专利名称：一种植物花器官特异性启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物启动子，特别是涉及一种植物花器官特异性启动子及其应用。
背景技术：
启动子是基因表达调控因子中最重要的因子，它基本决定一个基因是否表达、何时表达和何处表达。按作用方式和功能，启动子大体可以分为组成型启动子、特异性启动子和诱导型启动子三大类[王关林，方宏筠，2002，植物基因工程原理与技术(第二版)，北京，科学技术出版社]。这种分类方式基本上反映了不同类型启动子各自的功能特点，但在某些情况下，一种类型的启动子往往兼有其它类型启动子的特性。
诱导型启动子(inducible promoter)是指其控制的基因在某些特定的物理、化学和生物信号(统称为“诱导子”或“诱导因子”)的刺激下，可以大幅度地增加转录水平。其特征为，该类型启动子控制的基因在没有诱导因子存在的条件下不表达或者只有非常低的表达(也称为“本底表达”)，但一旦受到诱导因子的诱导，基因的表达量迅速并且大幅度增加。诱导型启动子常常根据其诱导信号来分类和命名，例如激素诱导启动子[Xu D等，1993，Plant Mol Biol，22(4)573-588；TaylorJE等，1995，Plant J，7(1)129-134]、化学诱导启动子(Williams S等，1992，Biol/Technol，10540-543；综述见Padidam M，2003，Curr Opinion in PlantBiol，6 169-177)、光诱导启动子[Sheen JY等，1987，Plant Mol Biol，8(3)227-238；Matsuoka M等，1994，Plant J，6(3)311-319]、热诱导启动子[SchofflF等，1989，Mol Gen Genet，217(2-3)246-53]、创伤诱导启动子[Farmer EE等，1992，Plant Cell，4129-134；Carrera E等，1998，Plant J，15(6)765-771]、真菌诱导启动子(Fukuda Y等，1994，Plant Mol Biol，24(3)485-493)和共生细菌诱导启动子(Miao GH等，1993，Plant Cell，5781-786)等。诱导型启动子往往也多少具有器官和/或组织特异性，例如烟草水杨酸诱导启动子PR-1a主要驱动基因在叶片中表达(Uknes S等，1993，Plant Cell，5159-169)。
组成型启动子(constitutive promoter)是指在该类型启动子控制下，结构基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同器官和/或组织的表达水平也没有明显差异。其特点是受其控制的结构基因的表达具有持续性，但不具有时空特异性；RNA和蛋白质表达量相对恒定，不受外界因素的诱导，例如玉米Ubiqultin启动子，水稻的Actinl启动子(Wang等，Molecular and Cellular Biology，12(8)3399-3406(1992))，美国专利第5641876)和花椰菜菜叶病毒(CaMV35SRNA)(Odell等，Nature，313810-812(1985))等。
器官或组织特异性启动子(organ-and/or tissue-specific promoter)，是指其调控基因的表达往往只发生在植物体的某一或某些特定的器官和/或组织，或者往往只发生在植物生长发育的某一或某些特定阶段。其特征是受其控制或调节的基因表达具有明显的时空性，并往往表现出发育调节的特性。例如，根特异性启动子(Yamamoto YT等，1991，Plant Cell，3371-382)、叶片特异性启动子[Taylor，WC，2001，Plant Mol Biol，46(3)325-333)、果实特异性启动子(Pear JR等，1989，Plant Mol Biol，13639-651)、花特异性启动子(Van tunen等，1988，EMBO J.，71257)、胚乳特异性启动子[Colot V等，1987，EMBO J，6(12)3559-3564]、棉花纤维特异性启动子(Ma DP等，1997，Biochem Biophys Acta，1344111-114)和韧皮部特异性启动子[Bostwick DE等，1994，Plant Mol Biol，26887-897]等等。
生殖生长是高等植物生活史中的重要阶段，而作为执行生殖过程的重要器官—花器官的形成与发育一直受到生物学家和农学家的广泛关注。植物的花发育过程可分为4个阶段(Koornneefm et al；Ann.Rev.Plant Physiol Plant MolBiol；1998，49345-370)成花诱导、花分生组织形成、花器官原基产生和花器官成熟。因此，花器官的发育过程是一个高度复杂的、有序的生理生化和形态发生的过程。在这一过程中，有大量的特异性基因的表达。
目前世界上已经鉴定、分离和功能研究了一些花器官特异性的启动子。一些花器官特异性启动子驱动外源基因在花器官的多个相对独立的单位表达，例如，PAL家族的zb8启动子驱动报告基因GUS在转基因水稻的花药、花芽、花托和花丝中都表达(Zhu Q et al，1995，Plant Mol.Biol.，29535-550)，而另一些花器官特异性启动子则具有花器官某一特定单位的特异性，例如，水稻花药特异性启动子(Tsuchiya T等，1994，Plant Mol Biol，201189-1193；吴孝槐等，2003，科学通报，482154-2161)、番茄花粉特异性启动子LAT52(Twell D等，1989，Mol GenGenet，217240-245)、TomA108(Xu XS and Chen RD，2006，Physiol and Biochem，25231-240)和烟草花药绒毡层特异性启动子TA29(Koltunow AM等，1990，PlantCell，21201-1224)等等。人们研究还发现，花色素代谢途径和花香的挥发性化学物质的代谢的基因中的很多基因都具有花器官特异性。例如，矮牵牛查尔酮(CHS)基因启动子具有很强的花瓣特异性表达特性(Van tunen等，1988，EMBO J.，71257)。
花器官特异性基因及其启动子的研究，不仅对了解花器官分化、形成、生长和发育的控制基因及其网络具有重要的理论意义，而且对利用基因工程技术改良植物具有重要的应用价值，特别是在作物人工雄性不育基因工程(Mariani等，1990，Nature，347737-741；肖等，2004，中国发明专利，ZL00109108.5)、花卉的花形、花色与花期调控等基因工程(李等，2003，中国生物工程杂志，2342-46)和果树的缩短童期以及通过提前花期调整果品上市时间等基因工程方面具有广阔的应用前景。
甘蓝(Brassica oleracea L.)是十字花科芸薹属重要的蔬菜作物，在世界许多国家作为主要蔬菜栽培。此外，它与油菜等十字花科其它植物的有限杂交亲和性为油菜等的品种改良作出了很大的贡献。例如，甘蓝型油菜已经是包括我国在内的许多国家和地区的主要油菜种类之一。
甘蓝花器官相关基因及其启动子的克隆取得明显的进展，已经克隆出自交不亲和相关基因Thl1、Thl2、ARC1基因和雄性不育等相关基因。这些特异性基因，特别是其启动子，已经开始应用于基因工程育种(Bhalla等，1998，Mol Breeding，4(12)531-541)。同时，利用其它植物花特异性启动子改良甘蓝的工作也取得一些进展，如，朱育英等(Acta Agriculture Ahanghai，2001，17(1)79-82)将TA29与Barnase基因融合导入甘蓝，观察到转基因植株有雄蕊退化的雄性不育和不育植株出现。随着对环境保护意识的提高和对食品品质要求的提高，人们对利用源自植物的基因来改良植物或作物的要求也越来越强烈。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物花器官特异性启动子及其应用。
本发明所提供的植物花器官特异性启动子，它的核苷酸序列是(1)、序列表中序列1所述的核苷酸序列；或(2)、与(1)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或(3)、与(1)或(2)所述的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性的核苷酸序列；或(4)、与(1)、(2)或(3)所述的核苷酸序列在严谨杂交条件下能够杂交的核苷酸序列。
上述严谨杂交条件可为在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min；或者在0.5X SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
序列表中序列1由1244个脱氧核苷酸组成；自5′端的第1156-1167位脱氧核苷酸为TATA盒(TATA box)。自5′端的第1197位脱氧核苷酸为转录起始位点。
含有上述花特异性启动子的表达盒也属于本发明的保护范围。
在所述表达盒中，所述花器官特异性启动子的下游连接结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小RNA，用于驱动结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因、天然小RNA或人工合成的小RNA的表达。
含有上述花器官特异性启动子的重组表达载体也属于本发明的保护范围，所述重组表达载体是含有上述表达盒与质粒、病毒或运载体表达载体所构建的重组载体；所述重组表达载体为重组植物表达载体；所述重组植物表达载体包含上述表达盒并且能够将所述的表达盒转送进入植物宿主细胞、组织或器官及其后代并且能够或者至少方便所述的表达盒整合到宿主的基因组中，它包括但不限于双元载体、共合载体。
上述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织或器官，得到转基因植物细胞或组织或器官及由此分化、再生的完整植株及其无性系或其后代。
本发明还提供了一种上述花器官特异性启动子的获得方法，是以甘蓝的基因组DNA为模板，用核苷酸序列是序列表中序列2和核苷酸序列是序列表中序列3的一对引物进行PCR扩增得到花器官启动子。
实验证明，本发明花特异性启动子Bofs能够启动报告基因GUS在转基因烟草的花器官的花瓣、花药、柱头和花粉中特异表达，而在营养器官都没有检测到表达，并且其后代表现了相同的特点；说明本发明所提供的启动子Bofs不仅具有强驱动性，而且还具有良好的花器官特异性，并且这种强驱动性和特异性能够稳定地传递给后代。因此，本发明所提供的分离自甘蓝(Brassica oleracea L)的启动子Bofs是一个稳定、驱动力强和特异性高的花器官特异性启动子。
本发明的植物花器官特异性启动子可在不同植物或作物中表达并稳定遗传，所述的植物或作物是指显花植物，根据不同的植物分类方法，所述的植物或作物可包括但不限于被子植物和裸子植物、单子叶植物和双子叶植物、草本植物、藤本植物和木本植物、一年生植物和多年生植物、水生和陆生植物以及有性和无性繁殖植物，其中按照水生和陆生植物的分类，所述植物或作物优选为陆生植物。
将本发明的启动子下游衔接内源基因的反义基因、能够干扰内源基因表达的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)或外源基因，构建表达盒并与不同的表达载体连接，转化到植物中，利用其花异性表达活性，在花器官中特异性表达其控制或指导的所述的反义基因、外源基因或小RNA。在转基因植株中使其内源基因的反义基因、能够干扰内源基因表达的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)或外源基因的表达局限于花中，排除了这些基因在植物体其它部位的表达。
本发明的花器官特异性启动子，不仅为花器官的分化、形成、生长和发育的分子机理等理论研究提供了重要的分子元件，还为植物基因工程育种，特别是花卉植物花形、花色、香味和花期调控等基因工程育种提供了关键的分子元件。利用该启动子驱动内源基因的反义基因、能够干扰内源基因表达的小RNA或外源基因转化植物的细胞或组织及其后代细胞后，可以培育花形、花色、花香和育性等不同于受体野生型的花卉作物新品种、培育雄性不育作物品种和培育消除或大幅度减少“飞絮”的园林绿化植物等。
图1为花器官特异性启动子Bofs克隆的电泳图。
图2为花器官特异性启动子Bofs的DNA序列。图中，下划线者为引物序列，斜体者为外加的限制性内切酶所识位点，5’端为Hind III位点，3’端为Bam HI位点。
图3为花器官特异性启动子Bofs驱动GUS基因(即Bofs::GUS融合基因)的植物表达载体pRDBofsG的构建流程图。
图4为含有花器官特异性启动子Bofs驱动GUS基因(即Bofs::GUS融合基因)的植物表达载体pRDBofsG的酶切鉴定图。
图5为转pRDBofsG烟草T0代植株的PCR鉴定图。
图6为转pRDBofsG烟草T0代植株与未转基因对照植株花瓣的GUS染色照片。
图7为转pRDBofsG烟草T0代植株与未转基因对照植株柱头的GUS染色照片。
图8为转pRDBofsG烟草T0代植株与未转基因对照植株花药的GUS染色照片。
图9为转pRDBofsG烟草T0代植株与未转基因对照植株花粉的GUS染色照片。
具体实施例方式
本发明中所述的启动子核苷酸序列可以是其中一个或多个核苷酸发生取代、缺失、插入或倒位的核苷酸序列，即所分离的核苷酸序列的人工突变体或“天然”突变体，它保留其启动子功能；还可以是所述的核苷酸序列与其它启动子序列或启动子区保守调控序列(“motif”或“box”)的融合序列。本发明中所述的“启动子”录起始位点(+1)上游并且具有指导RNA聚合酶在正确位置上启动转录的功能，但不限于该区域附近的部分；此外，它还含有与除RNA聚合酶以外的蛋白质相关联的用于调节表达的另一个必须区域。本发明中所述的“启动子区域”定义为含有上文中定义的启动子的区域。本发明中所述的“启动子活性”是指当以某种基因的可表达方式将其连接到启动子的下游，并导入到宿主中，该宿主显示具有在宿主内或宿主外生产该基因产物的能力和功能时，该启动子具有启动活性。通常，是将编码容易定性或定量检测的蛋白质的基因(报告基因)连接到该启动子的下游，将该基因导入宿主内，并检测所表达的蛋白质，可确定特定启动子的活性或是否存在该启动子或者该启动子的效力。本发明中所述的结构基因是指能够编码某种蛋白质或其它活性物质功能的一段核苷酸序列，包括RNA或DNA序列。所述的调节基因是指其编码的某种RNA或蛋白质或其它活性物质能够对其它结构基因的表达进行调节或调控的一段核苷酸序列，包括RNA或DNA序列。所述的正义基因包括上述的结构基因和调节基因。所述的反义基因是指与上述结构基因或调节基因编码的RNA互补的RNA或DNA序列。所述的内源基因是指来自宿主自身的基因，包括RNA或DNA序列。所述外源基因是指任何一段核酸序列，并具有编码某种蛋白质或其它活性物质功能，包括天然的和人工合成的RNA或DNA序列，该序列与花药特异性启动子在正常情况不相结合。所述的小RNA是指分离自生物体的或人工合成的RNA序列片段，其长度通常为20-26个脱氧核苷酸或者在导入宿舍细胞后能够被剪切成20-26个脱氧核苷酸的RNA片段，它本身对生物体无毒或毒性极低。
本发明中所述的表达载体是指现有技术中已知的、能够在植物中进行表达的任何一种植物载体，例如pBin19、pBI121(美国ClonTech公司产品)和pCAMBIA系列(澳大利亚CAMBIA中心产品)等。
本发明中所述的转化是指现有技术中已知的、能够将外源基因导入植物细胞或植物组织的任何一种植物转化方法，如农杆菌介导法和基因枪等。
本发明中所述的宿主细胞或宿主组织或宿主器官及其后代细胞是指所有植物细胞或植物组织或植物器官或由这些细胞、组织或器官通过组织分化或无性胚再生并且发育成熟的整体植株(包括种子)。
术语“核酸序列”或“核苷酸序列”指含有天然存在的核苷酸或核苷单体的序列。该序列也包括具有相似功能的非天然存在的单体或其部分的修饰的或取代的序列。
术语“花器官特异性启动子”是指在启动子控制下表达的基因在没有或有基础表达的植物的花器官表达而在植物体的其他器官不表达的启动字。
术语“具有60％或60％以上同源性的序列”是指与(1)或(2)中的序列相比有60％或60％以上的核苷酸序列相同或相似的那些核酸序列或核苷酸序列，这些序列以基本相同的方式发挥作用并且能够驱动其下游基因的花药特异性表达，它们与(1)或(2)中序列的差异可能是由于局部结构上的修饰或突变，包括人工突变和非人工突变。
术语“杂交的序列”是指可以在严谨杂交条件下与(1)、(2)、(3)或(4)的序列杂交的核酸序列。“严谨杂交条件”是指本领域技术人员已知的，或者可以在分子生物学或基因工程实验指南，例如《Molecular Cloning》(3rdEd)(Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，2001)(以下简称“《分子克隆》第三版”)中的通用方案中找到，具体为在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次5min.0.5X SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次15min.
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
T0代表示由愈伤组织得到的转基因植株及其无性系，T1表示T0代自交产生的种子及由它所长成的植株和无性系。
实施例1、甘蓝(Brassica oleracea L)花器官特异启动子Bofs的克隆与分离1、甘蓝(Brassica oleracea L)总DNA的提取取温室盆栽的甘蓝品种“黑叶小平头”(购自中国农业科学院蔬菜花卉研究所)嫩叶片1-2g，用CTAB法(《分子克隆》第三版)提取总DNA。取1-5ul DNA样品，用紫外分光光度计测量其浓度和纯度，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和完整性。将提取的DNA于-20℃保存。
2、PCR扩增与扩增片段的回收设计并合成如下两条引物(引物1和引物2)扩增甘蓝花器官特异启动子，为了方便以后的克隆和构建，在两条引物的5’端分别加入了限制性内切酶HindIII和Bam HI的识别序列位点(下列引物序列中的下划线序列)引物15’-AAGCTTAGCAGCACGAATGAAGTTC-3’(Hind III)引物25’-GGATCCTTGTAGTGAGAAAACTCGGGGAA-3’(Bam HI)以步骤1提取的甘蓝基因组DNA为模板，进行PCR反应
反应体系为模板DNA800ng；10X Exbuffer 2ul；dNTP混合物(2.5mM) 2ul；ExTaq DNA Polymerase(5U/u1)0.5ul；引物1(10uM)2ul；引物2(10uM)2ul；无菌重蒸馏水(sddH2O) 补足至20ul。
PCR反应程序先预变性94℃5min；再94℃30sec，50℃30sec，72℃1min 30sec，35个循环；最后72℃10min。
PCR反应完成后，取15ul扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下快速用一次性刀片切下位于1200bp左右的特异片段，用DNA片段回收试剂盒回收并纯化(Easy-NA Gel Extraction Kit，德国Omeg-Bio/TEK产品)，溶于50ulddH2O中，-20℃保存备用。
3、回收片段的亚克隆与测序将步骤2回收的片段连接到质粒载体pUCm-T(上海生工生物工程技术服务有限公司产品)，将所得到的重组质粒通过“冻融法”(《分子克隆》第三版)转化到大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞，在含氨苄青霉素100mg/L的LB固体培养基上于37℃过夜培养，挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨苄青霉素100mg/L的LB液体培养基中于37℃过夜培养。当菌液浓度达到OD600为0.6时，离心收集菌体，按小量碱裂解法(《分子克隆》第三版)提取质粒，用限制性酶HindIII和BamHI双酶切后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳，正确的重组载体应在紫外灯下可见分子大小大约分别为2800bp(载体带)和1200bp(目标带)的两条带(图1，图中，泳道1为DNA大小分子标准I---Marker I；泳道2为插入上述PCR扩增片段的克隆载体的HindIII+BamHI酶切图)。将通过上述酶切鉴定含有1200bp插入片段的质粒(pUBofs)或含有该质粒的DH5α送交商业测序公司测序(原上海博雅生物技术服务有限公司，现已并入Introgen公司)，将经测序表明正确的重组载体命名为pUBofs。测序结果表明上述PCR扩增得到的片段为甘蓝花器官特异启动子，序列如图2所示，甘蓝花器官特异启动子具有序列表中序列1的核苷酸序列，将具有序列表中序列1的核苷酸序列的甘蓝花器官特异启动子命名为Bofs。图2中，下划线者为所用的引物序列(上述引物1和引物2)，斜体为外加的限制性内切酶识别位点(HindIII和BamHI)。
实施例2、花器官特异启动子驱动GUS基因(Bofs::GUS)植物表达载体pRDBofsG的构建花器官特异启动子驱动GUS融合基因(Bofs::GUS)植物表达载体pRDBofsG的构建流程如图3所示，具体方法如下将pUBofs经限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切后，Bofs片段(大约1200bp)，用冻融法(《分子克隆》第三版)或DNA片段回收试剂盒(Easy-NAGel Extraction Kit，德国Omeg-Bio/TEK产品)回收并纯化花器官特异启动子Bofs片段，与经过HindIII和BamHI双酶切的植物表达载体pRD410(加拿大PBI产品)的大片段(大约为13.6kb)相连，得到重组质粒。将所得到重组质粒用“冻融法”(《分子克隆》第三版)转化到大肠杆菌菌株DH5a。转化的DH5α在含卡那霉素50mg/L的LB固体培养基上于37℃过夜培养，挑取平板上生长的单菌落，接入含卡那霉素50mg/L的LB液体培养基中于37℃振荡过夜培养。当菌液浓度达到OD600值0.5-0.6时，离心收集菌体，按上述小量碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶Hindll和BamHI双酶切后，在1.0％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可见分子大小分别约为13.5kb(pRD410载体带)和1200bp(Bofs)两条带，并且进行了测序验证，将酶切和测序表明含有花器官特异启动子Bofs片段和pRD410酶切得到的大片段的重组表达载体命名为pRDBofsG。pRDBofsG中GUS基因需要花器官特异启动子驱动表达。
实施例3、转Bofs融合基因(Bofs::GUS)烟草的鉴定1、农杆菌的转化与转化子的鉴定用CaCl2法(《分子克隆》第三版)制备根癌农杆菌菌株LBA4404(美国LifeTechnology公司产品)的感受态细胞。利用冻融法(《分子克隆》第三版)将含有Bofs融合基因(Bofs::GUS)的植物表达载体pRDBofsG转入制备的LBA4404的感受态细胞。将转化的LBA4404细胞接种到含有链霉素(Str)100mg/L和卡那霉素(Kan)50mg/L的YEB固体培养基，置于28℃在暗处培养48-72h，挑取平板上的单菌落，接入含有链霉素100mg/L和卡那霉素50mg/L的YEB液体培养基，在28℃振荡过夜培养。当培养物的浓度达到OD600值0.4-0.6时，取少量菌液(1.5-2ml)，按上述小量碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切鉴定，在1.0％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可见分子大小大约分别为13.6kb(载体带)和1200bp(Bofs)两条带(图4，图4中，泳道1为pRDBofsG的Hind III+Bam HI双酶切图谱；泳道2为双切λDNA大小分子标准---λDNA/HindIII+EcoRI)，并测序鉴定。结果表明，植物表达载体pRDBofsG已经成功地转入农杆菌LBA4404。将酶切和测序鉴定表明含有植物表达载体pRDBofsG的农杆菌LBA4404克隆命名为pRDBofsG/LBA4404。
2、转Bofs融合基因(转pRDBofsG)烟草的获得1)农杆菌的准备挑取携带植物表达载体pRDBofsG的农杆菌LBA4404(pRDBofsG/LBA4404)单菌落，接种于5ml含链霉素(Str)100mg/L和卡那霉素(Kan)50mg/L的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜培养(大约12h)以活化。取活化的农杆菌液，按1∶100的比例加入到含Str 100mg/L和Kan 50mg/L的YEB液体培养基中，继续培养至OD600值为0.4-0.6；5000rpm离心5min，收集菌体；用1/2 MS0液体培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0.1g/L+蔗糖30g/L，pH 5.80)洗涤菌体一次，并将其稀释到离心前菌液3倍体积的1/2 MS液体培养基中，准备侵染用。
2)烟草的转化与转化植株的再生烟草的转化根据叶盘法(Horsch RB等，1985，Science，2271229-1231)进行。选取约30天苗龄的烟草(品种“NC89”，种子购自中国农业科学院)无菌苗，切下鲜嫩浓绿的叶片，用直径9mm的打孔器制取叶盘外植体；将新制备的外植体投入已准备好的农杆菌(LBA4404/pRDBofsG)菌液中，侵染15min；取出叶盘，用高压灭菌的吸水纸吸除叶盘表面残余的农杆菌菌液，置于固体再生培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0.1g/L+BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉0.7％，pH 5.8)上暗处共培养2天；然后将共培养的叶盘转到含有羧苄青霉素(Carb)500mg/L和Kan 50mg/L的固体再生培养基在光下(1500-2500Lx，光16h暗8h)进行筛选培养，每隔2-3周更换一次培养基，并逐渐降低Carb至200mg/L。待Kan抗性芽长到1-1.5cm时，将其切下换到含有Carb 200mg/L和Kan 50mg/L的固体生根培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0.1g/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉0.7％，pH 5.80)上诱导生根。所获得58株完整的卡那霉素抗性的转pRDBofsG烟草植株用于分子鉴定。
3)转pRDBofsG烟草的分子鉴定首先对步骤2)得到的Kan抗性转pRDBofsG烟草植株进行PCR鉴定。根据上述的CTAB法提取转pRDBofsG烟草(Kan抗性株)和未转基因烟草对照株的叶片基因组DNA，用花器官特异性启动子Bofs两端的特异性引物对(引物15’-AAG CTT AGC AGC ACG AAT GAA GTT C-3’；引物25’-GGA TCC TTG TAG5’-AAG CTT AGC AGC ACG AAT GAA GTT C-3’；引物25’-GGA TCC TTG TAGTGA GAA AAC TCG GGG AA-3’)进行PCR扩增，转pRDBofsG烟草均扩增得到大小为1200bp的目标带，而未转化的对照烟草在相应位置则没有扩增出此目标片段(部分PCR扩增结果如图5所示，图5中，泳道1-7为不同的转pRDBofsG烟草(Kan抗性株)T0代植株；泳道NC89为未转基因植株对照(阴性对照)；泳道Bofs为载体质粒对照(阳性对照)；泳道M为DNA大小分子标准(marker))。这一结果初步表明目标基因(Bofs::GUS)已整合到烟草基因组中。
实施例4、转pRDBofsG烟草GUS基因表达的组织化学检测将同时具有卡那霉素抗性和PCR呈阳性的转pRDBofsG烟草T0代株系(株系2、6、7、9、11、12、14)和未转基因的烟草NC89对照植株(CK)试管苗在三角瓶中开口炼苗一周，然后移入装有普通花卉营养土的花盆，在温室中培养，套袋保湿一周后去袋，进行常规管理。
转pRDBofsG烟草GUS基因表达的组织化学检测按照Jefferson RA[1987，PlantMol Biol Rep，5(4)387-405]的方法进行。在花器官的不同发育时期(按照文献(曹克浩，中国农业大学硕士学位论文，水稻Osg6B启动子的序列和功能分析及大肠杆菌argE基因的克隆和对烟草的转化，2003年)方法划分花器官发育时期)，将转pRDBofsG烟草及其对照(烟草品种“NC89”，种子购自中国农业科学院)的新鲜的根、茎、叶、花萼、花瓣、花丝、子房、柱头和花药在X-GLuc溶液中温育24-48h进行染色，然后将染色的植物材料分别用70％和100％的乙醇彻底漂洗脱色和固定，在显微镜下观测样品并拍照。
花器官GUS染色的结果如表1所示，结果表明，未转基因的烟草NC89对照植株(CK)的各个器官都不能染色，而在在检测的转pRDBofsG烟草的7个PCR阳性T0代株系中，所有株系的花药都能不同程度地被染色(图8，图8中A为未转基因的烟草NC89对照植株，B为转pRDBofsG烟草T0植株)。5个株系(除2和12)在花瓣、柱头中不同程度地被染色(图6，图7，图6和图7中A均为未转基因的烟草NC89对照植株，B均为转pRDBofsG烟草T0植株)。在株系6和11中花粉不同程度的被染色(图9，图9中A为未转基因的烟草NC89对照植株，B为转pRDBofsG烟草T0植株)。在所有株系中花丝、子房等均未染出蓝色。这些结果显示出GUS染色的花器官特异性，即表明启动子Bofs具有花器官特异性驱动活性。图6为未转基因对照(A)与转pRDBofsG烟草(B)的花瓣GUS染色；图7为对照(A)与转pRDBofsG烟草(B)的柱头GUS染色。图8为未转基因的对照(A)与转pRDBofsG烟草(B)的花药GUS染色。图9为未转基因的对照(A)与转pRDBofsG烟草(B)的花粉GUS染色。转pRDBofsG烟草的营养器官如根、茎、叶未见GUS活性。
表1、转pRDBofsG烟草T0代的GUS染色
注表中“+”表示GUS染色阳性；“+++”表示染色最强；“-”表示GUS染色阴性，实施例5转pRDBofsG烟草T1代GUS表达将转pRDBofsG烟草T0代株系6、11和14所结的种子(T1代)及其未转基因的对照种子(NC89)表面消毒后接种到含有和不含Kan的种子萌发培养基(1/2MS)，暗培养7天，后置于光下于25±1℃培养。在不含Kan的培养基上，转pRDBofsG烟草和未转基因的对照种子都能够发芽(发芽率95％以上)，并且小苗呈绿色。在含100mg/L Kan的培养基上，未转基因的对照种子的有部分虽然也能够发芽，小苗都白化而死亡；但转pRDBofsG烟草的种子苗有近70％呈绿色，且生长正常。培养30天左右，将转pRDBofsG烟草T0代株系6、11和14的T1代Kan抗性苗各随机选其中一株进行试管培养，得到旺盛生长的大苗后取其营养器官进行GUS染色。T1苗长到有2-3片真叶时取叶盘进行体外抗Kan试验，每个株系随机选留3株发育到成熟，发育过程中，取不同的器官和组织按照前文已述的方法进行GUS染色，以确定转pRDBofsG烟草中Bofs::GUS在T1代表达的稳定性和特异性。结果如表2所示。
表2、转pRDBofsG烟草T1代Kan抗性苗的GUS染色
注表中“+”表示GUS染色阳性；“+++”表示染色最强；“-”表示GUS染色阴性，由表2可以看出，由Bofs驱动的GUS基因在转pRDBofsG烟草中能够稳定地传递给后代，并且GUS基因在所有检测的后代植株试管苗和温室苗的营养器官都不表达，只特异性地在花器官中表达。
上述的实施例结果表明并且确证，本发明所提供的甘蓝(Brassica oleracea L)启动子Bofs不仅具有强驱动性，而且还具有良好的花器官特异性，并且这种强驱动性和特异性能够稳定地传递给后代。因此，本发明所提供的分离自甘蓝(Brassicaoleracea L)的启动子Bofs是一个稳定、驱动力强和特异性高的花器官特异性启动子。
序列表<160>1<210>1<211>1244<212>DNA<213>十字花科芸薹属甘蓝(Brassicia.oleracea L.)<400>1aagcttagca gcacgaatga agttcgtcaa gtttttaatt aggcttcgct tcttgtgatt 60catcgaaaat ttatatcatt tcatacgttc attcttgttt tcatgtgact ttcctcttct120ctaccgtgag tctcatcaat ttcgtagatc gctatgttaa cgatccacgt atcatatata180caccttcttt ctatagccgt acgtatacca cacattacct catcccactt cctaacttat240ataattttac tactcagatc acaagtgtac gtatatcatg aagtcatttc ttctccttgt300cctactcctc tctttctttg tcggctctat cttcgctagt aggaattttc cgacgcaccc360ctatccaagt atgtatgctc ttcaattctc tctcactctc cttaatttta cccacctctt420tcactatctt caacgtcttt taacttgttc aattatgttc gtgtgggtgg gcaggtcata480atcatcatca tgtcggaatg atgggtagga aaatgaagcg tcagaggagg ccggacacgg540tgcaggtggc agggtctagg ctgccggact gctcacacgc gtgtggctca tgctccccat600gccgtcttgt gatggttagc ttcgtgtgtg catcgctaga ggaggctgag acttgtccca660tggcttataa gtgcatgtgc aagaacaaat cctaccccgt cccatgatga attagcctct720ctcacactta actctgtgca ttcagacgtt ttgtttcttt ccttttgctt cttcggataa780atgaccatgt gtatgtataa aatgcatctt ttcctttttt taattctgtt tgtctttttg840atatcttaaa cacagtttta cgaaacaaga ataagattag ttgagccact caaaagcgtg900gtcgactaaa ttgaaacaga aagccacaca actcattggg ctcttgttta tggcccatga960caccgcattt cagactgcaa caaccaaagt tgtagaaaga ataatattta aagggcacgt 1020acatacgttg ttggcttcca ccaaactttg gaggctctct aataattagc acactccatt 1080ctatgcattt gttacacacc ttctattttc aaccatttca tctcaccttt tttaaatgtt 1140tccacagtta gctcagtaaa ttcactatat acagacatac accttccctc cacaagacca 1200aacaaccaca ctaccttccc cgagttttct cactacaagg atcc1244<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2aagcttagca gcacgaatga agttc25<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3ggatccttgt agtgagaaaa ctcggggaa29
权利要求
1.一种植物花器官特异性启动子，其特征在于它的核苷酸序列是(1)、序列表中序列1所述的核苷酸序列；或(2)、与(1)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或(3)、与(1)或(2)所述的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性的核苷酸序列；或(4)、与(1)、(2)或(3)所述的核苷酸序列在严谨杂交条件下能够杂交的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述的启动子的表达盒。
3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于所述启动子的下游连接所述花器官特异性启动子的下游连接结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小RNA。
4.含有权利要求1所述启动子的重组表达载体。
5.含有权利要求2或3所述的表达盒的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体是由权利要求2或3所述的表达盒与质粒、病毒或运载体表达载体所构建的重组载体。
7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为双元载体或共合载体。
8.由权利要求4-7任一所述的重组表达载体转化植物细胞或植物组织或植物器官得到的转基因植物细胞或组织或器官。
9.权利要求1所述的花器官特异性启动子在培育不同花形、花色、花香和/或长货架寿命花卉植物或作物品种和/或品系、培育“飞絮”消除或大幅度减少的飞絮园林绿化植物或作物品种和/或品系、培育授粉受精能力增强或者减弱的植物或作物品种和/或品系或者是培育能够防止通过花粉漂移而污染其野生种和近缘种的转基因植物或作物品种和/或品系中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述植物是显花植物；优选为陆生植物。
11.一种权利要求1所述的花药特异性启动子的获得方法，是以甘蓝的基因组DNA为模板，用核苷酸序列是序列表中序列2和核苷酸序列是序列表中序列3的一对引物进行PCR扩增得到启动子。
全文摘要
本发明公开了一种植物花器官特异性启动子及其应用。该启动子的核苷酸序列是(1)序列表中序列1所述的核苷酸序列；或(2)，与(1)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或(3)，与(1)或(2)所述的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性的核苷酸序列；或(4)，与(1)，(2)或(3)所述的核苷酸序列在严谨杂交条件下能够杂交的核苷酸序列。本发明的启动子是一个稳定、驱动力强和特异性高的花器官特异性启动子。利用本发明的启动子可以培育花形、花色、花香和育性等不同于受体野生型的花卉作物新品种、培育雄性不育作物品种和培育消除或大幅度减少的“飞絮”的园林绿化植物等。
文档编号C12N15/10GK101063138SQ200710098728
公开日2007年10月31日 申请日期2007年4月25日 优先权日2007年4月25日
发明者肖兴国, 耿安奇, 赵占军, 聂绚丽 申请人:中国农业大学 被以下专利引用 (1),