专利名称：具有抗心肌细胞凋亡功能的重组人类arc蛋白的制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药生物工程领域，具体地说是涉及一种具有抗心肌细胞凋亡功能的 重组ARC蛋白，及其采用高表达效率的T7噬菌体原核表达系统进行表达的制备方法， 本发明还涉及该具有抗心肌细胞凋亡功能的重组ARC蛋白在用于制备治疗心肌病、心 肌梗死和心力衰竭等凋亡相关心脏疾病药物中的用途。
背景技术：
细胞凋亡(apoptosis)，又称程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)，是指细
胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束生命的过程。其为多细胞 有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由遗传基因控制的细胞主动死亡过程。该 过程是一个主动的、高度有序的、由基因控制及一系列酶参与的过程，对正常胚胎发 育，维持细胞群体及恶性病变过程中均起重要作用，在保证多细胞生物的健康生存过 程中扮演着关键的角色。和细胞增殖与分化一样，细胞凋亡也是生命的基本现象，是 维持体内细胞数量动态平衡的基本措施。
心脏是由有丝分裂后的处于终末分化状态的心肌细胞组成的，即心肌细胞不再进 行分裂和增殖。这就意味着心肌细胞的损伤和死亡及由此造成的心肌细胞数目减少在 进化上并不能够通过有效的心肌细胞分裂和增殖来弥补。
心肌细胞的凋亡在成年人类心脏是一种正常的生理现象，有很多因素可引起心肌 细胞发生凋亡，包括氧化应激反应、缺血缺氧、血管紧张素II、 Fasligand、机械张力、 肿瘤坏死因子-a、 (3-肾上腺素拮抗剂、抗肿瘤药蒽环霉素等等。凋亡的心肌细胞参与 心血管系统的许多生理和病理变化过程，是导致多种心血管疾病发生与演变的重要细 胞学基础。越来越多的证据表明，心肌细胞凋亡与许多心脏疾病，如心肌梗塞、心力 衰竭、原发性心肌病、心肌肥厚以及抗肿瘤药物蒽环霉素诱导所致的心肌毒性等有密 切的关系。不同的因素可能通过不同的机制启动诱导心肌细胞凋亡的信号转导，激活 凋亡的执行器从而造成细胞凋亡。心肌细胞是失去了分裂能力的终末分化细胞，其细 胞周期的调节、促凋亡因子和抗凋亡因子的分布及凋亡的信号转导过程与有分裂能力的细胞不同。目前已发现，心肌细胞至少存在有两条凋亡途径 一条由Bad—细胞色 素-C—caspase-9—caspase-3—PARP构成；另 一条由caspase-6禾卩Lamin A构成。
1998年，Koseki等人分析一个在心脏中高表达的基因编码的蛋白时，发现这一蛋 白具有CARD结构域，进而实验证实这一蛋白具有对抗caspase-2和caspase-8活性的 作用，这就证明这一蛋白是一种抗凋亡的蛋白。他们给此蛋白命名为ARC (Apoptosis Sepressor with ￡ARD domain) (Koseki T et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 5156 -5160)。
人类ARC蛋白由208个氨基酸残基组成，N-末端(1-97氨基酸残基)有一个 CARD (easpase §ctivation and recruitment domain)结构域、C-末端(98-208/221氨基酸 残基)具有一个高度酸性的脯氨酸-谷氨酸二肽串联重复序列富集区(P/E rich regkm， 170-207氨基酸残基)。至今，其为目前发现的、唯一的心脏特异的抗心肌细胞凋亡蛋 白。ARC可以禾口 Fas、 FADD(￡as associated Qeath gomain containing protein)以及 caspase-8结合而阻断外源性凋亡途径，它也可以与Bax结合而阻断内源性凋亡途径。 ARC还通过抑制线粒体释放细胞色素C，稳定线粒体膜电位而发挥其抗凋亡作用 (Ekhterae D. et al., 1999， Circ. Res.，85: 70-77; Neuss M. et al.， 2001J. Biol. Chem， 276:33915-33922)。目前认为，ARC的抗凋亡作用是依赖其CARD结构域、C-末端结 构域和CK2激酶对149位酪氨酸的磷酸化作用(Nam Y J et al.， 2004， Moi. Cell, 15:901-912; Jo DG et al" 2004, Mol. Cell. Biol, 24:9763-9770; Li P F et al., 2002, Mol. Cell, 10:247-258)。
ARC蛋白N-末端的CARD结构域在抗凋亡效应中起着关键作用。ARC通过这一结 构域与死亡配体Fas和接头蛋白FADD的死亡结构域但eath domain, DD)以及caspase-8 的死亡效应结构域但eath effect domain, DED)的发生异型相互作用(heterotypic interaction)而阻断Fas和FADD的DD之间的同型相互作用(homotypic interaction),进而阻 止诱发死亡的信号转导复合物(death inducing signaling eomplex， DISC)的形成，最终阻 断外源性凋亡途径(Nam YJ et al., 2004， Mol. Cell, 15:901-912)。 ARC还利用CARD结构 域与促凋亡因子Bax的C末端调节区域结合，使其处于无活性的构象，不能转至线粒体 而引发凋亡因子的释放，从而阻断内源性凋亡途径(NeussM.etal.,2001,J.Biol.Chem 276:33915-33922)。
ARC蛋白C-末端的脯氨酸-谷氨酸二肽串联重复序列富集区(P/E rich region)在 其抗凋亡效应中同样起着重要作用。(^2+是主要的细胞凋亡化学信号,在细胞凋亡时出 现快速持续的浓度上升，死亡配体Fas、 TNF-a、 11202及缺氧等都能引起胞内游离Ca2+浓度升高。Ca&能影响ARC与caspase-8的相互作用，还能作用于线粒体引起细胞色 素C的释放。ARC能抑制依赖于caspase-8以及钙泵抑制剂引起的，并由Ca^介导的 细胞凋亡。现已证实，ARC是通过其C-末端酸性的P/E富集区与C^+结合，来抑制各 种刺激引起的细胞内游离Ca^浓度的升高，从而维持细胞内Ca^平衡(Jo DG. et al., 2004， Mol. Cell. Biol, 24:9763-9770)。
目前，心血管疾病是人类健康和生命的主要威胁，是人类健康的头号杀手，全世 界范围内每年有一千七百万人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌症死亡率的总 和。在我国，随着人民生活水平日益提高和饮食结构的改变，.心血管疾病死亡率呈明 显上升趋势，己超过癌症成为第一大致死原因。根据国家卫生部2004年底公布的最新 统计结果表明，我国18岁及以上居民高血压患病率为18.8%，估计全国患病人数1.6 亿多，由此造成的心肌肥厚、心肌梗死、冠心病、以及心力衰竭等凋亡相关心脏疾病 的病人达几千万。
因此，科研工作者希望在现有的揭示ARC抑制心肌细胞凋亡分子机制的基础上， 利用其作用特性，将其改造成一个药物分子，或将其作为一个药物的"靶分子"应用 到临床治疗中，这必将带来巨大的经济效益和良好的社会效益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高表达上述具有抗心肌细胞凋亡功能的ARC重组蛋 白的方、法。
本发明的再一目的在于提供上述具有抗心肌细胞凋亡功能的ARC蛋白在用于制 备抗凋亡心脏疾病药物中的用途。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的
本发明提供一种制备上述具有抗心肌细胞凋亡功能的人类ARC重组蛋白的方法， 将人类ARC基因cDNA连入原核表达质粒pET，转化入宿主菌BL21(DE 3)， IPTG诱 导表达，再运用凝胶阻滞和离子交换层析分离纯化，得到重组ARC蛋白，具体方法如 下
1、原核表达质粒pET-humanARC的构建
按照《分子克隆》(科学出版社，1992出版)中的方法，将利用RT-PCR方法从 人心脏中得到的人类ARC的基因序列，为方便进一步的扩增、酶切等操作，插入质粒 pUC119，得到重组质粒pUC119-humanARC;
采用IPTG诱导型大肠杆菌表达载体pET (Invitrogen公司产品)，该质粒全长5396bp(碱基对)，含有噬菌体T7启动子、/gc阻抑物基因质粒复制起点(pBR322 ori)和氨苄抗性基因(Ampr);将ARC基因的cDNA经酶切，胶回收酶切片段；与用同 样酶酶切的载体pET混合(分子数3: 1)，于20til连接体系中，加T4连接酶，16。C连 接过夜，得到如图1所示的重组质粒pET-humanARC;
2、 工程菌BL21-humanARC的制备
挑取少量工程菌BL21(human ARC)于LB培养基(含氨苄100ng/ml)中，37。C振荡 培养过夜；然后按照l7。的接种量转接于LB培养基(含氨苄10(Hig/nil)中，37'C振荡培 养3小时至八600=0.5-0.6，加IPTG至终浓度为0.5mmol/L， 3(TC诱导培养8小时；将 质粒转化感受态细菌BL21(DE3)，通过氨节抗性筛选阳性重组子，得到含有质粒 pET-humanARC的大肠杆菌BL21即为工程菌BL21-human ARC;
3、 重组人类ARC蛋白的诱导表达
挑取大肠杆菌BL21-human ARC的单菌落，于3ml含氨苄霉素100吗/ml的LB培 养基中37'C振荡培养过夜；按照1%的接种量接种于500mlLB培养基(含氨苄 100pg/ml)，继续振荡培养2-3小时;至OD6QG=0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度lmM; 继续培养5-6小时；含质粒pET的BL21(DE3)以同样条件培养、诱导，菌体经超声处 理后，取样品上清和沉淀作SDS-PAGE及其Western Blot分析；结果表明，工程菌诱 导后在22 kDa处有一明显的表达条带，主要存在于超声沉淀中，而含有pET质粒的 对照菌体无此条带；说明表达蛋白为人类ARC，表达量占菌体总蛋白的50%左右，主 要以包含体的形式表达；
4、 重组人类ARC蛋白的分离纯化 4一1)超声破菌
诱导培养后的菌液7700g离心10分钟去除细胞碎片，收集上清菌体；按照每克湿 重菌体加3ml缓冲液的比例，用缓冲溶液(50mmol/L Tris-HCl， lmM EDTA， 100 mM NaCl， pH8.0)悬浮菌沉淀；再加入溶菌酶至终浓度lmg/ml， (TC冰浴15分钟，超声破 菌，超声功率为100W, 30秒/次，显微镜检査菌体破碎情况；当菌体基本破碎后停止 超声；
4一2)制备包含体
离心收集菌体，按照每克湿菌加3ml裂解缓冲液(50mmol/L Tris-HCl, pH8.0，lmmol/LEDTA, 100mmol/LNaCl，加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度为lmol/L)的比例 加入裂解缓冲液，悬浮沉淀；冰浴超声以破碎菌体，离心收集沉淀；加入洗涤液 (0.5%Triton X-100,10mmol/L EDTA, 50mmol/L Tris-HCl, pH8.0)悬浮离心沉淀3次，可 得初步纯化的包含体； 4一3)溶解包含体
包含体溶解在变性液中(8M尿素，0.5M NH4CI, 50mmol/L Tris-HCl, pH8.5, 100mmol/L(3-巯基乙醇)，室温保温4小时，然后12,000g离心10分钟，取上清液，得 到粗蛋白溶液；
4一4)重组人类ARC的层析分离纯化
首先进行凝胶过滤(GFC)，预先离心除去蛋白样品中的不溶物；根据人类ARC蛋 白的分子量，采用Sephadex-G50凝胶为支持介质；为使凝胶过滤填料与蛋白质样品 之间的离子相互作用减至最小，用含0.5—1.0mol/L NaCl的高离子强度的缓冲液进行 过滤；使用恒压洗脱液贮瓶，借助重力洗脱，使蛋白样品与离子交换层析的起始缓冲 液具有相同的pH和离子强度；分管收集各洗脱峰，用SDS-PAGE检测各管涉脱液中 蛋白的分子量，将含ARC的洗脱液进行离子交换层析；
因为ARC为酸性蛋白(等电点PK4)，故运用弱阴离子交换柱(DEAE-Sephadex A-50)，再进行离子交换层析(正C);选用挥发性缓冲液，在低离子强度下，用不同pH 的同种缓冲液装若干相同的小柱，分别加等量样品；检测流过液，以找出最佳的吸附 pH;再在最佳吸附的pH下，以低离子强度上柱，再用逐渐升高离子强度的缓冲液洗 脱，从而找出解吸的离子强度；用SDS-PAGE电泳鉴定洗脱峰的纯度；合并ARC级 分后，用冷冻千燥、超滤及吸水剂处理等方法进行脱盐和浓缩处理，得到本发明的具 有抗心肌细胞凋亡功能的重组人类ARC蛋白。
本发明提供的制备方法采用目前表达效率最高的T7噬菌体原核表达系统，因而 表达量远高于其它表达系统的表达量，有利于ARC的规模化生产。
对本发明的重组人类ARC蛋白进行下述生物活性测定
1、 重组人ARC在细胞模型中的抗心肌细胞凋亡功能
将FasL和重组人类ARC蛋白共同处理原代培养大鼠心肌细胞，结果如图2所示， 表明ARC可以阻断FasL造成的TUNEL阳性细胞增多；同时Cell Death ELISA实验 也证实ARC能阻断FasL所致的核小体DNA断裂(图2B)。
2、 重组人ARC在动物模型中的抗心肌细胞凋亡功能
将重组人ARC经静脉注射入大鼠，立即结扎心脏冠状动脉后前降支，造成心肌梗死模型。三天后取出心脏进行凋亡检测，发现注射ARC大鼠的心脏的TUNEL阳性细 胞数目明显少于不注射的对照组。
以上所示的实验结果表明，重组人ARC在细胞模型中和动物模型中均具有明显的 抗心肌细胞凋亡效果。因此，本发明ARC可用于制备治疗心肌病，心肌梗死和心力衰 竭等凋亡相关心脏疾病的生物技术蛋白药物。
本发明的具有抗心肌细胞凋亡功能的重组人ARC蛋白是一种心脏特异的抗凋亡 蛋白ARC(Apoptosis Repressor w池￡ARD domain)的小分子一ARC，经细胞模型和动 物模型试验证明，该蛋白具备显著的抗心肌细胞凋亡功能，可应用于制备抗凋亡心脏 疾病的药物。
图1为本发明的重组质粒pET-human ARC的结构示意图2为ARC在细胞模型中的抗心肌细胞凋亡功能；其中，A: TUNEL法检测细 胞凋亡(R&D Systems); B: Cell Death ELISA检测细胞凋亡；
具体实施方式
试剂与材料
本发明所用的质粒pUC119、原核表达质粒pET和宿主菌BL21(DE3)购自invitrogen 公司；限制性内切酶、T4DNA连接酶、Pfii DNA聚合酶均购自TaKaRa公司；dNTP 购自北京天根生物工程公司。引物的合成和核苷酸序列测序均由北京奥科公司完成。 纯化用的层析柱及其填料Sephadex-G50、 DEAE购自Phamacia公司。
实施例1、构建原核表达质粒pET-humanARC和工程菌BL21-ARC 1 、原核表达质粒pET-human ARC的构建
人ARC的基因序列从人心脏中利用RT-PCR方法得到，为方便进一步的扩增、酶 切等操作，将该基因插入质粒pUC119，得到重组质粒pUC119—ARC。(参见《分子克隆》相关章节，科学出版社，1992出版)。
采用IPTG诱导型大肠杆菌表达载体pET (Invitrogen公司产品)，该质粒全长 5396bp(碱基对)，含有噬菌体T7启动子、/ac阻抑物基因Zac/,质粒复制起点(pBR322 ori)和氨苄抗性基因(Ampr)。将ARC基因的cDNA经酶切，胶回收酶切片段。与用同 样酶酶切的载体pET混合(分子数3: 1)，于20ul连接体系中，加T4连接酶，14'C连 接过夜，得到如图1所示的重组质粒pET-humanARC。
2、工程菌BL21-human ARC的制备
挑取少量工程菌BL21(ARC)于LB培养基(含氨苄100吗/ml)中，37'C振荡培养过 夜；然后按照1 %的接种量转接于LB培养基(含氨苄100pg/ml)中，37'C振荡培养3小 时至A600=0.5-0.6，加IPTG至终浓度为O.5mmol/L， 3(TC诱导培养8小时；将质粒转 化感受态细菌BL21(DE3)，通过氨苄抗性筛选阳性重组子，得到含有质粒pET-human ARC的大肠杆菌BL21即为工程菌BL21- human ARC。
实施例2、重组人类ARC蛋白的诱导表达
挑取大肠杆菌BL21(ARC)的单菌落，于3ml含氨苄霉素100ug/ml的LB培养基中 37'C振荡培养过夜。按照1 %的接种量接种于500mlLB培养基(含氨苄100ug/ml )，继 续振荡培养2-3小时。至OD6(K)=0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度lmM。继续培养 5-6小时。含质粒pET的BL21(DE3)以同样条件培养、诱导，菌体经超声处理后，取 样品上清和沉淀作SDS-PAGE及其Western Blot分析。结果表明，工程菌诱导后在22.8 kDa处有一明显的表达条带，主要存在于超声沉淀中，而含有pET质粒的对照菌体无 此条带。说明表达蛋白为重组人ARC蛋白，表达量占菌体总蛋白的50%左右，主要 以包含体的形式表达。
实施例3、重组人ARC蛋白的分离纯化
1、 超声破菌
诱导培养后的菌液7700g离心10分钟去除细胞碎片，收集上清菌体；按照每克湿 重菌体加3ml缓冲液的比例，用缓冲溶液(50mmol/L Tris-HCl, lmM EDTA， 100 mM NaCl， pH8.0)悬浮菌沉淀'；再加入溶菌酶至终浓度lmg/ml， (TC冰浴15分钟，超声破 菌，超声功率为100W， 30秒/次，显微镜检查菌体破碎情况；当菌体基本破碎后停止 超声；
2、 制备包含体离心收集菌体，按照每克湿菌加3ml裂解缓冲液(50mmol/L Tris-HCl, pH8.0, lmmol/LEDTA, 100mmol/LNaCl，加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度为lmol/L)的比例 加入裂解缓冲液，悬浮沉淀；冰浴超声以破碎菌体，离心收集沉淀；加入洗涤液 (0.5%Triton X-100， 10mmol/L EDTA, 50mmol/L Tris-HCl, pH8.0)悬浮离心沉淀3次，可 得初步纯化的包含体；
3、 溶解包含体
包含体溶解在变性液中(8M尿素，0.5M NH4C1, 50mmol/L Tris-HCl, pH8.5, lOOmmol/Lp-巯基乙醇)，室温保温4小时，然后12,000g离心10分钟，取上清液，得 到粗蛋白溶液；
4、 重组人ARC蛋白的层析分离纯化
首先进行凝胶过滤(GFC)，预先离心除去蛋白样品中的不溶物；根据人ARC的分 子量，采用Sephadex-G50凝胶为支持介质；为使凝胶过滤填料与蛋白质样品之间的 离子相互作用减至最小，用含0.5—1.0mol/L NaCl的高离子强度的缓冲液进行过滤； 使用恒压洗脱液贮瓶，借助重力洗脱，使蛋白样品与离子交换层析的起始缓冲液具有 相同的pH和离子强度；分管收集各洗脱峰，用SDS-PAGE检测各管洗脱液中蛋白的 分子量，将含ARC的洗脱液进行离子交换层析；
因为ARC为酸性蛋白(等电点PI<4)，故运用弱阴离子交换柱(DEAE-Sephadex A-50)，再进行离子交换层析(IEC);选用挥发性缓冲液，在低离子强度下，用不同pH 的同种缓冲液装若干相同的小柱，分别加等量样品；检测流过液，以找出最佳的吸附 pH;再在最佳吸附的pH下，以低离子强度上柱，再用逐渐升高离子强度的缓冲液洗 脱，从而找出解吸的离子强度；用SDS-PAGE电泳鉴定洗脱峰的纯度；合并ARC级 分后，用冷冻干燥、超滤及吸水剂处理等方法进行脱盐和浓縮处理，得到本发明的具 有抗心肌细胞凋亡功能的重组人类ARC蛋白。
实施例4、重组人ARC蛋白的生物活性鉴定
1、重组人ARC在细胞模型中的抗心肌细胞凋亡功能
细胞凋亡途径有内源性和外源性两条途径。ARC可以和Fas, FADD以及caspase-8 结合，根据心肌细胞表达Fas水平要超过许多其他组织和器官的细胞，Fas的高水平表 达及其分布于细胞膜的特点，设想重组人ARC蛋白能否通过细胞膜与Fas结合从而 阻断细胞凋亡的外源性途径。
以200ng/ml FasL处理分别经重组人ARC处理过的大鼠原代培养心肌细胞。重组人ARC蛋白均在细菌中表达，使用Invitrogen的纯化试剂盒纯化。FasL处理24小时 后收集心肌细胞进行实验分析。TUNEL法检测细胞凋亡(R&D Systems),按照TUNEL 检测试剂盒说明进行。统计50个视野下共400个细胞。结果如图2所示，表明重组人 ARC可以阻断FasL造成的TUNEL阳性细胞增多(图2A)。 Cell Death ELISA检测细 胞凋亡，按照Cell Death ELISA检测试剂盒(Roche)说明进行。在405 nm波长处用 ELISA检测仪测光密度值，数据以倍增的方式表达。图中的数据是4次独立实验的平 均值(*p<0.05vsFasL.)。数据证实重组人ARC能阻断FasL所致的核小体DNA断裂 (图2B)。
2、重组人ARC在动物模型中的抗心肌细胞凋亡功能
雄性韦氏大鼠(250-300g)随机分组，每组8只。实验大鼠经静脉注射重组人ARC (0.5pM/kg体重)，立即结扎心脏冠状动脉后前降支，造成心肌梗死模型。假手术组 处理方法类似，只是冠状动脉不结扎。
3天后取出心脏进行凋亡检测，发现注射ARC大鼠的心脏的TUNEL阳性细胞数 目明显少于不注射ARC的对照组大鼠心脏。冠状动脉结扎手术20天后测量心肌梗死 面积，注射ARC大鼠的心脏梗死面积小于不注射ARC的对照组大鼠心脏。冠状动脉 结扎手术2天后Cell Death ELISA检测心肌细胞凋亡，按照Cell Death ELISA检测试 剂盒(Roche)说明进行。在405 nm波长处用ELISA检测仪测光密度值，数据以倍增 的方式表达。数据是4次独立实验的平均值(*p<0.05vs saline, **p<0.05vs ARC),数 据表明，注射ARC大鼠的心脏中凋亡的心肌细胞数目少于不注射ARC的对照组大鼠 心脏。
以上实验结果表明，重组人ARC蛋白分子在细胞模型中和动物模型中都具有显著 的抗心肌细胞凋亡的作用。因此，可用其制备用于治疗心肌病、心肌梗死和心力衰竭 等凋亡相关心脏疾病的生物技术药物蛋白药物。人类ARC基因的核苷酸序列表
atgggcaacgcgcEiggagcggccgtcagsLgactatcgaccgcgagcggaaacgcctggtc60
g卿cgctgc鄉cggactcgggactgctgttggacgcgctgctggcgcggggcgtgctc120
accgggccagagtacg3ggcattggatgcactgcctgatgccgagcgcagggtgcgccgc180
ptactgctgctggtgcagggC肪gggCg3ggccgcctgccaggagctgctacgctgtgcc240
C3gCgt8CCgcgggcgcgccggaccccgcttgggactggcagcacgtgggtccgggctac300
Cggg3CCgC3gctatgaccctccatgcccaggCC3Ctgg3CgCCgg3ggCacccggctcg360
gggaccacatgccccgggttgcccagagcttcagaccctg3Cg鄉CCgggggccctgag420
ggctccgaggcggtgcaatccgggaccccggaggagccagagccagagctggaagctgag480
gcctctaaagaggctgaaccggagccggagccagagccagagctggaacccgaggctg犯540
gcag犯ccagagccggaactggagccagsaccggacccagagcccgagcccgacttcgag600
gaasggg3cgagtCCg33g3ttcctga627
人类ARC蛋白的氨基酸序列表
Met Gly Asn 1
Lys Arg Leu
Ala Leu Leu
Asp Ala Leu
Val Gin Gly 65
Gin Arg Thr Gly Pro Tyr
Ala Gin Glu Arg Pro 5
Val Glu Thr Leu Gin 20
Ala Arg Gly Val Leu 35
Pro Asp Ala Glu Arg 50
Lys Gly Glu Ala Ala 70
Ala Gly Ala Pro Asp 85
Arg Asp Arg Ser Tyr 100
Ser Glu Thr lie Asp 10
Ala Asp Ser Gly Leu 25
Thr Gly Pro Glu Tyr 40
Arg Val Arg Arg Leu 55
Cys Gin Glu Leu Leu 了5
Pro Ala Trp Asp Trp 90
Asp Pro Pro Cys Pro 105
Arg Glu Arg 15
Leu Leu Asp 30
Glu Ala Leu 45
Leu Leu Leu 60
Arg Cys Ala 80
Gin His Val 95
Gly His Trp 110
12Thr Pro Glu Ala Pro Gly Ser Gly Thr Thr Cys Pro Gly Uu Pro Arg
115 120 125
Ala Ser Asp Pro Asp Glu Ala Gly Gly Pro Glu Ala Val Gin Thr Pro
130 135 140
Glu Glu Pro Glu Pro Glu Leu Glu Ala Glu Ala Ser Lys Glu Ala Glu 145 150 155 160
Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Leu Glu Pro Glu Ala Glu Ala Glu
165 170 175
Pro Glu Leu Glu Pro Glu Ala Glu Ala Glu Pro Glu Leu Glu Pro Glu
180 185 190
Pro Asp Pro Glu Pro Asp Phe Glu Glu Arg Asp Glu Ser Glu Asp Ser 195 200 20权利要求
1、重组人类ARC蛋白的原核表达载体pET-humanARC。
2、具有抗心肌细胞凋亡功能的重组人类ARC蛋白用于制备治疗心肌病、心肌梗死和 心力衰竭等凋亡相关心脏疾病药物的用途。
全文摘要
本发明涉及医药生物工程领域，是一种具有抗心肌细胞凋亡功能的重组人类ARC蛋白。该蛋白由208个氨基酸残基组成，分子量仅为22kD，容易穿过细胞膜，进入靶器官的细胞内发挥生物学作用，因此可将其制备成治疗心肌病，心肌梗死和心力衰竭等凋亡相关心脏疾病的生物技术蛋白药物。
文档编号C12N15/63GK101307320SQ20071009933
公开日2008年11月19日 申请日期2007年5月16日 优先权日2007年5月16日
发明者李培峰 申请人:中国科学院动物研究所