KGF蛋白可以是SEQ ID NO2、SEQ ID NO3中列出的KGF蛋白质，或其变体。生理学可接受的重构溶液可以是任何药学上可接受的载体或稀释剂，包括但不限于，任何和所有的临床上有用的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟试剂等等，包括在此公开的那些试剂。此外，KGF组合物可以由治疗医师通过任何被认为合适的途径施用给受试者，所述途径包括经口地、局部地、经皮地、胃肠外地，通过吸入喷雾、阴道地、直肠地，或通过颅内注射。在此使用的术语胃肠外的包括皮下注射、静脉内、肌肉内、脑池内的注射，或输注技术。通过静脉内的、皮内的、肌肉内的、乳房内的、腹膜内的、鞘内的、眼球后的、肺内的注射，或在特定部位的外科植入的施用也是预期的。
附图的简要说明附
图1描绘了在不同pH值的液体KGF制剂中可溶蛋白的大小排阻(SE)-HPLC(附图1A)和阳离子交换(CE)-HPLC(附图1B)分析。
附图2描绘了比较在10mM组氨酸、0.01％聚山梨酯20以及4％甘露醇/2％蔗糖或3％甘露醇/2％蔗糖中冻干的KGF制剂的反相(RP)HPLC层析图。附图2A描绘了冻干后的零时间，而附图2B显示了在4℃保存1年后的产品。插图显示了主峰旁的区域。
附图3表现了作为来自在45℃保存24周后冻干的KGF制剂的SE-HPLC分析的蛋白质浓度的函数的主峰百分比。
发明的详细说明本发明涉及用于纯化的角质形成细胞生长因子的冻干的制剂，其提供了稳定的蛋白产物并提高了纯化的蛋白的货架期。本发明进一步提供了生产包含角质形成细胞生长因子的冻干的组合物的方法。
如在此使用的，“角质形成细胞生长因子”或“KGF”是指角质形成细胞生长因子多核苷酸(SEQ ID NO1，Genbank检索号NM_002009)或SEQ ID NO2中所列的多肽(Genbank检索号NP_002000)或其类似物，或作为选择，角质形成细胞生长因子的活性片段或其类似物，例如，ΔN23 KGF(SEQ ID NO3)，或结合并活化角质形成细胞生长因子受体的因子。在优选的实施方式中，KGF是ΔN23KGF，KGF的重组生产的形式，其中氨基末端的前23个氨基酸已经从成熟KGF上缺失(没有连接信号序列)。参见，例如，US专利No.5,677,278；6,677,301、6,074,848、5,843,883、5,863,767和5,773,586，所有都转让给CHIRON Corp.，U.S.Pat.No.5,731,170，和1990年8月9日公开的PCT申请No.WO 90/08771(涉及KGF的全长形式和变体)；和1996年4月25日公开的申请No.WO 96/11949；1996年4月25日公开的PCT申请No.WO 96/11951；1998年6月11日公开的PCT申请No.WO 98/24813(涉及KGF的稳定的类似物)，所有这些通过包括附图的完全引用合并在此。
在PCT国际公开WO 96/11951和美国专利No.6,677,301中描述了具有相对天然KGF提高的稳定性的KGF类似物，这种KGF类似物是本发明预期的。做为选择，保持了完全的或甚至部分KGF活性的完整KGF多肽的任何片段或其类似物是预期的。
应理解的是，在本说明书中采用的术语“角质形成细胞生长因子”和“KGF”意图包括，并且除非另行指出可互换地意指天然KGF和KGF类似物蛋白(或“突变蛋白(muteins)”)，其特征是与天然KGF的全部或部分肽序列基本上相同的肽序列，并且保持了天然KGF的某些或所有的生物学活性，特别是非成纤维细胞上皮细胞增殖，例如，展现出比NIH/3T3成纤维细胞高至少约500倍的BALB/MK角质形成细胞刺激，和比BS/589上皮细胞或CC1208上皮细胞高至少约50倍的BALB/MK角质形成细胞刺激，如通过H-胸腺嘧啶核苷掺入所测定的。本发明还预期的是肽，“其特征是与天然KGF的肽序列基本上相同的肽序列”，是指由在如在此例示的中度到高度严格杂交条件下能与SEQ ID NO1的编码区杂交的DNA序列编码的肽序列。
在杂交的上下文中，严格条件是一般在杂交反应中控制的盐、温度、有机溶剂和其他参数的严格组合的条件。示范性的严格杂交条件是在4×SSC，在62℃-67℃杂交，继之以0.1×SSC、在62℃-67℃洗涤约一小时。做为选择，示范性的严格杂交条件是在45-55％甲酰胺中、4×SSC在40°-45℃杂交。[参见，T.Maniatis et.al.，MolecularCloning(A Laboratory Manual)；Cold Spring Harbor Laboratory(1982)，pages 387 to 389.]KGF蛋白包括等位基因变异，或氨基酸的缺失、替换或插入，包括天然KGF的片段、嵌合或杂交的分子。本发明优选的KGF分子是ΔN23 KGF。KGF的其他实例包括，无限制地，相应于SEQ ID NO2的Cys1和Cys15的残基被替换或缺失的蛋白，与亲本分子相比产生的分子具有改善的稳定性(如所拥有的U.S.专利6,008,328中一般教导的)。KGF的其他实例包括但不限于，电荷改变的多肽，其中天然KGF的氨基酸残基41-154的一个或多个(优选的残基Arg41、Gln43、Lys55、Lys95、Lys128、Asn137、Gln138、Lys139、Arg144、Lys147、Gln152、Lys153或Thr154)被缺失或被选择以使蛋白降低正电荷的中性残基或带负电残基替换。KGF的更进一步的实例包括但不限于，通过用具有更高的环形成潜力的至少一个氨基酸替换天然KGF的Asn115-His116-Tyr117-Asn118-Thr119的环形成区域中的至少一个氨基酸产生的蛋白质(如US专利6,008,328中教导的)。更进一步的实例包括在天然KGF的氨基酸123-133区域(SEQ ID NO2的氨基酸154-164)内具有一个或多个氨基酸替换、缺失或添加的蛋白质。
具体地预期的KGF蛋白包括以下的KGF分子(通过SEQ ID NO4中列出的成熟蛋白质(减去信号序列)中该位置存在的残基，继之以括号中的氨基酸位置，然后是替代的残基或标记缺失的“-”来命名)ΔN15、ΔN16、ΔN18、ΔN23、ΔN24、ΔN25、ΔN26、或ΔN27 KGF、C(1，15)S、ΔN15-ΔN24、ΔN3/C(15)S、ΔN3/C(15)-、ΔN8/C(15)S、ΔN8/C(15)-、C(1，15)S/R(144)E、C(1，15)S/R(144)Q、ΔN23/R(144)Q、C(1，15，40)S、C(1，15，102)S、C(1，15，102，106)S、ΔN23/N(137)E、ΔN23/K(139)E、ΔN23/K(139)Q、ΔN23/R(144)A、ΔN23/R(144)E、ΔN23/R(144)L、ΔN23/K(147)E、ΔN23/K(147)Q、ΔN23/K(153)E、ΔN23/K(153)Q、ΔN23/Q(152)E/K(153)E；R(144)Q和H(116)G。
KGF对许多不同类型的上皮和内皮细胞的增殖效果表明它是在影响个体的许多状况或疾病的治疗中有用的治疗剂。以下是可以用本发明的KGF治疗的疾病和医学状况的说明。
肠毒性是在放射和化学疗法治疗方式中主要的限制因素。用KGF预治疗可能对小肠粘膜具有细胞保护效果，容许提高这些治疗的剂量而降低肠毒性的潜在致死副作用。新近在用化学治疗剂5-氟尿嘧啶治疗之前施用重组人类KGF的患者的I期临床试验表明，用KGF治疗将产生降低的粘膜炎发生率[Meropol et al.，J Clin Oncol.211452-8(2003)]。允许具有人类治疗效力的化合物的预示测试的辐射诱导肠毒性的标准体内模型是公知的[Withers and Elkind，″MicrocolonySurvival Assay for Cells of Mouse Intestinal Mucosa Exposed toRadiation″，Int.J.Radiat.，17261-267(1970)。预示人类治疗效力的化学疗法诱导的肠毒性的标准体内模型是公知的。Sonis，et al.，″AnAnimal Model for Mucositis Induced by Cancer Chemotherapy，OralSurg.″，Oral Med.Oral Pathol.，69437-431(1990)；和Moore，″Clonogenic Response of Cells of Murine Intestinal Crypts to 12Cytotoxic Drugs″，Cancer Chemotherapy Pharmacol.，1511-15(1985)]。
KGF治疗对于整个胃肠道的粘液产量具有惊人的影响。这种性质在保护肠粘膜避免摄取的有害物质方面，或在例如炎症性肠病的情况下限制损伤的扩散方面可能是有用的。
附件结构例如毛囊、汗腺和皮脂腺的增殖和分化的刺激，在患有烧伤和其他部分和完全的深层损伤的患者的再生表皮和真皮中具有关键性的意义。目前，通过伤疤形成和角质形成细胞重铺表面来治愈体表缺陷；皮肤的完全再生仍是不可能的。当前在完全的深层皮肤缺损，包括烧伤中不会发生毛囊、汗腺和皮脂腺的再生。使用KGF可以容许这种再生。附件结构增生和刺激的标准体内模型是公知的，其容许对于烧伤和其他部分和完全深层损伤具有人类治疗效力的化合物的预示测试[Mustoe，et al.，“Growth factor-induced acceleration of tissuerepair through direct and inductive activities in a rabbit dermal ulcermodel”J.Clin. Invest.，87694-703(1991)；Pierce，et al.，“Platelet-derived growth factor(BB homodimer)，transforming growth factor-beta 1，and basic fibroblast growth factor in dermal wound healing.Neovessel and matrix formation and cessation of repair”Am.J.Path.1401375-88(1992)；和Davis，et al.，“Second-degree burn healingthe effect of occlusive dressings and a cream.”J.of Surgical Res.48245-248(1990)]。
大疱性表皮松解是在表皮对下层真皮的粘附方面的缺陷，引起频繁的开裂、痛苦的水泡，其可以引起严重的发病。这些病变的加速的上皮重新形成，例如通过用KGF治疗，将产生较低风险的感染、减少的疼痛和较少的伤口护理。
当用恶性肿瘤的化学疗法疗程治疗患者时，产生化学疗法诱导的脱发。在防止引起短暂脱发的毛囊细胞死亡方面，目前没有治疗剂是有效的。KGF提供了这种手段。允许具有人类治疗效力的化合物的预示测试的化学疗法诱导脱发的标准体内模型是公知的。[Sawada，et al.，″Cyclosporin A Stimulates Hair Growth in Nude Mice″，LaboratoryInvestigation，56(6)684(1987)；Holland，″Animal Models of Alopecia″，Clin.Dermatol，6159162(1988)；Hussein，″Protection fromChemotherapy-induced Alopecia in a Rat Model″，Science，2491564-1566(1990)；和Hussein，et al.，″Interleukin 1 Protects against 1-B-D-Arabinofuranosyulcytosine-induced Alopecia in the NewbornRat Animal Model″，Cancer Research，513329-3330(1991)]。
男性型秃发是普遍的和基本上不可治疗的。在男性和女性中渐进性的脱发是严重的美容难题。KGF缺陷小鼠展现出波纹的蓬乱皮毛，而KGF受体敲除展现了薄皮、低数量的毛囊和延迟的伤口愈合[Werner et al.，Science 266819-22(1994)]。在脱发的实验模型中，用重组KGF预处理保护了由化学治疗剂阿糖胞苷(ARA-c)施用诱导的大约50％的脱发[Danilenko et al.，Am J Path.147145-54，(1995)]。可以全身地，或如果药物被施加并通过头皮吸收则局部地，或通过使用空气枪或类似技术喷雾注射到头皮中，使用KGF来治疗这些状况。允许具有人类治疗效力的化合物的预示测试的男性型秃发的标准体内模型是公知的。[Uno，″The Stumptailed Macaque as a Modelfor Baldnesseffects of Minoxidil″，International Journal of CosmeticScience，863-71(1986)；Porter R.，“Mouse models for human hair lossdisorders”J Anat.202125-31(2003)]。
研究显示施用KGF可以诱导胃肠道中的细胞生长[Playford et al.，J Pathol.184316-22，(1998)]。胃溃疡，虽然可以用H2拮抗剂治疗，但是产生了显著的病状和复发率，通过粘膜内层的伤疤形成来治愈。在患有胃溃疡的患者中更快速地再生腺性粘膜的能力，例如，通过用KGF治疗，将在胃溃疡的治疗中提供显著的治疗改善。允许具有人类治疗效力的化合物的预示测试的胃溃疡的标准体内模型是公知的，例如，Tarnawski，et al.，[″Indomethacin Impairs Quality of ExperimentalGastric Ulcer HealingA Quantitative Histological and UltrastructuralAnalysis″，InMechanisms of Injury，Protection and Repair of theUpper Gastrointestinal Tract，(eds)Garner and O′Brien，Wiley & Sons(1991)；和Astudillo et al.，[“Gastroprotective activity of oleanolic acidderivatives on experimentally induced gastric lesions in rats and mice”JPharm Pharmacol.54583-8(2002)]。
十二指肠溃疡，象胃溃疡一样，是可治疗的，但是开发更完全和更快速地再生十二指肠的粘膜内层的治疗剂将是重要的进展。此外，再生性地治愈这些溃疡并降低它们的复发的治疗剂将是有益的。KGF提供了这种潜力。允许具有人类治疗效力的化合物的预示测试的十二指肠溃疡的标准体内模型是公知的[Berg，et al.，″Duodenal ulcersproduced on a diet deficient in pantothenic acid″，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，7374-376(1949)；Szabo and Pihan，″Development andSignificance of Cysteamine and Propionitrile Models of DuodenalUlcer″，Chronobiol.Int.，631-42(1987)；Robert，et al.，″Productionof Secretatogues of Duodenal Ulcers in the Rat″，Gastroenterology，5995-102(1970)；和Keshavarzian et al.，“Gastroduodenal ulcers in ratsinduced by 1-methyl-4-phenyl-1，2，5，6-tetrahydropyridine(MPTP)requirement for gastric acid secretion and the role ofprostaglandins”Res Commun Chem Pathol Pharmacol.7021-48(1990)]。
胃和食道的糜烂，象糜烂性胃炎、食管炎或食管回流，是可治疗的，但是开发更完全和快速地再生胃和食道的粘膜内层的治疗剂将是重要的进展。此外，再生性地治愈这些糜烂并降低它们的复发的治疗剂将是有益的。KGF提供了这种潜力。允许具有人类治疗效力的化合物的预示测试的胃和食道糜烂，如糜烂性胃炎、食管炎或食管回流的标准体内模型是公知的[Geisinger et al，″The histologic development ofacid-induced esophagitis in the cat″，Mod-Pathol.，3619-624(1990)；Carlborg et al.，″Tetracycline induced esophageal ulcers.Aclinical and experimental study″，Laryngoscope，93184-187(1983)；Carlborg et al.，″Esophageal lesions caused by orally administered drugs.An experimental study in the cat″，Eur-Surg-Ethanol on esophagealmotility in cats，Alcohol-Clin-Exp-Res.，15116-121(1991)和Katzet al.，″Acid-induced esophophagitis in cats is prevented by sucralfatebut not synthetic prostaglandin E.″，Dig-Dis-Sci.，33217-224(1988)]。
炎症性肠病，如克罗恩氏病(主要影响小肠)和溃疡性结肠炎(主要影响大肠)是病原不明的慢性疾病，其引起粘膜表面的破坏、炎症、修复期间的伤疤和粘连形成和影响个体的显著病症。当前的治疗用来控制炎症，然而，KGF治疗已经显示了在IBD影响的动物中诱导胃肠道上皮细胞的增殖[Housley et al.，J Clin Invest.941764-77，(1994)]。刺激粘膜表面的重铺、引起更快的治愈的治疗剂例如KGF，在控制疾病的进展中可能是有益的。允许具有人类治疗效力的化合物的预示测试的炎症性肠病的标准体内模型是公知的。[Morris，et al.，″Hapten-induced Models of Chronic Inflammation and Ulceration in the RatColon″，Gastroenterology，96795-803(1989)；Rachmilewitz，et al.，″Inflammatory Mediators of Experimental Colitis in Rats″，Gastroenterology，97326-327(1989)；Allgayer，et al.，″Treatment with16，16′-dimethyl-prostaglandin E2 before and after induction of colitiswith trinitrobenzenesulfonic acid in Rats″，Gastroenterology，961290-1300(1989)；″ReviewExperimental Colitis in Animal Models″，Scand.J.Gastroenterol，27529-537(1992)]。
早产儿的透明膜病引起肺内II型肺细胞的表面活性物质生产的缺乏，引起肺泡的坍缩。透明膜病具有急性和慢性期。透明膜病的急性期(婴儿呼吸窘迫综合征-IRDS)用机械通气来治疗，并用80-100％浓度的呼吸用氧气和通过施用外源的表面活性物质来治疗。经历的延长的疗程的那些患者可能发展出透明膜病的慢性疾病阶段(支气管肺发育异常-BPD)。虽然表面活性物质大大地降低了与IRDS相关的死亡率，与BPD相关的病状仍然很高。因而，需要开发有效的治疗来加速新生中肺的成熟和表面活性物质的分泌以降低BPD的发病率。虽然皮质类固醇可以在二十八周龄和更大的胎儿中在很大程度上加速成熟和分泌，当前对于更小的胎儿没有治疗方法，在这些群体中产生显著的病状和死亡率。BPD的历史表明，IRDS治疗中的改善将与甚至更小的早产婴儿的机械通气和在这些较小婴儿中BPD发病率的随后提高匹配。诱导II型肺细胞的增殖和分化的治疗剂如KGF[Yi et al.，Inflammation 22315-25(1998)]将在这些疾病的治疗中具有相当的益处。允许具有人类治疗效力的化合物的预示测试的IRDS的标准体内模型是公知的。Seider，et al.，″Effects of antenatal thyrotropin-releasing hormone，antenatal corticosteroids，and postnatal ventilationon surfactant mobilization in premature rabbits″，Am.J.Obstet.Gynec.，1661551-1559(1992)；Ikegami，et al.，″Corticosteroid and thyrotropin-releasing hormone effects on preterm sheep lung function″，J.Appl.Physiol.，702268-2278(1991)。允许具有人类治疗效力的化合物的预示测试的BPD的标准体内模型是公知的[Yuh-Chin，et al.，″Naturalsurfactant and hyperoxide lung injury in primates I.Physiology andbiochemistry″，J.Appl.Physiol.76991-1001(1994)；and Galan，et al.，″Surfactant replacement therapy in utero for prevention of hyalinemembrane disease in the preterm baboon″，Am.J.Obstet.Gynecol.，169817-824(1993)]。
烟雾的吸入是在烧伤损伤后一周内由于细支气管上皮和肺泡的坏死而发病和死亡的重要原因。刺激这些结构的增殖和分化并诱导它们的修复和再生的生长因子例如KGF将在治疗吸入损伤中有益。允许具有人类治疗效力的化合物的预示测试的烟雾吸入的标准体内模型是公知的。Hubbard，et al.，″Smoke inhalation injury in sheep″，Am.J.Pathol.，133660-663(1988)。
肺气肿是肺泡的渐进性损失引起的。可以刺激重新生长，或对于保持肺泡是细胞保护性的生长因子例如KGF[Kaza et al.，Circulation.106(12 Suppl 1)I120-4(2002)]将有治疗益处。目前，不能获得有效的治疗。允许具有人类治疗效力的化合物的预示测试的肺气肿的标准体内模型是公知的[Stolk et al.，″Induction of emphysema andbronchial mucus cell hyperplasia by intratracheal instillation oflipopolysaccharide in the hamster.″J.Pathol.，167349-56(1992)]。
继发于病毒性肝炎和慢性酒精摄入的肝硬化是发病和死亡的主要原因。例如通过使用KGF对肝细胞的细胞保护、增殖和分化[Danilenki，D.，Toxicol Pathol.2764-71(1999)]来提高肝功能对于减慢和防止肝硬化的发展是有益的。允许具有人类治疗效力的化合物的预示测试的肝硬化的标准体内模型是公知的[Tomaszewski，et al.，″The productionof hepatic cirrhosis in rats″，J.Appl.Toxicol.，11229-231(1991)]。
暴发性肝衰竭是伴随末期肝硬化发生的危急生命的状况。可以诱导剩余肝细胞增殖的试剂例如KGF对于这种疾病将有直接益处，这在当前仅能用肝脏移植来治疗。允许具有人类治疗效力的化合物的预示测试的暴发性肝衰竭的标准体内模型是公知的[Mitchell，et al.，″Acetaminophen-induced hepatic necrosis I.Role of drug metabolism″，J.Pharmcol.Exp.Ther.，187185-194(1973)；和Thakore andMehendale，″Role of hepatocellular regeneration in CC14autoprotection″，Toxicologic Pathol.1947-58(1991)]。
急性病毒性肝炎经常是亚临床的和自我限制的。然而，在少数患者中，严重的肝脏损伤可能在几个星期中产生。细胞保护试剂例如KGF将是在防止肝细胞退化中有用的。
由醋氨酚、氟烷、四氯化碳和其他毒素引起的对肝脏的毒性损害可以通过对于肝细胞是细胞保护性的生长因子(KGF)来改善。允许具有人类治疗效力的化合物的预示测试的肝脏毒性的标准体内模型是公知的[Mitchell，et al.(1973)，supra，and Thakore and Mehendale(1991)，supra)]。
移植物-抗-宿主疾病(GVHD)(慢性的或急性的)是在患者中无效的骨髓或造血细胞移植的主要原因。由于免疫调节和细胞毒性因子的上调，GVHD导致几个器官系统的损伤。GVHD引起对多个区域的损害，包括胃肠道、肺、肝脏、皮肤，和眼中的粘膜腺、口中的唾液腺，和润滑胃粘膜和肠的腺体。在用GVHD诱导的动物中新近的研究表明，rHuKGF治疗的接受者不发展肠GVHD，不发展内毒素血症，并且不死亡[Panoskaltsis-Mortari et al.，“Keratinocyte growthfactor facilitates alloengraftment and ameliorates graft-versus-hostdisease in mice by a mechanism independent of repair of conditioning-induced tissue injury”Blood.964350-6(2000)]。这些数据表明，通过保护由TNF-α、NO和其他可能的细胞毒性因子介导的上皮细胞损伤，KGF阻止了急性致死性GVHD的发展。可以在许多这些细胞类型中诱导上皮细胞增殖的试剂例如KGF将在人类移植接受者中治疗GVHD中有直接益处。
制剂和施用对于在药物制剂中使用来治疗如上所述的人类疾病，KGF蛋白或肽是有用的。KGF可以制备为液体或冻干制剂。在优选的实施方式中，KGF组合物被冻干。冻干可以使用本领域常见的技术来进行，并应当为所开发的组合物进行优化[Tang et al.，Pharm Res.21191-200，(2004)and Chang et al.，Pharm Res.13243-9(1996)]。
冻干循环通常由三个步骤组成冷冻、初次干燥和二次干燥[A.P.Mackenzie，Phil Trans R Soc London，Ser B，Biol 278167(1977)]。在冷冻步骤中，溶液被冷却来启动结冰和完成。此外，这个步骤诱导填充剂的结晶。冰在初次干燥阶段中升华，通过降低室压力低于冰的蒸气压，使用真空并引入热量来促进升华。最后，在降低的室压力和提高的搁板温度下，在二次干燥阶段吸附的或结合的水被除去。该过程产生称为冻干块的材料。此后所述块可以用无菌注射水或合适的多剂量重构溶液在使用之前被重构。
冻干循环不仅确定了赋形剂的最终物理状态，而且影响其他参数，例如重构时间、外观、稳定性和最终含水量。冷冻状态的组合物结构进行经过几个转变(例如，玻璃化转变和结晶)，其在特定温度下发生，可以用来了解和优化冻干过程。玻璃化转变温度(Tg)可以提供关于溶质的物理状态的信息，可以通过示差扫描量热法(DSC)来测定。这是在设计冻干循环时必需考虑的重要的参数。此外，在干燥状态，玻璃化转变温度提供了关于最终产物的保存温度的信息。
在当前组合物的特定实施方式中，稳定剂被添加到冻干制剂来防止或降低冻干诱导的或存储诱导的聚集和化学降解。重构时模糊和混浊的溶液表明蛋白质已经沉淀。术语“稳定剂”是指处于水性或固体状态时能够防止聚集或其他物理降解，以及化学降解(例如，自体分解、脱酰胺基、氧化，等等)的赋形剂。可以使用通常在药物组合物中采用的稳定剂，包括但不限于，蔗糖、海藻糖或甘氨酸[Carpenter etal.，Develop.Biol.Standard 74225，(1991)]。表面活性剂稳定剂，例如聚山梨酯20(Tween 20)或聚山梨酯80(Tween 80)也可以以合适的数量添加来防止冷冻和干燥期间表面相关的聚集现象[Chang，B，J.Pharm.Sci.851325，(1996)]。如果期望，冻干组合物也可以包括适合于形成冻干“块”的合适数量的填充和渗透性调节剂。填充剂可以是晶体的(例如，甘露醇、甘氨酸)或无定形的(例如，蔗糖、聚合物如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素。在一个实施方式中，所述填充剂是甘露醇。在进一步的实施方式中，甘露醇以约2％到约5％w/v的浓度掺入，在更进一步的实施方式中，以约3％到4.5％w/v的浓度掺入，来产生机械上和药学上稳定和精美的块。在另一个实施方式中，甘露醇浓度是2％w/v。
还发现药学上可接受的缓冲液和pH值的选择影响当前组合物的稳定性。选择组合物中存在的缓冲系统为生理上相容的，来维持重构溶液中以及冻干前的溶液中期望的pH值。优选的，缓冲液具有约pH6.0到约pH8.0范围内的pH缓冲能力。一般地进行包括上述参数的一系列筛选研究来选择最稳定的制剂条件。
组合物预计在冻干状态在2℃到8℃稳定至少两年。这种长期稳定性对于延长药物产品的货架期是有益的。
本发明进一步预期用于当前KGF制剂的制备的方法。在一个方面，制备冻干的KGF制剂的方法包括步骤(a)在包含组氨酸、填充剂、糖类和表面活性剂的缓冲液中混合所述KGF组合物；(b)冻干所述KGF。
当前方法进一步包括一个或多个以下步骤在冻干前向所述混合物添加稳定剂，在冻干前向所述组合物添加选自填充剂和渗透性调节剂和表面活性剂的至少一种试剂。所述填充剂可以是以上阐述的任何填充剂。优选的，所述填充剂是甘露醇。糖类可以是以上阐述的任何稳定化糖类。在一个实施方式中，所述稳定剂是蔗糖。表面活性剂可以是以上阐述的任何表面活性剂。在一个实施方式中，所述表面活性剂是聚山梨酯20。
冻干的材料的标准重构操作是回添一定体积的纯水或无菌注射水(WFI)(一般等量于冻干期间除去的体积)，而抗菌剂的稀释溶液有时在肠胃外施用的药物的生产中使用[Chen，Drug Development andIndustrial Pharmacy，181311-1354(1992)]。
冻干的KGF组合物可以被重构为水溶液。各种含水载体，例如，无菌注射水、具有多种剂量用途的防腐剂的水，或具有合适数量的表面活性剂(例如，聚山梨酯20)、0.4％盐、0.3％甘氨酸的水，或含水悬浮液可以含有所述活性化合物，与适合于含水悬浮液的生产的赋形剂混合。这种赋形剂是悬浮剂，例如，羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散或润湿剂可以是天然发生的磷脂，例如卵磷脂，或氧化烯与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸，或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物，例如heptadecaethyl-eneoxycetanol，或环氧乙烷与来源于脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇一油酸酯，或环氧乙烷与来源于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯单油酸山梨醇酐酯。含水悬浮液也可以含有一种或多种防腐剂，例如，乙基或正丙基、对羟基苯甲酸盐。
为了向人类或试验用动物施用本发明的组合物，优选的是在包含一种或多种药学上可接受的载体的组合物中配制组合物。术语“药学上”或“药理学上可接受的”是指分子实体和组合物是稳定的，抑制蛋白质降解例如聚集和切割产物，此外当使用如下所述本领域公知的途径施用时不产生过敏性，或其他有害反应。“药学上可接受的载体”包括任何和所有临床上有用的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟试剂等等，包括以上公开的那些试剂。
可以口服地、局部地、经皮地、胃肠外地、通过吸入喷雾、阴道地、直肠地或通过颅内的注射来施用角质形成细胞生长因子组合物。如在此使用的术语胃肠外的包括皮下注射、静脉内、肌肉内、脑池内注射或输注技术。静脉内、皮内、肌肉内、乳房内、腹膜内、鞘内、眼球后、肺内注射或在特定部位的外科植入也是预期的。一般地，组合物基本上不含致热原，以及对接受者有害的其他杂质。
药盒作为另外的方面，本发明包括药盒，其包含以便于它们向受试者施用来使用的方式封装的一种或多种化合物或组合物。在一个实施方式中，这种药盒包括在此描述的化合物或组合物(例如，包含角质形成细胞生长因子的组合物)，封装在容器中，例如密封的瓶子或容器，具有附着在容器上或包括在包装中、描述在实践所述方法中使用该化合物或组合物的标签。在一个实施方式中，所述药盒含有第一容器，其具有冻干的角质形成细胞生长因子组合物，和第二容器，其具有用于所述冻干的组合物的生理学可接受的重构溶液。优选的，所述化合物或组合物以单位剂型封装。所述药盒可以进一步包括适合于根据特定施用途径来施用组合物的设备。优选的，所述药盒含有描述所述角质形成细胞生长因子组合物的用途的标签。
根据以下实施例，本发明的其他方面和细节将是明显的。
实施例1KGF的液体制剂产品稳定性、货架期和生物活性对于任何治疗效力的组合物是重要的方面。设计和配制当在建议的贮存温度保存延长的时间期是稳定的、但保持了显著的生物学活性的组合物，是药物组合物的关键元素。
在先前的实验中，KGF的液体制剂显示了在升高的温度(37℃)下显著的聚集和随后的蛋白质损失。为了确定为KGF组合物提供了最大稳定性的pH值，在3.0到9.0的pH值范围上测试了角质形成细胞生长因子的液体制剂的pH值。
在以下的实验，例如，实施例1-3中使用的KGF是ΔN23 KGF分子。使用浓缩的HCl或氢氧化钠调节溶液的pH值。在37℃孵育后的时间0、6和28小时采集不同pH值的KGF制剂(0.5mg/ml，10mM缓冲液，0.1M NaCl))的样品(附图1)。通过SE-HPLC(附图1A)或通过CE-HPLC(附图1B)测量回收的蛋白质的百分比。对于大小排阻HPLC(SE-HPLC)，将样品(40μg)加样到连接于HP 1090/1050机器的G2000SWx1柱(7.8mm×30cm)上。使用pH7.0的20mM磷酸钠(NaP)，1M NaCl洗脱蛋白质。通过215nm处的吸光度监视蛋白质。单体的峰值表明在KGF制剂中几乎没有聚集物。
阳离子交换(CE)-HPLC在装备有Mono-S柱的HP 1090/1050上在室温下进行。40μg KGF蛋白质装载到柱上，使用pH8.0的20mM磷酸钠缓冲液和盐梯度(1M NaCl)来洗脱。通过215nm处的吸光度监视洗脱的蛋白质。
反相HPLC(RP-HPLC)在HP 1090/1050机器上使用来自Vydac的、孔径大小300A的C4柱(4.6×250mm)进行。将蛋白质(30μg)注射到柱上，使用具有0.1％三氟乙酸(TFA)(v/v)和90％ ACN，水中的0.1％ TFA(v/v)的乙腈(ACN)梯度来洗脱。通过215nm处的吸光度监视蛋白质峰。
在pH5.0到9.0范围上在时间0观察到蛋白质的完全回收。然而，由于即时的沉淀，在pH3.0观察到完全的蛋白损失，pH4.0引起约80％的蛋白损失。在37℃6小时之后，从pH4.0样品没有获得可溶的蛋白质。当可溶的KGF被配制在pH5到9时，在37℃下28小时后回收的蛋白质百分比是低于20％。然而，在pH7.0，仅20％的总蛋白质损失了。在37℃在28小时后可溶蛋白质的损失主要是由于聚集。
这些结果表明液体制剂中的KGF蛋白在中性pH值是最稳定的，然而即使在该最佳的pH范围中，作为液体来保持KGF由于聚集引起了显著的蛋白质损失。
实施例2用于冻干的KGF组合物的制剂为了开发更稳定的KGF组合物，决定将KGF配制为冻干的产品。配制冻干的KGF组合物的早先的努力包括操作重构溶液，产生了取决于重构溶液的组成产生较少蛋白聚集的组合物[Zhang et al.，Pharm.Res.121447-52(1995)]。然而，在这个早先的研究中，在重构期间所见的任何聚集很难或不可能被逆转。
这个实施例描述了在溶液中冻干蛋白质，其将防止在重构时独立于重构溶液的聚集，来消除对常规重构溶液的需求。
为了确定稳定的冻干制剂的组成，在改变的条件下冻干KGF，例如ΔN23 KGF，改变参数例如pH值、填充剂、糖类浓度和表面活性剂浓度。然后在建议的储存温度下测定KGF的长期储存稳定性。
冻干循环为了冻干，将样品装载到预先冷却到约4℃的室温度的VirTisGenesis 12 EL试验规模(VirTis，Gardiner，N.Y.)冷冻干燥器中。样品被快速地冷冻(约1℃/分钟到-50℃)并保持在该温度至少2小时。一旦样品被置于冷冻干燥器中，搁板温度以大约27℃/小时的速度降低到-50℃。样品保持在-50℃2小时以确保完全冷冻。在结晶甘露醇的可选的步骤中，搁板温度以10℃/小时的速度升高到-25℃，平衡2-3小时，然后以9℃/小时的速度冷却到-55℃。在另外保持至少2小时之后，施加大约100mTorr的真空。搁板温度升高到-35℃用于初次干燥，但可以在-45℃到-10℃的范围内。初次干燥持续40小时，但可以在24-48小时的范围内。搁板温度然后以5℃/小时的速度升高到+20℃到+25温度用于二次干燥，真空度降低到大约50mTorr)。二次干燥进行36小时，但可以是进行24-72小时的任何时间。在二次干燥完成时，在真空(≤25mTorr)下闭塞样品，从冰冻干燥器上移除小瓶。将小瓶压切去头并置于各种温度下用于稳定性测试。
pH值对冻干的KGF的稳定性的影响首先评定在一定pH值范围内的KGF稳定性。在pH6.0、pH6.5或pH7.0下，在包含10组氨酸、3％甘露醇、2％蔗糖和0.01％聚山梨酯20的溶液中配制KGF(5mg/ml)。预先冻干的样品的SE-HPLC表明了99％的主峰百分比，其相应于99％的单体活性成分。
为了进行加速的稳定性研究，将一些样品转移到恒温箱保存。其他样品转移到-70℃冰箱作为对照物。小瓶的大部分保存在4℃。在分析之时，用1.2mL无菌注射水(WFI)重构样品。
在45℃保存6个月后的冻干的KGF样品的SE-HPLC表明，在所有测试的pH下样品的主峰百分比是大约97.5％，表明在6.0到7.0的pH范围内冻干的KGF组合物在高温下保存6个月后是稳定的。这些研究还表明了当制剂保存在4℃时5.0到8.0的pH值范围提供了稳定的蛋白。
蔗糖浓度对KGF稳定性的影响为了评定为冻干的KGF提供最大稳定性的蔗糖的量，将重组人类KGF(1mg/l)配制在pH7.0、缺乏蔗糖或者具有2％蔗糖(w/v)的溶液中包含10mM组氨酸、3％甘露醇的组合物中。如上冻干样品并容许在45℃孵育直至3个月。
有或没有蔗糖的KGF制剂的主峰百分比的SE-HPLC测量表明，添加2％蔗糖为冻干的KGF制剂提供了显著的稳定性。用2％蔗糖冻干的KGF展现了紧接着冻干之后的大约99.5％主峰，和在冻干后1个月和3个月时的98.5％主峰。缺乏蔗糖的制剂展现了在冻干后1个月和3个月分别大约96％主峰和大约93.5％主峰。
这些结果表明，在没有蔗糖的制剂中，在45℃保存3个月之后活性单体峰值百分比降低7％，而在具有蔗糖的制剂中单体峰值中仅有很小的降低。因此，当添加到冻干的制剂时，蔗糖作为对KGF有力的稳定剂起作用。
使用包含10mM组氨酸、pH6.5、1％到3％蔗糖的蔗糖浓度范围上的KGF冻干产物进行进一步的分析，其中溶液总是用合适百分比的甘露醇维持等渗性。具有1％-3％蔗糖并在37℃保存一年的冻干产物显示了与2％蔗糖的制剂相当的蛋白质稳定性，对所有测试的制剂，主峰百分比保持99％以上。
聚山梨酯20浓度对KGF稳定性的影响在KGF的冻干制剂中聚山梨酯20的浓度根据它在重构时消除颗粒形成的能力来选择。将重组人类KGF配制在包含10mM组氨酸、3％甘露醇、2％蔗糖、pH7.0的组合物中并冻干。然后在含有变化浓度的聚山梨酯20的溶液中重构KGF。冻干的块包括如上配制的5mg/mlKGF。表1说明了在重构时冻干制剂的记录的观察结果。
表1
进一步的研究显示，与在重构溶液中添加聚山梨酯20相比，冻干之前在块中包括聚山梨酯20的制剂在45℃4个月后是相等地稳定的。SE-HPLC分析[Biorad Biosil SEC 125(7.8mm×30cm)，20mMNaP，pH7.0，1M NaCl，40μg注射装载]显示，在0、1和4个月，对于所有测试的聚山梨酯浓度(如表1)单体KGF的损失可以忽略。根据它在重构时一致地消除可见颗粒的能力选择0.01％(w/v)的浓度用于包括在制剂中。
甘露醇浓度对KGF稳定性的影响将甘露醇和其他填充剂包括在制剂中来获得良好的块外观和质量。此外，它们帮助维持具有生理性液体的药物组合物的等渗性。例如，生理性液体具有290-320mOsm的摩尔渗透压浓度。最终的KGF制剂中甘露醇浓度调节到与生理性液体等渗。
为了评定在冻干制剂中提供蛋白质稳定性的甘露醇浓度百分比，在包含10mM组氨酸、2％蔗糖和0.01％聚山梨酯20，pH7.0，以及3％甘露醇或4％甘露醇的制剂中冻干3mg/ml的KGF。冻干KGF制剂并在4℃保存1年。使用来自Advanced Instruments(Norwood，MA)的Osmometer Model 3D3测量摩尔渗透压浓度。4％甘露醇溶液的测量的摩尔渗透压浓度是312mOsm，而3％甘露醇制剂产生250mOsm的溶液。
附图2显示了在零时间(附图2A)或4℃保存1年后(附图2B)与稍微低渗的3％甘露醇/2％蔗糖制剂相比，等渗的4％甘露醇/2％蔗糖制剂的反相(RP-HPLC)层析图的覆盖图。结果表明，在2到8℃的建议的储存温度1年后，等渗的制剂是稳定的。此外，等渗制剂的块外观也很好，它的含水量是低于2％。根据这项研究，4％甘露醇推荐用于冻干制剂中。
蛋白质浓度对rHuKGF稳定性的影响冻干样品中的蛋白质浓度也可能对蛋白质的冻干质量稳定性以及重构产物的稳定性有影响。
在0.5、1、2、3和5mg/ml探索KGF浓度对稳定性的影响。在10mM组氨酸、3％甘露醇、2％蔗糖和0.005％聚山梨酯20、pH6.5中配制和冻干样品。冻干样品在重构前在45℃保存24周。通过SE-HPLC、RP-HPLC、CE-HPLC和SDS-PAGE监视蛋白质降解。对于这个实验，使用HP系统和G2000SWx1柱如上进行SE-HPLC。
附图3显示了在45℃保存24周后KGF的SE-HPLC分析的作为蛋白质浓度的函数的主峰百分比。短划线表示测量数据的走向线。根据SE-HPLC数据，稳定性随着KGF浓度的提高而提高，至少直到5mg/ml的浓度。通过RP-HPLC和CE-HPLC测定的主峰百分比对蛋白质浓度的依赖性与用SE-HPLC所见的类似。进一步的研究表明，15mg/mL的蛋白质浓度也产生了稳定的冻干制剂。
包含10mM组氨酸、0.01％聚山梨酯20、2％蔗糖和3％甘露醇、pH6.5的优化的KGF冻干制剂在2到8℃保存了超过4年。在重构时，KGF制剂显示维持了如下测试的KGF活性，表明特定的组合物维持了治疗有效的药物组合物所必需的稳定性和活性类型。
实施例3重构的KGF制剂的生物测定药学上有效的产物的制剂中因素之一是对高生物学活性的目标蛋白质的需求。
KGF，例如ΔN23 KGF制剂的生物活性使用32D KECA克隆16细胞来测试，其是在KGF的存在下增殖的IL-3依赖性鼠原淋巴细胞，类似于32D克隆3细胞(ATCC#CRL-11346)，是有用的增殖分析系统，如Hsu et al.，1999 Biochemistry，38，2523-2534中所描述的。
32D克隆16细胞在37℃和5.5％ CO2维持在生长培养基[RPMI，胎牛血清(10％)(Hyclone，Logan，UT)，谷氨酰胺(1％)(Gibco/Invitrogen，Carlsbad，CA，)，遗传霉素(2％)(Gibco)和鼠IL-3(12ng/mL)(Biosource International，Camarillo，CA)]中。在分析培养基[RPMI，FBS(6％)，谷氨酰胺(1％)，肝素(0.6μg/ml)(Sigma，St.Louis，MO)]中将样品KGF制剂或参考标准物(在-70℃冻干保存的ΔN23 KGF)重构到大约25ng/mL。然后进行连续稀释来获得从大约25ng/ml到1.6ng/ml的浓度范围。
为了测试KGF制剂的生物活性，32D克隆16细胞以2.0×105细胞/mL的150μL平板接种。期望浓度的参考标准物、对照物和KGF测试样品以50μL体积添加到样品孔中。细胞和样品的平板在37℃和5.5％ CO2下培养大约24小时。在第2天，将40μL Alomar Blue(AccuMed International，Chicago，IL)添加到所有孔中并混合。在37℃和5.5％CO2下将平板孵育另外24小时。24小时后，使用530-560nm的激发波长和590nm的发射波长在Fluorescence Reader(CytofluorII或Cytofluor Series 4000，PerSeptive Biosystems，Framingham，MA)上测量荧光。
在2到8℃下保存7天的3个重构份的冻干的KGF制剂显示了与参考标准KGF蛋白质(在-70℃冻干保存的)类似的生物活性，在第0天展现了≥100％生物活性，在第7天分别为92％、100％和107％活性。与天然KGF相比，在25℃保存的KGF制剂在时间0显示了≥100％生物活性，在4小时后其分别稍微降低到90％、95％和100％生物活性。在25℃保存重构的KGF制剂24小时后也维持了这种活性水平，表明了KGF制剂的稳定性。
这些结果表明，在此描述的重构的KGF制剂与参考标准KGF蛋白质一样有效，制剂对于KGF例如ΔN23KGF的稳定性没有有害效果，因而在治疗个体以促进上皮细胞等等的生长中作为治疗是有用的。
此外，通过重构制剂促进Balb/C-MK细胞的生长的能力，可以评定KGF生物活性。在补充有10％胎牛血清、0.25μg/ml两性霉素B和10ng/ml aPGF的低钙Dulbecco改良的Eagle培养基中生长和维持Balb/MK细胞的储用培养物。在10％CO2、99％湿度的大气中在37℃孵育细胞。对于生物活性分析，如Gospodarowicz et al[J.Cell.Physiol.142325-333(1990)]中描述的，将细胞以5×103个细胞每孔的密度在1ml培养基中接种到12孔平板上。将预定数量的KGF制剂添加到细胞培养孔。FGF用作阳性对照。
培养五天后，将细胞胰蛋白酶消化，使用细胞计数器测定最终的细胞密度。通过用含有0.9％NaCl、0.01M磷酸钠(pH7.4)、0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA(STV)的溶液替换培养基来从平板上释放细胞，在37℃孵育5-10分钟，然后将储用培养物培养基添加到细胞。
与未处理的细胞相比在KGF处理的样品中Balb/C-MK细胞群体的增加显示了KGF组合物在配制过程期间不损失它的生物活性，表明KGF制剂提供了有效的治疗剂来治疗需要提高的KGF活性的受试者。
如上述说明性实例中阐述的本发明的许多修饰和变型预计是本领域技术人员能想到的。因而，如附随的权利要求中出现的这种限制应当置于本发明之上。
序列表<110>AMGEN INC.
<120>角质形成细胞生长因子的治疗制剂<130>01017/40453<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>3853<212>DNA<213>homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(446)..(1030)<400>1acgcgctcac acacagagag aaaatccttc tgcctgttga tttatggaaa caattatgat 60tctgctggag aacttttcag ctgagaaata gtttgtagct acagtagaaa ggctcaagtt 120gcaccaggca gacaacagac atggaattct tatatatcca gctgttagca acaaaacaaa 180agtcaaatag caaacagcgt cacagcaact gaacttacta cgaactgttt ttatgaggat 240ttatcaacag agttatttaa ggaggaatcc tgtgttgtta tcaggaacta aaaggataag 300gctaacaatt tggaaagagc aactactctt tcttaaatca atctacaatt cacagatagg 360aagaggtcaa tgacctagga gtaacaatca actcaagatt cattttcatt atgttattca 420tgaacacccg gagcactaca ctata atg cac aaa tgg ata ctg aca tgg atc 472Met His Lys Trp Ile Leu Thr Trp Ile1 5ctg cca act ttg ctc tac aga tca tgc ttt cac att atc tgt cta gtg 520Leu Pro Thr Leu Leu Tyr Arg Ser Cys Phe His Ile Ile Cys Leu Val10 15 20 25ggt act ata tct tta gct tgc aat gac atg act cca gag caa atg gct 568Gly Thr Ile Ser Leu Ala Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala30 35 40aca aat gtg aac tgt tcc agc cct gag cga cac aca aga agt tat gat 616Thr Asn Val Asn Cys Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp45 50 55tac atg gaa gga ggg gat ata aga gtg aga aga ctc ttc tgt cga aca 664Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr60 65 70cag tgg tac ctg agg atc gat aaa aga ggc aaa gta aaa ggg acc caa 712Gln Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln75 80 85gag atg aag aat aat tac aat atc atg gaa atc agg aca gtg gca gtt 760Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val90 95 100 105gga att gtg gca atc aaa ggg gtg gaa agt gaa ttc tat ctt gca atg 808
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<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(31)<223>信号肽<400>2Met His Lys Trp Ile Leu Thr Trp Ile Leu Pro Thr Leu Leu Tyr Arg1 5 10 15
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权利要求
1.一种冻干的角质形成细胞生长因子(KGF)组合物，其包含缓冲剂组氨酸、填充剂、糖类和表面活性剂。
2.权利要求1的组合物，其中所述角质形成细胞生长因子选自由SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和其变体构成的组。
3.权利要求1的组合物，其中所述KGF包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
4.权利要求1的组合物，其中所述KGF包含SEQ ID NO3中列出的ΔN23 KGF。
5.权利要求1的组合物，其中所述填充剂是甘露醇。
6.权利要求5的组合物，其中所述甘露醇是约2％到约5％w/v的浓度。
7.权利要求6的组合物，其中所述甘露醇是4％w/v的浓度。
8.权利要求1的组合物，其中所述糖类是蔗糖。
9.权利要求8的组合物，其中所述蔗糖是约1％到约3％w/v的浓度。
10.权利要求9的组合物，其中所述蔗糖是2％w/v。
11.权利要求1的组合物，其中pH值在约6.0到约8.0的范围内。
12.权利要求11的组合物，其中pH值在约6.0到约7.0的范围内。
13.权利要求12的组合物，其中所述pH值是约6.5。
14.权利要求1的组合物，其中所述表面活性剂是聚山梨酯20。
15.权利要求14的组合物，其中所述聚山梨酯20浓度在约0.1％到约0.004％w/v的范围内。
16.权利要求15的组合物，其中所述聚山梨酯20浓度是0.01％w/v。
17.权利要求1的组合物，其中KGF浓度在3mg/mL到15mg/mL之间。
18.权利要求17的组合物，其中KGF浓度是5mg/mL。
19.一种冻干的角质形成细胞生长因子组合物，其包含10mM组氨酸、4％甘露醇、2％蔗糖和0.01％(w/v)聚山梨酯20，其中所述组合物的pH值是6.5。
20.生产冻干的角质形成细胞生长因子的方法，其包括步骤a)制备组氨酸、填充剂、糖类和表面活性剂的溶液；和b)冻干所述KGF。
21.权利要求20的方法，其还包括在冻干之前的下列步骤b)调节溶液的pH值到约6.0到约8.0之间的pH值；c)制备含有角质形成细胞生长因子的溶液；d)缓冲液交换步骤(c)的溶液成步骤(b)的溶液；e)添加合适量的表面活性剂，和f)冻干来自步骤(e)的混合物。
22.权利要求20或21的方法，其中所述角质形成细胞生长因子选自由SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和其变体构成的组。
23.权利要求20或21的方法，其中所述角质形成细胞生长因子包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
24.权利要求20或21的方法，其中所述角质形成细胞生长因子包含SEQ ID NO3中所列的ΔN23 KGF。
25.权利要求21的方法，其中所述表面活性剂是聚山梨酯20。
26.一种通过提高上皮细胞生长的KGF介导的刺激用于治疗疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的权利要求1的冻干的角质形成细胞生长因子。
27.权利要求26的方法，其中所述疾病是肠毒性；粘膜炎；烧伤或其他部分和完全的深层损伤；毛囊、汗腺和皮脂腺的再生；附件结构增生；大疱性表皮松解；化学疗法诱导的脱发；男性型秃发；胃溃疡；十二指肠溃疡；糜烂性胃炎、食菅炎或食管回流；炎症性肠病；透明膜病；烟雾吸入的损伤；肺气肿；肝硬化、肝衰竭、急性病毒性肝炎、对肝脏的其他有毒损害；或移植物-抗-宿主疾病(GVHD)。
28.一种用于制备含水药物组合物的药盒，其包含具有冻干的角质形成细胞生长因子组合物的第一容器，和具有用于所述冻干组合物的生理学上可接受的溶剂的第二容器。
29.权利要求28的药盒，其中所述角质形成细胞生长因子选自由SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和其变体构成的组。
30.权利要求28的药盒，其中所述角质形成细胞生长因子包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
31.权利要求28的药盒，其中所述角质形成细胞生长因子包含SEQ ID NO3中所列的ΔN23 KGF。
全文摘要
本发明提供了冻干的角质形成细胞生长因子的长期稳定的制剂，和制备包含角质形成细胞生长因子的冻干组合物的方法。
文档编号A61K47/18GK101084008SQ200580043314
公开日2007年12月5日 申请日期2005年12月12日 优先权日2004年12月15日
发明者M·J·特洛伊黑特, V·达马瓦拉姆, J·普尔特尔, S·E·罗伊 申请人:安姆根有限公司