对眼无刺激的含碘药剂及其制备方法

专利名称：对眼无刺激的含碘药剂及其制备方法
技术领域：
本发明领域本发明是1995年1月1日递交的序号为08/551,478的部分继续申请，其为1994年10月17日递交的序号为08/324391的部分继续申请，并且一般涉及以无毒和无刺激性的杀菌碘为基础的杀微生物剂的酶的形成，其可杀灭为哺乳动物眼组织中和眼组织上的污染物的病原体。
背景技术：
为了杀灭为哺乳动物眼组织中和眼组织上的污染物的病原体，通过过氧化物酶催化的碘化物和过氧化物之间的反应，按照本发明原位产生作为杀生物药剂的自由分子碘。常见的污染物包括细菌、病毒和真菌。抗生素通常用于治疗眼部感染。抗生素不是广谱药剂。没有抗生素能有效对抗细菌、病毒和真菌。抗生素的广泛使用也导致产生对抗生素耐药的病原。优选的眼部抗感染剂将是广谱的并且不产生耐药病原。
在医疗行业和生物医药工业中已使用大量不同的化学杀菌剂来杀灭不需要的细菌、病毒和真菌。这些化学杀菌剂的大部分对有机体物质是有毒性的或有破坏性的，结果这些消毒剂并不适用于敏感的生物材料，如人的眼睛。美国专利号5,185,371描述了一种消毒血液制品的方法，其有赖于将杀菌剂稀释到下列成分之一中0.9％氯化钠水溶液、5％葡萄糖水溶液、糖溶液或其它能改善液体杀菌剂与血液和血液制品的化学不相容性的稀释剂。
F.A.Highsmith等(Joumal of Infectious Diseases，1993年，167卷，1027页)描述了利用化学改性的聚乙烯吡咯烷酮-碘复合物的方法。Highsmith描述的该组合物及方法已被用于消毒血液制品。Highsmith的组合物含有大量的，包括自由分子的碘的碘类物质。
涉及用碘消除敏感生物材料污染的所有的先有技术是利用碘伏。碘伏是利用聚维酮-碘或别的化学复合物或含碘物质与高分子量的聚合物结合的组合物。与不含有与碘结合的高分子量聚合物的自由分子碘组合物相比，碘伏的使用增加了灭活病菌所需要的碘类物质的绝对浓度。对于敏感生物材料的消毒，碘伏并不是优选的碘的形式，因为所有形式的碘均有毒性。就那些组成人眼的敏感的活细胞而言，杀生物活性与毒性之间存在着冲突。在这点上，先有技术没有直接提出需要有效地利用碘来消毒敏感生物材料的临界参数。
尽管碘伏已用于消毒人的眼睛，但自由分子碘相对于其它碘类物质的比率仍低于1/100。按照本发明自由分子碘应控制在这种水平，即当多种碘类物质同时出现时，自由分子碘应为主要的碘类物质，按摩尔计其具有相对于其它碘类物质至少25％以上的自由分子碘的优选浓度。优选自由分子碘的浓度为5和330ppm之间，并且可以通过在水介质中将过氧化物酶、碘化物和过氧化氢进行酶反应原位形成。在将杀微生物剂用于人眼以前，优选过氧化氢对碘化物的比率为不大于4，并且优选过氧化氢的最大浓度水平为不大于0.015％，以使治疗能有效杀灭人眼中所有不需要的病原体。此外，更优选将自由分子碘的水平实际维持在对眼无损害或刺激的pH和离子强度的条件下。
为了使自由分子碘起效，必须将这一杀生物药剂的水平实际维持一段时间，以使其足以杀灭所有不需要的病原体。然而，也必须控制自由分子碘的化学活性，以便基本保持重要的生物材料的完整性。由于杀生物活性和生物学相容性的矛盾属性，将其它有毒性和化学不相容性而又不具有必需的杀生物效用的碘类物质排除或减至最少则是重要的。此外，其它非杀生物的细胞毒性化学制剂的浓度也应减至最少，因为它们可成为潜在的刺激和不相容性的来源。
与绝大部分这一应用下考虑的生物材料最相容的pH是6.8至7.1。尽管并非必需在7.0的pH时去除眼组织污染，但最优选维持pH尽可能地接近7.0以便使潜在刺激减至最小。中性pH引起另外的因素，使自由分子碘在消毒中的使用变得复杂。自由分子碘在中性pH中不稳定，结果，治疗的持续时间就是一个重要的参数。
在美国专利号5,185,371中认定的消毒剂之一是10％聚维酮-碘(povidone-iodine)，其通常表示为PVP-I2。PVP-I2是碘与聚维酮的复合物。其含有硫代硫酸盐可滴定碘的重量不少于9.0％和不大于12％。此外，PVP-I2通常含有碘化物离子的重量不超过6.6％。另外，通常将碘酸盐和其它无机类物质加入到PVP-I2中。市售PVP-I2来自许多不同的厂家，并且这些产品的pH依厂家不同而变化。然而，在通常范围为pH3.5和4.5之间的酸性环境下，PVP-I2被强烈缓冲。
在PVP-I2中碘类物质的分布并非有利于其对敏感生物材料的使用。PVP-I2并不是优选的用于生物材料的杀菌剂，因为在这种组合物中仅含有低于0.2％的碘是以自由分子碘的形式存在。此外，这些组合物的pH对在这一应用下所考虑的绝大部分的细胞和组织均有毒性。PVP-I2是被设计直接用于未受损的皮肤。哺乳动物的表皮由死细胞构成，其与活细胞相比对刺激的化学物质明显地较少敏感。
美国专利号5,185,371描述了用浓度范围为重量的0.01％到0.5％的PVP-I2处理血液和血液制品持续达5分钟。该申请规定PVP-I2的浓度范围相当于PVP-I2的1/200到1/10,000稀释液。当PVP-I2以生理盐水稀释到1/200时，所得溶液的pH是4.6，并且自由分子碘的水平是10ppm。当PVP-I2以生理盐水稀释到1/10,000时，所得溶液的pH是-5.4，并且自由分子碘的水平是-0-0.5ppm。在竞争性生物负荷(competing bioburden)存在的情况下，美国专利号5,185,371中描述的自由分子碘、pH和接触时间的联合作用并不足以有效地杀灭绝大部分的目标细菌和病毒。已知需要非常大剂量的碘和/或延长接触时间才能完全杀灭非脂质包裹的病毒(Highsmith F.A.等，Transfusion，1994年，34卷，322页)。
因此，目前需要提供一种以碘为基础的方法来消毒敏感生物材料，如哺乳动物的眼组织。已制成以碘为基础的组合物来消毒敏感生物材料，但这些组合物具有几个弊端。碘是一种有效的杀生物剂并且不象其它的杀生物剂那样，碘对于正常的人类营养和甲状腺功能是需要的。先前的以碘为基础的组合物的困难在于其具有不利的pH和离子强度的特性，并且活性杀生物碘(即自由分子碘)是(a)与其它非杀生物的化学类物质结合，和(b)不是主要的碘类物质。
本发明概述在5和330ppm之间的浓度范围内产生自由分子碘的条件下，通过产生以碘为基础的消毒剂来完成本发明的目标。这种碘组合物能在与眼组织最大相容的水性环境中形成。令人惊奇的是，该溶液不仅消毒生物制品，而且可无损害地消毒目标材料。目前认为本发明的消毒剂组合物将对诸如人眼这样的敏感生物材料提供保护，即杀灭可能存在的有害细菌、病毒和类病毒物质。
以碘为基础的杀菌剂是本领域熟知的。通常在这一应用中生产以碘为基础的杀菌剂的方法是在碘化物和过氧化氢结合时使用过氧化物酶。从Kessler(美国专利号4,227,161，美国专利号5,169,455，美国专利号4,996,146和美国专利号4,937,072)、Orndoff(美国专利号4,370,199)和Montgomery(美国专利号4,576,817)中得知，过氧化物酶、过氧化物和碘化物阴离子的结合将在水性环境中形成杀菌剂。当过氧化物酶、过氧化氢和碘化物在溶液中反应时，该组合物的杀菌效果取决于发生的酶的反应。已知过氧化物酶引起电子从碘化物到过氧化氢的转移。通过这个反应过氧化氢转化为水。假定碘化物阴离子有几个可能的反应产物，包括1)碘自由基(Nunez和Pommier，European Journal of Biochemistry，1969年，第7卷，第286-293页)；2)次碘酸盐离子(Morrison和Schonbaum，Annual Review ofBiochemistry，1976年，第45卷，第861-888页)；3)碘鎓离子(Ohtaki，Nakagawa，Kimura和Yamakazi，Journal of Biochemistry，1981年，第256卷，第805-810页)。
已经观察到，在一定条件下，该反应将产生显著水平的自由分子碘，其中所述自由分子碘在现有的所有碘类物质中占有显著百分比。短语“自由分子碘”是本领域的术语，指元素碘，以I2表示的化学物质，它可用硫代硫酸钠滴定。已观察到使用含有过氧化物酶、过氧化物和碘化物的组合物可能在一个较大pH范围内产生限定水平的自由分子碘，在这些组合物中可获得的碘的精确水平与过氧化物、碘化物、过氧化物酶、缓冲剂、pH和其他添加剂的浓度水平相关。
如果对诸如人眼的材料消毒，则可以理解消毒剂组合物必须基本上等渗，以便将毒性减到最低。消毒剂的浓度和有效杀灭任何病原性微生物所需的时间取决于终环境中自由分子碘的水平。自由分子碘的合适浓度与疾病状态和治疗方案密切相关，通常自由分子碘的浓度的合适范围是从5到330ppm。杀灭目标致病性微生物所需的时间与自由分子碘的水平、目标病原体和组合物中的生物材料的水平密切相关。
为将本发明消毒哺乳动物眼睛付诸实践，需要考虑几个重要因素。高度优选将所述组合物制备成与人的泪液等渗。可选择地，将该组合物的离子强度控制在280和300毫渗透分子之间。本领域技术人员懂得可通过在组合物中加入诸如氯化钠的试剂来达到上述目的。象许多其它为本领域技术人员所熟悉的多聚物一样，诸如羟乙基纤维素、甲基纤维素和聚乙烯醇等多聚物也经常被用于眼用组合物中。这些原料对本申请中所公布的组合物是合适的，条件是它们并不是以实际增加需要达到所需杀生物活性的碘的总浓度的方式结合。在本申请下设计的所述眼用组合物包括由病毒、细菌、真菌和棘阿米巴属引起的疾病。
在自由分子碘接触目标敏感性生物材料后，允许自由分子碘通过在组合物中的水解作用而降解，此外，可通过许多途径将该组合物中的碘分离出来，这些为本领域技术人员所熟悉的途径包括加入象环化糊精这类可以结合碘的原料或者将该组合物通过含碘结合材料的柱，或者通过在组合物中加入碘还原剂如乳糖，可起到缓慢还原碘的作用。本发明详述对人眼中不需要的致病性微生物的杀灭是基于一个不经意的发现，即哺乳动物的眼睛对自由分子碘浓度的升高是相容的。
根据本发明，自由分子碘是原位产生并且与目标眼组织接触。需要和眼组织接触的自由分子碘的水平在5和330ppm之间，即相当于碘化物阴离子在25ppm和1660ppm之间的输入水平。自由分子碘的浓度应至少是现有的可用硫代硫酸盐滴定的碘的25％。本领域技术人员明白，自由分子碘和三碘化物的比例以及自由分子碘和可用硫代硫酸盐滴定的碘的比例可以是变化的。本领域技术人员也认识到，无论是最小还是最大，不同的浓度限制因素可存在于自由分子碘和三碘化物两者中，随特殊应用而定。当25％表示自由分子碘和总碘的最小比例时，它也可用于确定配方中的进一步的限制，这构成与可呈现的被硫代硫酸盐滴定的碘的最大浓度有关的本申请，所述限制可用于维持本申请的组合物的可接受的毒理学范围。即使自由分子碘超过现有总碘的40％，所述可用硫代硫酸盐滴定的碘的浓度也不应高于650ppm。
水相环境的pH必须控制在pH5.0和7.1之间，处理目标生物材料的优选pH范围在pH6.0和7.0之间，自由分子碘被给予的频率变化很大，并取决于组合物中有机原料的水平和疾病状态，必须由经验推导治疗任何特殊疾病状态时给药的频率。
通过应用过氧化物酶、碘化物和过氧化物源引入自由分子碘。显然所用自由分子碘的浓度必须足以杀灭污染的病原体；然而，较不明显的并且同样重要的是产生以碘为基础的、其主要成分是自由分子碘的杀菌剂。通过将目标材料与主要由自由分子碘组成的碘组合物接触，可使潜在的化学不相容性和毒性减至最小。在以碘为基础的杀菌剂在水性环境中活化后，自由分子碘在存在的所有碘类物质的摩尔基础上应至少占有25％。
必须控制含有过氧化物酶催化的碘化物的氧化作用的反应物以产生合适的结果。应建立可有效地将碘化物离子转化为自由分子碘的反应。此外，优选建立这样的反应条件，即能将至少50％的初始浓度的过氧化氢转化为水，并且在酶反应开始后，与眼组织接触的残留的过氧化氢的浓度不高于0.015％的水平；这就防止了对眼的刺激。为了最佳地将碘化物转化为自由分子碘，应将过氧化氢与碘化物的摩尔比最初建立在1/2摩尔比例中。最优选限制该比例不大于4。
本发明优选的氧化剂是过氧化氢。当混合在水性环境中时，任何可起过氧化氢源作用的原料均适合于本发明。对本发明来说以及如此处所使用的术语“过氧化物源”将意味着任何能作为过氧化氢前体的单独或结合的原料，包括金属过氧化物、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过氧酯、过氧化脲、过氧酸、烷基过氧化物、酰基过氧化物和过硼酸盐。可任选甲基、乙基和其它高分子量的过氧化物用于过氧化氢的来源，但这些不是优选的。也可使用两种或多种这些物质的混合物。在碘化物的氧化反应开始以前的最终组合物中，过氧化氢的优选浓度是在0.001和0.01％之间。
本发明的供体分子是碘化物阴离子。本发明碘化物阴离子的合适的干燥来源包括碘化钠和碘化钾，以及其他碘化盐。可溶解于水相环境中而产生碘化物阴离子的任何化合物都适用于本申请。优选简单的碘化盐，因为它们有成本较低的优点。此外，它们在固体和液体形态中有较长的储存期。
如果碘化物阴离子在临用前能保持稳定，它就能以液体形式提供给该系统。具体地说，优选该碘化物阴离子不与过氧化氢接触。将产生合适的碘水平的碘化物浓度随所设计制剂的pH而变化。此外，所需碘化物水平将主要根据过氧化物与碘化物的比例而变化。当采用过氧化氢与碘化物的优选比例1/2时，在酶反应开始以前最终重新配制的制剂中，碘化物阴离子的优选范围是每升0.0015和0.10克之间。然而，对某些眼部疾病的一般预防来说，将碘化物较低效地转化为自由分子碘是可能的，因此在酶反应开始以前最终重新配制的制剂中，碘化物阴离子的潜在有用的范围是每升0.025和0.30克之间。这些范围的碘化物阴离子与其他添加剂的pH和浓度的结合，预期能产生5到330ppm范围内的自由分子碘的浓度。
尽管也使用E.C.1.11.1.8的某些成员，但本发明的过氧化物酶是由国际生物化学联合会和International Union of Pure and AppliedChemistry通过酶委员会(Enzyme Commission)鉴定号E.C.1.11.1.7来鉴定的。这些类型的过氧化物酶能从广泛多样的来源中获得，包括牛奶(乳过氧化物酶)、大豆和人类白细胞(myerloperoxidase)。在这两种E.C.类型中，进一步需要的如在本申请中所定义的合适的过氧化物酶是那些能在4到7.1的pH范围内将碘化物氧化为碘的过氧化物酶。适合于本申请的最便宜的过氧化物酶是辣根过氧化物酶和大豆过氧化物酶。可以预料，从辣根、牛奶或人类白细胞或其他适合于本申请的过氧化物酶的来源中可克隆出过氧化物酶。此外，已观察到化学修饰的过氧化物酶适用于本申请。对氨基、羧基或碳水化合物部分的修饰可产生包含在本申请中的合适的催化剂。对过氧化物酶的化学修饰包括酶分子之间相互交联、酶与固体表面或与其他蛋白交联。用于交联的化学试剂包括戊二醛、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、碳化二亚胺、二羧酸酯、活性甘醇、亚氨酸酯、光复活(photoreactive)叠氮化物和本领域技术人员已知的其他试剂。
可以干燥形式如市售提供的冻干过氧化物酶或以大量的水相环境的形式提供前述的过氧化物酶形式，如果所述过氧化物酶是以水相环境提供，则通常是将它掺入可提高稳定性的介质中，所述介质有如甘油、葡聚糖、或其它多羟基化合物或者是在合适缓冲培养基(最好含钙)中的糖。无论是以干燥形式还是以水相环境提供，本申请的过氧化物酶均可与多种添加剂结合。在最终的组合物中，可以全使用的过氧化物酶的浓度范围在0.00005和0.005mg/ml之间，在最终的组合物中的优选范围在0.0005和0.01mg/ml之间。
对包括本发明所设计的组合物的合适缓冲剂包括水和氢化乙醇的混合物，该混合物的缓冲配制为甘氨酸-甘氨酸*HCl、邻苯二甲酸氢钾-邻苯二甲酸、柠檬酸-Na2HPO4、柠檬酸-KH2PO4-H3BO3-二乙基巴比士酸-NaOH、柠檬酸-柠檬酸钠、二甲基戊二酸-二甲基戊二酸钠、乙酸-乙酸钠、琥珀酸-琥珀酸钠、邻苯二甲酸氢钾-邻苯二甲酸二钾、二甲基胂酸钠-二甲基胂酸、马来酸氢钠-马来酸二钠、Na2HPO4-NaH2PO4、碳酸氢钠-5％二氧化碳、咪唑-盐酸咪唑、硼酸-硼酸钠，以及为本领域技术人员已知的良好缓冲液的下述缓冲液Tris、MES、BIS-TRIS、ADA、ACES和PIPES。
在与哺乳动物的眼组织接触后，可将含碘组合物从眼睛中冲洗掉，然而，因为将自由分子碘的浓度控制在相对于所有其它种类的碘的浓度水平，所以此处说明的组合物的一个优点即是没有必要将其冲洗掉，本申请所包含的实施例将证实这一事实。此外，最大的碘水平和过氧化氢水平也受到控制，因而形成非刺激性治疗。本申请中所描述的非刺激性杀菌剂在摩尔基础上具有至少25％的自由分子碘，并且在将杀微生物剂用于人眼之前，于过氧化氢对碘化物的摩尔比例不大于4和过氧化氢的最大浓度水平为0.015％的状况中，通过在水性介质中过氧化物酶、碘化物和过氧化物的酶反应形成5和330ppm之间的自由分子碘的浓度。尽管有pH范围为3.5到8.5的眼用药剂存在，优选的眼用药剂的pH是4.5和7.1之间。
通过对下列详细的实施例的思考，将更全面地评价本发明的所有前述操作原理和优点。实施例实施例1制备以碘为基础的组合物，它主要由自由分子碘组成。通过在pH5.5中孵育辣根过氧化物酶、碘化钠和过氧化氢制备这些组合物，允许将这些原料孵育限定的一段时间，然后完成所得的制剂的特性分析。
测定下述三种碘类物质的浓度自由分子碘、三碘化物和碘化物阴离子。通过Gottardi(Gottardi W.，Fresenius Z.Anal.Chem.，1983年，314卷，582页)的电势法测定自由分子碘。将两个Corning 345型pH仪用于完成电势测定。所用的Corning电极包括标准的铂电极、参比电极和碘化物离子选择电极。通过用硫代硫酸钠滴定测定总碘水平，然后从总碘水平中减去自由分子碘的水平的方法测定三碘化物。用Corning碘化物离子选择电极直接测定碘化物离子的浓度。
在pH5.5时用柠檬酸盐缓冲液探测三种状态。所有状态均使用终浓度为5μg/mL的辣根过氧化物酶。第一种状态(治疗1号)使用每升60mg的碘化钠浓度和等量摩尔浓度的过氧化氢，该过氧化氢是用过碳酸钠(每升0.025克)作为过氧化氢源而产生的。状态2和3(治疗2号和3号)分别使用每升200和450mg的碘化钠和每升0.0833和0.187克过碳酸钠。允许将溶液孵育60分钟，并进行分析测定，结果显示于下述表1中。
<p>我们从显示于表1的数据中推出的结论为，产生以过氧化物酶为基础的碘杀菌剂(该杀菌剂主要包含自由分子碘)是可能的。表中数据显示了三种优势碘类物质的浓度自由分子碘、碘化物阴离子和三碘化物。在所述状态下，与列于表1中的三种碘类物质的浓度相比，次碘酸和碘酸盐的浓度并不显著。实施例2在pH7.0时制备以碘为基础的组合物，其主要由自由分子碘组成。通过在pH7.0时孵育辣根过氧化物酶、碘化钠和过氧化氢制备所述组合物。允许将这些组份孵育限定的一段时间，然后对所得的组合物进行分析测定。所采用的化学组份的重量和体积为0.2克无水柠檬酸、450mg碘化钠、1.3mL 3％过氧化氢、100mg碳酸氢钠和3mg辣根过氧化物酶。在如实验1中所描述的分析测定进行之前，允许将所述化合物孵育15分钟。结果显示如下
我们由此推断的结论是在pH7.0时产生主要由自由分子碘组成的以碘为基础的杀菌剂是可能的。实施例3在生物负荷(bioburden)存在的情况下，测试在实验1中所描述的三种制剂以测定它们的杀灭病原体(如细菌)的能力。制备每毫升含有106红细胞(RBC)的金黄色葡萄球菌悬液。通过显微镜检查测定这些制剂所具有的在红细胞的细胞形态学上的作用。使用稀释的10％PVP-I2来进行对照实验；稀释范围为1/20到1/10,000。
用Ficoll淋巴细胞分离方法将全血进行分层。收获红细胞(RBC)用磷酸盐缓冲盐水洗涤一次，并在5℃下用Alsevers溶液将浓度保持在3.5×109RBC/mL。
用5mL 0.25摩尔的磷酸盐缓冲液在pH7.0(PBDW)时将金黄色葡萄球菌的斜面培养冲洗到100mL的PBDW中，将其接种到琼脂板上。7块营养琼脂板的每一块均加入1毫升该悬液，使其在35-37℃孵育18-24小时。使用1mL的PBDW和无菌拭子从琼脂表面除去细菌集落。采用Milton-Roy Spec 20分光光度计标准化该细菌悬液，设定为109cfu/mL。
将100mL的每种测试的杀菌剂在25℃水浴中平衡(equilibrated)。在测定开始前2分钟，加入106RBCs/mL水平的RBCs，加入2.0×108/水平的金黄色葡萄球菌。在暴露30、60、120和300秒以后分别取出1mL样品并用10mL 0.5％硫代硫酸盐中和。使用琼脂计数平板按一式四份将1mL和0.1mL的中和样品倾入平板中。
本实验测定了所述消毒剂杀灭至少106cfu/mL金黄色葡萄球菌的能力。除了在1/1,000稀释度下的10％PVP-I2(如10ppm总碘)之外，所有的消毒剂在一定时间范围内都有抗金黄色葡萄球菌的效应，当自由分子碘水平在63和114ppm时，以过氧化物酶为基础的碘杀菌剂在30秒内显示出对金黄色葡萄球菌6对数减少(6 log reduction)，当自由分子碘水平在13ppm时，以过氧化物酶为基础的碘杀菌剂需要5分钟达到对金黄色葡萄球菌6对数杀灭(6 log inactivation)的效应。
用以过氧化物酶为基础的碘杀菌剂处理过的红细胞的显微镜检查显示，红细胞无形态学改变或细胞计数减少。除了稀释到1/1000的10％PVP-I2之外，用10％PVP-I2处理的红细胞表现出褪色和皱缩，但计数无减少，测定10％PVP-I2的1/1000稀释液中的自由分子碘的水平为6ppm。
本实验证实合适地控制主要由自由分子碘组成的制剂，可在保持对敏感性生物材料如独特的细胞和组织的非刺激性的同时，也可作为有效的杀菌剂。
实施例4检查以酶为基础的碘杀菌剂以测定其在生物负荷存在下杀灭病原体如病毒的能力。制备以酶为基础的碘杀菌剂，并在人血清中测定其在高浓度的红细胞存在下杀灭病毒的能力。将450mg碘化钠溶于1升0.05摩尔柠檬酸盐缓冲液(pH5.5)中，同时溶解10mg大豆过氧化物酶，制备所述杀菌剂，允许将该溶液孵育10分钟，然后测定该制剂的杀病毒效应。
用Ficoll淋巴细胞分离方法将全血进行处理，收获红细胞(RBC)用磷酸盐缓冲盐水洗涤，并在5℃下用Alsevers溶液将浓度保持在6.5×109RBC/mL。
半数组织培养物感染剂量(TCID50)是引起50％系列培养物感染的病毒颗粒的浓度，将约107单位的TCID50的水泡性口炎疱疹病毒加入到每毫升含106红细胞的混合人血清样品中，将该样品与所述杀菌剂一起于4℃和25℃孵育5分钟，5分钟后，按下述测定病毒滴度，将样品按一式四份，用含有10％胎牛血清和0.1％硫代硫酸钠的非必需氨基酸的最小必需培养基(MEM)以5倍系列稀释，将该稀释液加入到含有Vero细胞(ATCC CRL81)(接近80％融合)的96孔板中。本方法中应用的最低稀释度是原始的处理血清的1∶5倍，37℃下将该培养物于5％二氧化碳环境下孵育3天，然后检测各孔的细胞病变效应。
在模拟感染和碘处理的组织培养孔中，在4℃和25℃下，均未观察到细胞病变效应，这表明所述杀菌剂在敏感性生物材料存在时，可有效杀灭脂质包裹的病毒。用显微镜检查测定所述制剂在红细胞的细胞形态学方面的效应，红细胞的显微镜检查表明以酶为基础的碘杀菌剂不引起红细胞的形态学改变或减少红细胞的数量，处理的细胞中没有一个出现褪色或皱缩。实施例5将生长于含20％胎牛血清的RPMI 1640中的细胞悬液(CEM淋巴母细胞性白血病细胞ATCC CCL-21)离心浓缩，该细胞悬液处于平台期，约相当于2×106细胞/ml，然后用自由分子碘处理所述细胞，以便使每个细胞得到不同比例的自由分子碘(参见表5a)。
使粘附细胞(Vero)在T-75瓶中生长至融合，用胰蛋白酶消化使细胞脱落，并通过离心沉淀，然后用自由分子碘处理所述细胞，以使每个细胞得到不同比例的自由分子碘(参见表5b)。细胞存活百分率似乎与每个细胞中自由分子碘的水平呈反比例关系，每个细胞中自由分子碘比例的高限是明显的。
所述数据有力地提示将敏感性生物材料暴露于抗菌而无细胞毒性的自由分子碘的浓度中是可行的。
实施例6制备以酶为基础的碘杀菌剂，并评价其对三月龄大的雄性和雌性新西兰白兔眼内的细菌杀灭能力。该杀菌剂与治疗1说明的组合物相同，在实施例1中，加入足够的过碳酸钠以调节pH到6.0，其自由分子碘的水平从46降低到32ppm。
在所述杀菌剂滴入试验之前，调整所有受试和对照眼避免明显的眼部刺激。用荧光染色处理眼并在暗室中用紫外线观察以探测或证实有无任何预先存在的角膜损伤。将少量杀菌剂样品(0.1ml)滴入到每只兔的左眼的下结膜囊中并保持眼睑闭合一(1)秒钟。每只兔的对侧眼不予处理并作为比较的对照。
在试验物质滴入1小时后检测该眼的反应，并在1、2、3、4、7、14和21天再次检测。在每次时间间期进行荧光染色。通过滴眼给予一滴荧光素以评估组织损伤。这些试验的1、14和21天的结果显示在下表6中。
在试验期中的任何动物中均没有观察到角膜混浊和虹膜炎。处理后24小时内，在2/6的动物中观察到轻微短暂的结膜炎。这种情况在第2天即消除。没有在任何动物中观察到眼结构周围有眼眶附件(accessory)生长和炎症。所得出的结论是该杀菌剂对眼不引起刺激。<
>进行第二项实验，将含有106菌落形成单位的金黄色葡萄球菌的盐水溶液直接滴入到以上采用的每只兔的左眼中。过5分钟后，用0.1ml杀菌剂滴入每只眼中。每6小时滴一次杀菌剂持续24小时，然后用棉拭子拭抹每只兔的左眼。将棉拭子在琼脂板上涂板并在37℃孵育该琼脂板5天。在任何兔眼上均没有观察到金黄色葡萄球菌菌落。实施例7本实验证明，如果按照本申请的说明书配制，高浓度的自由分子碘并非是必然的眼刺激物。将在实施例1中所描述的三种酶碘组合物的每一种各制备30份样品，每天新鲜复制每种制剂形式的2份样品，持续3天。测定每个样品的自由分子碘的浓度，并将自由分子碘的平均浓度设定为处理1的53ppm；处理2的162ppm；和处理3的324ppm。在超过3天的疗程中使用两种不同的用药方案，采用这三种不同的处理形式(1、2和3)来测定自由分子碘对新西兰白兔的眼刺激性。
将兔分为6组；每组由4只兔组成。I和II组给予含有53ppm自由分子碘的处理I的碘组合物。III和IV组给予含有162ppm自由分子碘的处理II的碘组合物。V和VI组给予含有324ppm自由分子碘的处理III的碘组合物。处理组I、III和V每2小时给药4滴，持续3天；每天用于这些动物的总给药次数是4，即16滴。处理组II、IV和VI每小时给药8滴，持续3天；每天用于这些动物的总给药次数是8，即32滴。
使用在Draize试验(Draize J.H.，G.Woodward，H.O.Calvery，J.Pharmacol.Exp.Ther.1944年，82卷，377-390页)中所定义的眼损害评分标度来检测眼，其包括结膜充血和球结膜水肿、流泪、虹膜炎和角膜混浊。全部的眼刺激标度范围从0到110，包含有下列标度0.0-0.5(无刺激)、0.6-2.5(基本无刺激)、2.6-15.0(最小刺激)、15.1-25.0(轻微刺激)、25.1-50.0(中度刺激)、50.1-80.0(重度刺激)、80.1-100.0(非常大刺激)和100.1-110.0(最大刺激)。该刺激结果显示于表7a中。也可通过与已知的Betadine稀释剂眼染色法比较来评估该种眼染色法。使用未稀释的Betadine和七个分别在水中两倍系列稀释的Betadine作为标度范围为0-4.0的染色法的比较标准。本研究的结果证明，对于任何类型的或处理方案的试验在处理的任一天中均没有任何角膜或结膜的染色。
在这一研究中所试验的自由分子碘的制剂对NZ兔眼的刺激最小。无论自由分子碘的浓度或处理方案怎样，这些制剂都不对任何兔的角膜造成任何损害。已发现最高浓度的自由分子碘是三种处理类型所测试的最大的刺激物，甚至于这种刺激程度都是最小的。在处理方案(4滴与8滴使用3天)之间的刺激没有显著差异。由这些制剂引起的一些最小的眼刺激可能是因为不同制剂的低pH所致。这些制剂的pH均在酸性范围内(处理1-pH＝4.75，处理2-pH＝4.90，处理3-pH＝5.01)。
这些定义的自由分子碘组合物无论何时均未对任何兔眼的角膜或结膜染色。所有角膜均保持透明并且所有结膜均保持白色。将三种处理制剂的颜色与Betadine稀释剂的颜色相比较用于碘染色的标度，324ppm的I2组合物(处理III)似乎相当于0.625％Betadine、162ppm I2组合物似乎相当于0.3125％Betadine和53ppm I2组合物似乎相当于0.15625％Betadine。
权利要求
1.一种治疗性的处理哺乳动物眼睛的方法，用以消毒杀灭所述眼的病原微生物，其包含的步骤为基本上是由碘化物-氧化反应的过氧化物酶、过氧化氢源物质和碘化物源物质组成的组合物在水性介质中混合，形成具有多种碘类物质的无刺激性的含水杀微生物剂；所述过氧化物酶选自辣根过氧化物酶、乳过氧化物酶、myerloperoxidase和大豆过氧化物酶；该杀微生物剂的过氧化氢与碘化物的摩尔比维持在大约0.5和4.0之间，这样自由分子碘就是存在的主要的碘类物质，并且所述杀微生物剂具有0.015％的过氧化氢的最大浓度和可用硫代硫酸盐滴定的碘的最大浓度650ppm。
2.权利要求1所定义的方法，其中所述自由分子碘按摩尔计至少占所述多种碘类物质的25％。
3.权利要求2所定义的方法，其中所述组合物进一步包含缓冲剂以维持所述杀微生物剂的pH在4.5和7.1之间。
4.权利要求3所定义的方法，其中所述pH维持在6.0到7.1之间。
5.权利要求3所定义的方法，其中所述缓冲剂选自甘氨酸、邻苯二甲酸、柠檬酸、磷酸、硼酸、巴比土酸、戊二酸、二甲基戊二酸盐、乙酸、乙酸钠、琥珀酸-琥珀酸钠、二甲基胂酸、马来酸氢钠、碳酸氢钠或产生的碳酸盐阴离子是溶液的其它试剂、咪唑以及为本领域技术人员已知的良好缓冲液的下述缓冲液Tris(三(羟甲基)氨基乙烷)、MES(2-[N-吗啉代]乙磺酸)、BIS-TRIS(双[2-羟乙基]亚氨基-三[羟甲基]甲烷；2-双[2-羟乙基]氨基-2-[羟甲基]-1，3-丙二醇)、ADA(N-[2-乙酰氨基]-2-亚氨基二乙酸；N-[氨基甲酰基甲基]亚氨基二乙酸)、ACES((2-[(2-氨基-2-氧代乙基)-氨基]乙磺酸；N-[2-乙酰氨基]-2-氨基乙磺酸)和PIPES(哌嗪-N，N’-双[2-乙磺酸]和1，4-哌嗪二乙磺酸)。
6.用于治疗眼疾的对眼无刺激的含碘抗感染药，包含选自辣根过氧化物酶、乳过氧化物酶、myerloperoxidase和大豆过氧化物酶的碘化物-氧化反应的过氧化物酶、过氧化氢源物质和碘化物源物质，其在与水的混合物中具有大约0.5和0.4之间的过氧化氢对碘化物的摩尔比例和0.015％的过氧化氢的最大浓度，这样自由分子碘就是在所述混合物中产生的主要的碘类物质，并且所述混合物具有0.015％的过氧化氢的最大浓度和可用硫代硫酸钠滴定的碘的最大浓度650ppm。
7.权利要求6所定义的眼用无刺激的含碘药剂，其中在杀微生物剂中形成多种碘类物质，且自由分子碘按摩尔计至少占所述多种碘类物质的25％。
8.权利要求7所定义的眼用无刺激的含碘药剂，其中所述自由分子碘在5和330ppm之间的范围内。
9.权利要求8所定义的眼用无刺激的含碘药剂，其中所述组合物进一步包含缓冲剂以维持所述杀微生物剂的pH在4.5和7.1之间。
10.权利要求9所定义的眼用无刺激的含碘药剂，其中所述pH维持在6.0到7.1之间。
11.权利要求10所定义的眼用无刺激的含碘药剂，其中所述缓冲剂选自甘氨酸、邻苯二甲酸、柠檬酸、磷酸、硼酸、巴比土酸、戊二酸、二甲基戊二酸盐、乙酸、乙酸钠、琥珀酸-琥珀酸钠、二甲基胂酸、马来酸氢钠、碳酸氢钠或产生的碳酸盐阴离子是溶液的其它试剂、咪唑以及为本领域技术人员已知的良好缓冲液的下述缓冲液Tris(三(羟甲基)氨基乙烷)、MES(2-[N-吗啉代]乙磺酸)、BIS-TRIS(双[2-羟乙基]亚氨基-三[羟甲基]甲烷；2-双[2-羟乙基]氨基-2-[羟甲基]-1，3-丙二醇)、ADA(N-[2-乙酰氨基]-2-亚氨基二乙酸；N-[氨基甲酰基甲基]亚氨基二乙酸)、ACES((2-[(2-氨基-2-氧代乙基)-氨基]乙磺酸；N-[2-乙酰氨基]-2-氨基乙磺酸)和PIPES(哌嗪-N，N’-双[2-乙磺酸]和1，4-哌嗪二乙磺酸)。
全文摘要
本发明涉及用于杀灭污染在如人眼这样的敏感生物材料中或材料上的病原体的由酶产生的含碘杀微生物剂。得自酶反应的所述杀生物剂是自由分子碘,其在5ppm的最低水平生成并且按摩尔计至少占所存在的总碘类物质的25%。
文档编号A61P31/04GK1248911SQ97182059
公开日2000年3月29日 申请日期1997年5月31日 优先权日1997年3月24日
发明者J·凯斯勒 申请人:西姆波朗公司