专利名称：一种治疗自身免疫病的方法
背景技术：
发明领域本发明一般地涉及一种方法，用于治疗或缓解自身免疫病(例如，但是不限于自身免疫性糖尿病)的症状，或者降低或最小化发展为该疾病的危险。更具体而言，本发明涉及遗传修饰的造血干细胞和/或造血祖细胞的用途，它们表达编码一种或多种自身抗原的遗传物质，产生可诱导免疫耐受和/或保护性免疫的抗原呈递细胞。因此本发明提供一种治疗和/或预防自身免疫病如I型糖尿病的方法。
现有技术描述本说明书中提到的参考文献的详细目录在本说明书结尾处列出。
本说明书中对任何现有技术的提及不是，也不应被视为承认或者以任何形式提示该现有技术是任一国家的公知常识的一部分。
胰岛素依赖型或I型糖尿病是由于自身免疫介导的胰岛β细胞破坏导致胰岛素缺乏而引起的。I型糖尿病个体需要定期注射胰岛素来控制血糖水平。如果这样不能治疗个体，则可能导致死亡。
以预防自身免疫病作为主要目标，需要一个更长期的治疗策略。
胰脏移植是目前唯一的可治愈I型糖尿病的疗法，但是需要可能有毒的、终生使用的免疫抑制剂以及捐赠人的死亡都阻碍了该疗法的应用。
最近，在临床上已经利用骨髓(BM)或造血干细胞(HSC)移植治疗重度自身免疫病(Burt等人，Blood 99768-784，2002)。在临床前动物模型上，对自发性自身免疫病的有效治疗需要从抗病株移植BM或HSC。迄今为止，这已经通过同种异体BM移植(BMT)实现(Ikehara等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 827743-7747，1985；LaFace和Peck，Diabetes38894-901，1989；EI-Badri等人，Transplantation 70870-877，2000；Himeno和Good，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852235-2239，1998；Kirzner等人，Biol.Blood Marrow Transplant.6513-522，2000)，产生全部或混合的嵌合性(Li等人，J.Immunol.156380-388，1996；Kaufman等人，J.Immunol.1582435-2442，1997)。然而，对宿主细胞毒性条件形成(conditioning)的要求和移植物排斥(Castro-Malaspina等人，Blood991943-1951，2002)或移植物抗宿主病的危险(Ratanatharathorn等人，Bone Marrow Transplant 28121-129，2001)使得该方法不适合广泛临床应用。
因此，需要发展防止自身免疫性糖尿病以及其它自身免疫病进展的其它策略和方法。
发明概述在本说明书中，除非上下文需要，否则单词“包含(comprise)”或其变化形式(如“comprises”或“comprising”)可以被理解为包括所述组分或整体或一组组分或整体，但是不排除其它任何组分或整体或一组组分或整体。
使抗原靶向静止的抗原呈递细胞(APC)，如B细胞、树突细胞、上皮细胞或巨噬细胞，被认为是诱导免疫无应答性(耐受)和/或保护性免疫的一种方法。由于所有免疫细胞都来源于造血干细胞(HSC)和造血祖细胞(HPC)，根据本发明，提出编码自身抗原的HSC和/或HPC将会发育为表达该自身抗原的APC。它们然后作为预防自身免疫病的抗原特异性治疗。同系HSC和/或HPC移植使宿主不需要条件形成方案(conditioning regimens)，是预防或治疗自身免疫病的一种新的安全、有效的策略。
对于自身免疫性糖尿病，胰岛素原被认为是关键的自身抗原。
因此，根据本发明，编码胰岛素原的HSC和/或HPC的同系移植使得胰岛素原能够在静止APC中表达，这可防止自身免疫性糖尿病的发展。这是一种安全、有效的抗原特异的策略，适用于自身免疫性糖尿病以及其它一些自身免疫病。
因此，本发明涉及一种方法，用于防止或者降低动物或鸟类种中发展自身免疫介导的疾病的危险，和/或降低疾病的严重程度。该方法包括从将要治疗的动物或鸟类种中或者从相容的供体中采集HSC和/或HPC，遗传修饰某些或全部HSC和/或HPC，使其表达编码一种或多种与特定自身免疫病有关的自身抗原的遗传物质，并将它们导入将要治疗的动物或鸟类种中。APC呈递自身抗原被认为可诱导T细胞无应答性或耐受和/或保护性免疫。HSC和/或HPC可以从骨髓中采集，或者从外周血、脐带血或其它合适的部位如肝脏中分离。一旦遗传修饰，通常即将这些细胞输入实验对象中，使得它们进入外周血。这种施用途径包括输注或者例如通过门静脉导入肝脏中。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种产生抗原呈递细胞(APC)的方法，该APC呈递与自身免疫病有关的自身抗原，该方法包括从实验对象中采集造血干细胞(HSC)和/或造血祖细胞(HPC)样品，在一定条件下向一种或多种HSC和/或HPC内导入编码该自身抗原的遗传物质，在该条件下该遗传物质得到表达，致使HSC和/或HPC产生该自身抗原。
在一个优选实施方案中，所述自身免疫病是I型糖尿病。然而本发明也涉及许多自身免疫病。对于自身免疫性糖尿病，优选的自身抗原是胰岛素原或其抗原片段或部分。
最优选的动物是人，但是本发明也涉及其它灵长类动物以及家畜、实验动物、宠物(companion animals)、捕获的野生动物和鸟类种，如笼养的(鸟舍)鸟类、家禽和猎鸟。
本发明提供多区室形式的试剂盒，该试剂盒包含适合接受来自实验对象的HSC和/或HPC来源的第一个区室；适合包含编码自身抗原的遗传物质的第二个区室；任选的适合包含试剂的第三个或更多的区室，其中该试剂盒包含方法使用说明书，该方法包括从实验对象中采集造血干细胞(HSC)和/或造血祖细胞(HPC)样品，在一定条件下向一种或多种HSC和/或HPC内导入编码该自身抗原的遗传物质，在该条件下该遗传物质得到表达，致使HSC和/或HPC产生该自身抗原。
表1提供了此处使用的缩写列表。
表1缩写
附图简述
图1是一张图示，显示NOD-PI BM移植抑制糖尿病的发展。(A)与NOD BM(▲)(P＝0.003)或未处理的NOD小鼠(■)(P＝0.001)相比，NOD-PI BM()受者的糖尿病发病率显著下降。NOD BM受者与未处理的对照没有不同。数据来自两个实验，其中来自NOD-PI或NOD小鼠的BMT平行进行。(B)与T细胞消耗的NOD BM(▲)(P＝0.003)或未处理的NOD小鼠(■)(P＝0.036)相比，T细胞消耗的NOD-PI BM()受者的糖尿病发病率显著下降。NOD BM受者与未处理的对照没有不同。数据来自三个实验，其中来自NOD-PI或NOD小鼠的BMT平行进行。
图2是显微照片和图解表示，显示移植T细胞消耗的NOD-PI BM预防胰岛炎而不预防涎腺炎。(A)没有炎症浸润的胰岛(胰岛炎)在NOD-PI BM受者中常见，而当存在浸润时，只局限于胰岛周围(箭头)。(B)广泛浸润的胰岛(*)在NOD BM受者中常见。(C)与NOD BM()细胞相比，T细胞消耗的NOD-PI BM(▲)的受者胰岛炎显著减少(P＝0.008)。包括年龄匹配的NOD(■)和NOD-PI(◆)小鼠的数据进行比较。(D)舌下腺炎症病灶数量(涎腺炎得分)在BMT与未处理的小鼠之间没有不同。各个小鼠的得分均来自两个实验，其中来自NOD和NOD-PI小鼠的BMT平行进行(水平线条表示平均值)。
图3图解显示NOD-PI造血干细胞(HSC)或造血祖细胞(HPC)的转移防止糖尿病的发展。(A)与NOD HSC受者(▲)(P＝0.019)或未处理的NOD小鼠(■)(P＝0.029)相比，NOD-PI HSC受者()的糖尿病发病率显著降低。NOD HSC受者和未处理的NOD小鼠没有显著不同。(B)与NOD HPC受者(▲)(P＝0.035)或未处理的NOD小鼠(■)(P＝0.021)相比，NOD-PI HPC受者()的糖尿病发病率显著降低。NOD HPC受者和未处理的NOD小鼠没有显著不同。数据来自一个(A)或者两个(B)实验，其中来自NOD-PI和NOD小鼠的BMT平行进行。
图4提供图示和列表数据，显示T细胞消耗的NOD或NOD-PI BM的受者中外周血白细胞(PBL)的重建。(A)与未处理的年龄匹配的NOD小鼠(■)相比，NOD()和NOD-PI(▲)T细胞消耗的BM受者在照射和BMT后10-14天PBL明显消耗，到第8周时重建。(B)在来自NOD或NOD-PI供者的T细胞消耗的BM的受者中，PBL亚群类似地重建，与年龄匹配的NOD对照相似。数据是两个实验的平均值±SD，其中来自NOD和NOD-PI小鼠的BMT平行进行。
图5是显示对卵清蛋白(OVA)免疫的T细胞回忆应答的图示。在BMT后100天，用OVA皮下免疫小鼠，14天后测定对脾T细胞的回忆应答。在OVA存在下的T细胞增殖类似于年龄匹配的对照NOD小鼠(■)和T细胞消耗的NOD()或NOD-PI(▲)BM的受者。空心符号表示在没有OVA的情况下的增殖。数据来自三个不同实验中的个体小鼠，其中NOD和NOD-PI BMT平行进行。
图6是在GM-CSF/IL-4或GM-CSF/TGF-β1中培养的BM的图示，细胞在第5天收集，细胞表面标志通过流式细胞术分析。数字表示属于这四分之一的细胞的百分数(A)。GM-CSF/IL-4或GM-CSF/TGF-β1培养的BM在第5天收集，胞吞活性通过FITC-葡聚糖摄取法测定。曲线显示来自GM-CSF/IL-4培养的BM的CD11c-门控细胞的FITC-葡聚糖摄取对CD86表达，或者大量GM-CSF/TGF-β1培养的BM的FITC-葡聚糖对CD11c表达(B)。BM在GM-CSF/TGF-β1中培养，在第5天收集细胞。在Gr-1+和CD11c+细胞上表达的细胞表面标志用4色流式细胞术分析。左上点线图显示用于分析Gr-1+-门控和CD11c+-门控细胞的门控。直方图覆盖图显示Gr-1-门控的(阴影)和CD11c-门控的(空心)细胞(C)。来自G+T BM的iDC表达低水平的MHC II类和共刺激分子，在混合淋巴细胞反应(MLR)中是弱刺激剂。
图7是一张图示，显示当静脉内转移给4周龄雌性NOD小鼠时，来自NOD-PI而非对照NOD小鼠的G+T BM显著抑制(β＜0.01)糖尿病的发展。
图8是一系列流式细胞分析斑点印迹，显示G+T BM除了CD11c+/CD11b+/Gr-1-iDC之外还含有大量未分化的CD11c-/CD11b+/Gr-1+骨髓细胞。
图9是一张图示，显示编码胰岛素原的Gr-1+细胞抑制在4周时治疗的糖尿病。
图10是一张图示，显示编码胰岛素原的Gr-1+细胞抑制在4周时治疗的糖尿病(1.8×106CD11c-消耗的，静脉内)。
图11是在体内分化为CD11c+/MHC II类+DC的Gr-1+骨髓细胞的照片图示。通过消耗CFSE-标记的、直接注射到脾脏内的CD11c+细胞，从GM-CSF/TGF-β1-培养的胰岛素原-NOD BM中纯化Gr-1+细胞。染色脾脏的冷冻切片，进行免疫荧光分析。CFSE标记和抗体标记的细胞的定位通过免疫荧光显微镜检查进行。系列图显示CFSE标记的细胞(左图)、用德克萨斯红偶联的mAb显示的细胞(中图)和合并的图像(右图)。
发明详述本发明提供一种安全、有效的治疗和/或预防自身免疫病的方案。
该方案通常包括下列步骤(i)从实验对象中采集HSC和/或HPC样品；(ii)遗传修饰所有或某些HSC和/或HPC，使得HSC和/或HPC产生一种或多种与自身免疫病有关的自身抗原；和(iii)将遗传修饰的HSC和/或HPC导入同一实验对象中或相容的实验对象中，它们最终成为表达该自身抗原的APC。
上述步骤可以组合和/或改变顺序。也可以包括其它步骤。
“实验对象”如人类实验对象，以及动物或鸟类实验对象。用于所处理的动物时，术语“个体”和“实验对象”可以互换使用。“动物”包括人、灵长类动物、家畜(例如绵羊、马、牛、马、驴、山羊、猪)、实验动物(例如兔、小鼠、大鼠、豚鼠)、宠物(例如狗、猫)或捕获的野生动物。“鸟类种”包括笼养或鸟舍饲养的鸟类、家禽(例如鸡、矮脚鸡、鹅、火鸡)和猎鸟。
在医学上最优选的动物是人。然而，本发明也涉及该方案减少非人类动物的自身免疫病的兽医用途。
HSC和/或HPC通常从骨髓标本中获得，例如向髋骨内钻孔。然而，本发明进一步涉及从外周血(包括脐带血和肝脏血液)中分离以及必要时分选HSC和HPC。通常将这些细胞导入受者中，例如，通过向外周血系统中注射或输注，或者经门静脉注射或输注到肝脏中。然而，直接导入受者的骨髓中虽然不是优选的，但是本发明也包括。
对于从中分离HSC和/或HPC的动物种的实验对象和接受这些细胞的实验对象而言，本发明的方法可以是“同基因的”、“异基因的”或是“异种的”。“同基因”方法是指作为HSC和/或HPC来源的实验对象与经遗传修饰的HSC和/或HPC的受者有相同的MHC基因型。“异基因”方法是HSC和/或HPC来自与将要导入HSC和/或HPC的实验对象MHC-不相容的实验对象。“异种”方法是HSC和/或HPC来自与导入HSC和/或HPC的实验对象不同的种。优选地，本发明的方法以同基因方法进行。应当理解，当使用异基因或异种方法时，可能必须修改此方案，使得可能由于外源免疫活性细胞混合引起的所有免疫应答最小化。
因此，本发明涉及一种方法，用于防止或最小化实验对象发展自身免疫病的危险，或者减少其严重程度，该方法包括向该实验对象中导入遗传修饰的HSC和/或HPC，使得它们产生一种或多种与该自身免疫病有关的自身抗原。
更具体而言，本发明提供一种产生抗原呈递细胞(APC)的方法，该APC呈递与自身免疫病有关的自身抗原，该方法包括从实验对象中采集造血干细胞(HSC)和/或造血祖细胞(HPC)样品，在一定条件下向一种或多种HSC和/或HPC内导入编码该自身抗原的遗传物质，在该条件下该遗传物质得到表达，致使HSC和/或HPC产生该自身抗原。
HSC和/或HPC发育为表达特定自身抗原的APC。APC的例子包括但不限于树突细胞、B淋巴细胞、上皮细胞或巨噬细胞。
如上所述，实验对象包括人、非人类动物和鸟类实验对象。优选地，实验对象是人。实验对象(例如人)可能患有临床前糖尿病，或者可能具有发展为糖尿病的危险，或者可能患有临床糖尿病。
同样如上所述，该方法可能包括对实验对象同基因地、异基因地或异种地施用HSC和/或HPC。然而，同基因方案是优选的。
因此，在一个优选实施方案中，本发明提供一种方法，用于防止或最小化实验对象发展自身免疫病的危险，或者减少其严重程度，该方法包括向该实验对象中导入遗传修饰的同基因HSC和/或HPC，它们产生一种或多种与该自身免疫病有关的自身抗原。
优选的自身免疫病是自身免疫性糖尿病，也被称为I型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病。然而，本发明也涉及所述方案在治疗多种自身免疫病中的用途。唯一的标准是知道与该疾病有关的自身抗原。此处涉及的自身免疫病的例子尤其包括系统性红斑狼疮、局限性肠炎、心肌病、溶血性贫血、纤维肌痛、格雷夫斯氏病、溃疡性结肠炎、血管炎、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、中性粒细胞减少症、银屑病、慢性疲乏综合征、幼年型关节炎、青少年糖尿病、硬皮病、银屑病关节炎、口腔干燥-风湿性关节炎综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、桥本氏病、混合性结缔组织病、间质性膀胱炎、恶性贫血、白质脑炎、斑秃、强直性脊柱炎、原发性胆汁性肝硬变、抗GBM肾炎、抗TBM肾炎、抗磷脂综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、自身免疫性阿狄森氏病、慢性活动性肝炎、白癜风、自身免疫性高脂血症、自身免疫性心肌炎、颞动脉炎、自身免疫性甲状腺病、轴突和神经元神经病、贝切特氏病、大疱性类天疱疮、变应性哮喘、骨关节炎、恰加斯氏病、葡萄膜炎、慢性炎性脱髓鞘性多神经病(CIDP)、疤痕性类天疱疮/良性黏膜类天疱疮、寇甘氏综合征、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇病毒性心肌炎、脱髓鞘性神经病、皮肌炎、盘状狼疮、晶状体抗原性色素层炎、结节性多动脉炎、德雷斯勒氏综合征、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、埃文斯综合征、肺出血肾炎综合征、变应性鼻炎、传染性神经元炎、低丙球蛋白血症、包涵体肌炎、水泡大疱疹(vesiculobullous)皮肤病、韦格纳肉芽肿、梅尼尔氏病、兰伯特-伊顿综合征、莫伦氏溃疡、非典型乳糜泻、眼疤痕性类天疱疮、寻常型天疱疮、静脉周脑脊髓炎、心包切开术后综合征、巩膜炎、精子睾丸自身免疫、僵人综合征、亚急性细菌心内膜炎(SBE)、交感性眼炎、横贯性脊髓炎和坏死性脊髓病、I型自身免疫性多腺性综合征、II型自身免疫性多腺性综合征、恶性贫血和子宫内膜异位症。
根据一个优选实施方案，本发明涉及一种方法，用于防止、最小化人类实验对象发展自身免疫性糖尿病的危险，或者减少其严重程度，该方法包括对该人类实验对象施用从该人类实验对象或同基因实验对象中分离的有效量的HSC和/或HPC，这些HSC和/或HPC被遗传修饰，使得它们表达与自身免疫性糖尿病有关的自身抗原。
优选的自身抗原是胰岛素原或其免疫原性同系物或抗原衍生物、局部、片段或部分。胰岛素原通常来源于人，但是也涉及例如来自猪、绵羊、马、山羊、小鼠或大鼠的人源化胰岛素原分子。
根据一个最优选的实施方案，本发明提供一种方法，用于防止、最小化人类实验对象发展自身免疫性糖尿病的危险，或者减少其严重程度，该方法包括对该人类实验对象施用从该人类实验对象或同基因实验对象中分离的有效量的HSC和/或HPC，这些HSC和/或HPC被遗传修饰，使得它们产生胰岛素原。
在此提出，同基因移植基因修饰的HSC和/或HPC是一种新的抗原特异的免疫治疗方法，它发展了从造血区室内调节自身免疫病的原理。
优选地，所述自身免疫病是糖尿病，所述自身抗原是胰岛素原，因为胰岛素原含有与人类(Rudy等人，Mol.Med.1625-633，1995)和小鼠(Chen等人，J.Immunol.1674926-4935，2001)I型糖尿病有关的T细胞表位。在导致本发明的研究中，发明人发现，转基因表达通过MHC II类启动子靶向APC的胰岛素原的NOD小鼠(French等人，1997，同上)所含的骨髓能够在对野生型NOD小鼠骨髓移植后过继转移针对自身免疫性糖尿病的保护。针对糖尿病的保护在接受NOD-PI小鼠骨髓的受者中强烈。通过转移高度纯化的HSC或HPC，保护可能是由移植的HSC/HPC的APC后代引起的，而不是在完整的或T细胞消耗的骨髓中转移的其它潜在免疫调节细胞引起的。最重要的是，转移少量遗传修饰的HSC可完全预防糖尿病。HSC移植也证明野生型NOD HSC转移的糖尿病是由于致糖尿病T细胞的从头产生，而不是致糖尿病T细胞的转移。但是，在预计APC表达胰岛素原的小鼠中，致糖尿病T细胞显然不会发育或者不能获得效应功能。这些结果证实了遗传修饰的HSC作为自身免疫病预防的一种治疗工具的原理。
发生抗原呈递的背景控制T细胞免疫的平衡(Garza等人，J.Exp.Med.1912021-2027，2000；Frazer等人，J.Immunool 1676180-6187，2001)。静止APC呈递的抗原诱导T细胞的失活(Niimi等人，1998，同上；Finkelman等人，1996，同上；Hawiger等人，2001，同上)，并且抑制抗原特异性抗体的产生(Finkelman等人，1996，同上)。通过转基因靶向的抗原表达，显示树突细胞(DC)在抗原特异性T细胞的胸腺消耗中起重要作用(Brocker等人，J.Exp.Med.185541-550，1997)。重要的是，也描述了在施用DC靶向抗原后周围T细胞应答的抑制(Finkelman等人1996，同上；Hawiger等人，2001，同上)。控制(harness)外周免疫耐受机制的能力可能是用自身反应性T细胞对实验对象进行自身抗原特异性免疫治疗的关键。
发明人利用放射对原粒细胞的调节顺应(conditioning)帮助供者HSC的最大移植，但是对于患有临床前自身免疫性糖尿病的无症状者，这将不能接受。然而，由于不存在MHC障碍，该方法适合不需要毒性骨髓移植前调节顺应(conditioning)的方案。使用来源于转基因小鼠的HSC，避免了对离体的遗传工程HSC的需要，后者是HSC治疗的一个主要障碍。为了人用，需要能够有效转导HSC的载体，以在移植后长期基因表达。通过人HSC的慢病毒-载体转导，基因表达能够有效地针对体内的MHC II类+APC(Cui等人，Blood 99399-408，2002)。因此，任选地在细胞因子诱导的活动化后，从外周血中采集HSC和/或HPC，遗传修饰并且再输注的策略是治疗自身免疫病的优选方法。
因此，本发明的另一方面涉及一种方法，用于治疗人类糖尿病或者降低发展为该病的危险或者降低其严重程度，该方法包括(i)从外周血或骨髓中分离HSC和/或HPC，任选地包括细胞因子介导的HSC和/或HPC活动化的步骤；(ii)遗传修饰该HSC和/或HPC，使得这些细胞产生胰岛素原或其免疫原性同源物、抗原衍生物、局部、片段或部分，并且继续作为APC；和(iii)将遗传修饰的细胞输注或导入人类实验对象中。
遗传修饰HSC和/或HPC包括将编码胰岛素原或其它自身抗原的核酸分子导入细胞基因组内。核酸分子通常是DNA。该DNA可以编码一种全长自身抗原、多种全长自身抗原或者一种或多种携带抗原表位的自身抗原的一个或多个片段。
本发明的再另一方面提供一种载体，该载体可用于导入编码一种自身抗原如胰岛素原的遗传物质，该载体含有编码该自身抗原或其抗原片段的核苷酸序列和一种选择性标记。
载体中的选择性标记允许筛选已经稳定掺有编码自身抗原的DNA的靶细胞。当使用相对低效的转化技术如电穿孔、磷酸钙沉淀和脂质体融合时(1000个细胞中一般只有不到1个稳定掺有外源DNA)，这是特别有用的。利用高效方法，如病毒载体和向核内显微注射，一般5-25％的细胞掺有DNA；因此，直接筛选靶细胞是可行的，而不需要首先根据选择性标记的稳定整合筛选。可以使用等基因或非等基因DNA。
选择性标记的例子包括提供对化合物如抗生素抗性的基因，提供在选择的底物上生长的能力的基因，编码产生可检测信号如发光的蛋白质的基因。已经知道并且可以使用许多这样的标记，包括，例如抗生素抗性基因，如新霉素抗性基因(neo)和潮霉素抗性基因(hyg)。选择性标记也包括提供在某些介质底物上生长的能力的基因，如tk基因(胸苷激酶)或hprt基因(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶)，它们提供在HAT培养基(次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷)上生长的能力；和细菌gpt基因(鸟嘌呤/黄嘌呤磷酸核糖基转移酶)，它允许在MAX培养基(霉酚酸、腺嘌呤和黄嘌呤)上生长。供哺乳动物细胞使用的其它一些选择性标记和携带多种选择性标记的质粒在Sambrook等人，Molecular Cloning-A LaboratoryManual，Cold Spring Harbour，New York，USA，1990中描述。
选择性标记可能依赖其自身的启动子进行表达，标记基因可能来源于与目标生物非常不同的生物(例如在目标哺乳动物细胞中使用的原核标记基因)。然而，优选地将原来的启动子替换为已知在受者细胞中起作用的转录机器。有大量转录起始区可用于这些目的，包括，例如金属硫蛋白启动子、胸苷激酶启动子、β-肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、SV40启动子和人巨细胞病毒启动子。一个广泛使用的例子是pSV2-neo质粒，它含有在SV40早期启动子控制下的细菌新霉素磷酸转移酶基因，赋予哺乳动物细胞对G418(与新霉素有关的一种抗生素)的抗性。可以利用其它大量变异来提高选择性标记基因在动物细胞中的表达，如添加poly(A)序列，添加合成翻译起始序列。组成型和诱导型启动子都可以使用。
该DNA优选地通过同源重组修饰。靶DNA可能位于HSC或HPC的任何细胞器中，包括核和线粒体，可以是完整的基因、外显子或内含子、调节序列或基因之间的任何区域。
同源DNA是与参照DNA序列至少70％相同的DNA序列。两个序列同源的一个标志是它们在严格条件下可彼此杂交(Sambrook等人，1990，同上)。
本发明也提供一种多区室形式的试剂盒，该试剂盒包含适合接受来自实验对象的HSC和/或HPC来源的第一个区室；适合包含编码一种自身抗原的遗传物质的第二个区室；任选的适合包含试剂的第三个或更多的区室，其中该试剂盒包含一种方法的使用说明书，该方法包括从实验对象中采集造血干细胞(HSC)和/或造血祖细胞(HPC)样品，在一定条件下向一种或多种HSC和/或HPC内导入编码该自身抗原的遗传物质，在该条件下该遗传物质得到表达，致使HSC和/或HPC产生该自身抗原。
在一个有关方面，本发明进一步提供一种药物试剂盒，其含有适用于从外周血或骨髓中分离HSC和/或HPC的试剂和/或区室；为了表达编码胰岛素原或其抗原部分或另外一种与自身免疫性糖尿病有关的自身抗原的DNA，对它们的遗传操作；和/或将遗传修饰的细胞再导入实验对象的外周血系统或骨髓中的单元。
本发明通过下列非限制性实施例进一步描述。
实施例1一般方法小鼠NOD(非肥胖糖尿病)和NOD.scid小鼠在无特定病原体条件下饲养。在MHC II类(I-Eα)启动子控制下的小鼠胰岛素原II的转基因NOD小鼠(NOD-PI)(French等人，Diabetes 4634-39，1997)在培育为纯合子后使用。由于自发性糖尿病的发病率在野生型NOD雌性中最高，因此只使用雌性作为受者和骨髓(BM)供者。
抗体和流式细胞术流式细胞分析如(Steptoe等人，J.Immunol.1685032-5041，2002)所述进行。下列单克隆抗体从组织培养上清液中纯化，然后在偶联反应中使用抗Gr-1抗体(Ly-6G；RB6-8C5)、F4/80(F4/80)、CD11b(5C6或M1/70)、CD11c(N418)、MHC II类(10.2.16[I-Ak，g7，r，f，s])、MHC I类(M1/42)、M-CSF R(AFS-98)、CD40(FGK-45)、B220(RA3-6B2)和CD86(GL-1)链霉抗生物素(SA)-荧光染料偶联物(SA-FITC、SA-藻红蛋白、SA-别藻蓝蛋白、SA-得克萨斯红)、抗CD4(CT-CD4)、CD8α(CT-CD8α)的单克隆抗体，FITC、PE和Tricolor链霉抗生物素偶联物来自Caltag(Burlingame，CA)。抗-CD3(145-2C11)，SCA-1(E13-161.7)、CD40(3/23)、MAC-3(M3/84)、CD13(R3-242)、CD62-L(MEL-14)、CD31(MEC13.3)、CD43(S7)、CD11a(2D7)、CD49d(R1-2)的单克隆抗体购自PharMingen(San Diego，CA)。另外也使用抗小鼠FIRE、抗-CD3(KT3)、c-kit(ACK-2)。
为了分析PBL，用细玻璃毛细管对小鼠眼眶后静脉窦穿刺进行采血。将血液收集在Alsever′s抗凝血剂中，裂解红细胞，染色白细胞，通过流式细胞术进行分析。根据获得的血容量校正用血细胞计数器测定的白细胞数。为了控制实验间变异，每次分析包括三只年龄匹配的雌性NOD。将脾脏压过不锈钢网，细胞悬浮在含有10％v/v FCS的RPMI中。
BM制备和转移小鼠(8-12周龄)施行安乐死，股骨和胫骨收集到小鼠渗压冷磷酸缓冲盐液(PBS)中。BM用冰冷的含有2.5％v/v FCS(F2.5)(TraceScientific，Melbourne Australia)的PBS冲洗，通过NH4Cl/TRIS缓冲液裂解除去红细胞。BM在F2.5中洗涤，离心收集。为了消耗T细胞，BM重悬浮于F2.5中，在4℃下与抗-CD3 mAb(KT3，5μg/ml)温育30分钟，然后用F2.5洗涤。抗体标记的细胞用抗大鼠IgG免疫磁珠(Dynabeads，Dynal Biotech，Carlton South，Victoria，Australia)消耗。对于分选的HSC或HPC，谱系标记阳性的细胞用预定最佳浓度的FITC-偶联的谱系特异性mAb(KT3、M1/70、RA3.6B2、RB6-8C5、TER-119)混合物通过免疫磁珠消耗。其余的细胞用抗-c-kit-藻红蛋白标记。为了分离HSC，谱系消耗的细胞也用抗-SCA-1-生物素共染色，洗涤，用链霉抗生物素-Tricolor染色。Lin-/c-kit+/SCA-1+(HSC)或iin-/c-kit+(HPC)细胞通过无菌分选收集(FACSII，Becton Dickinson，San Diego，CA)。照射的小鼠间隔2-3小时分两次相等剂量，接受总共950cGy(Theratron60Co，Theratronics，Kanata，ON，Canada)。细胞(107BM或T细胞消耗的BM，除非另外说明)悬浮于PBS中，对于照射的小鼠，在照射1-3小时后，腹膜内注射250μl或者静脉内注射100μl HSC(103)和HPC(2.5×104)。照射的小鼠在BMT后保持添加新霉素的饮用水3周。在BMT后紧接阶段显示身体应激指征的所有小鼠都施以安乐死，并从分析中排除。
T细胞回忆应答用完全弗氏佐剂(Difco，Detroit，MI)中的100μg卵清蛋白(OVA)(Grade V，Sigma St Louis，MO)在胁部皮下免疫小鼠。14天后从安乐死的小鼠中收集的脾脏压过不锈钢网，将细胞悬浮于含有10％v/v FCS(Trace Scientific，Melbourne Australia)、10-3M丙酮酸钠、10-4M非必需氨基酸(GIBCO)、2×10-3M谷氨酰胺、5×10-5M 2-巯基乙醇(Sigma)的RPMI培养基(GIBCO，Rockville，MA)中。在存在或不存在OVA(100μg/ml)的情况下一式三份平板接种脾细胞(2.5×105细胞/孔，200μl，96孔平底板)。第4天将细胞收集到玻璃滤器垫上。在最后18小时培养过程中加入3H-胸苷(1μCi/孔)。用闪烁计数器(Topcount，Packard，Groningen，The Netherlands)测量反映细胞增殖的掺入的放射性，结果表示为平均刺激指数(SI)±标准差。
糖尿病的监测每周用Diastix检验条(Bayer，Pymble，NSW Australia)尿检小鼠的葡萄糖。对于糖尿病小鼠，用一种仪器(Accu-Chek，Roche，Castle Hill，NSW，Australia)测量血糖。当连续两次血糖读数均＞12.0mM时，认为小鼠患有糖尿病。当小鼠患糖尿病或者显示身体应激指征时，对其施行安乐死。
胰岛炎和涎腺炎的评价从安乐死的小鼠中取出胰腺，置于Bouin′s固定剂中24小时，然后转移到70％v/v乙醇中。固定的组织包埋于石蜡中，制备间隔250-300μm的H&E染色的切片。胰岛炎如(Leiter，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79630-634，1982)所述以隐蔽方式(masked fashion)打分。取出舌下腺，如胰腺所述制备。计数存在的炎症病灶的数量，表示为每个切片的平均数。
统计学分析卡普兰-迈耶存活曲线的比较用时序检验进行(GraphPad Prism，GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)。BMT组之间的胰岛炎得分通过Student-t-检验比较。
实施例2NOD-PI骨髓移植防止糖尿病将来自NOD或NOD-PI小鼠的全BM移植给照射的4周龄雌性NOD受者。发病略微延迟，而NOD BM受者的糖尿病总发病率(7/12)类似于未处理的对照(15/23)(图1A)。相反，对于NOD-PI BM受者，糖尿病几乎被完全防止(1/16，P＝0.0032)(图1A)。NOD小鼠具有固有的发展胸腺瘤的高危险，可因免疫监视受损或者暴露于致电离辐射而加重(Prochazka等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 893290-3294，1992；Shultz等人，J.Immunol.1642496-2507，2000)。排除尸检诊断为胸腺瘤的小鼠提高了这两组中糖尿病小鼠的比例(NOD 7/10，NOD-PI 1/5)，但是这两组之间糖尿病发病率的差异仍然显著(P＝0.041)。由于它们的无糖尿病存活期较长，NOD-PI BM受者的胸腺瘤比例(11/16)高于NOD BM受者(2/12)。
实施例3T细胞消耗不改变移植的NOD-PI BM的保护作用不同的研究发现，NOD BM中的成熟T细胞能够将糖尿病转移给免疫缺陷的NOD.scid小鼠。因此，在转移整个BM之后，糖尿病的发展可能反映转移的成熟T细胞的致糖尿病能力。但是已经发现，完整NOD BM将糖尿病转移给至少50％的未照射的T细胞缺陷NOD.scid小鼠，而接受来自NOD-PI小鼠的BM的小鼠均未发展为糖尿病。
由于NOD BM中的成熟T细胞能够转移糖尿病，而NOD-PI中的成熟T细胞不能，检测了将T细胞消耗的BM移植给照射的4周龄小鼠的作用。T细胞消耗的NOD BM的受者发展为糖尿病的比率和发病率(10/15)类似于未处理的对照(7/12)(图1B)。相反，T细胞消耗的NOD-PI BM受者的糖尿病发展显著较低(3/17，P＝0.003)(图1B)。当从分析中除去尸检确定为胸腺瘤的小鼠时，组间差异仍然在统计学上显著(P＝0.012)。
BMT(1×107T细胞消耗的BM)后100天评价胰岛的细胞免疫浸润(胰岛炎)。在NOD-PI T细胞消耗的BM的受者中，54％的胰岛没有胰岛炎(图2A)，单核细胞浸润只局限于胰岛周围(胰周炎)。相反，在NODT细胞消耗的BM的受者中，只有28％的胰岛没有胰岛炎，向胰岛内广泛浸润(图2B)。如下事实反映了这些发现与NOD受者相比，NOD-PI的平均胰岛炎得分显著降低(P＝0.008)(图2C)。在移植5×106T细胞消耗的BM后观察到类似的结果。与胰岛炎不同，在NOD-PI或NOD T细胞消耗的BM的受者和年龄匹配的未处理对照中，舌下腺的单核细胞浸润(涎腺炎)相似(图2D)。这表明NOD-PI BM转移特异地保护胰岛的自身免疫性。
实施例4编码PI的造血干细胞和祖细胞转移糖尿病预防从NOD和NOD-PI BM中无菌纯化造血干细胞(lin-/c-kit+/SCA-1+)或祖细胞(HPC)(lin-/c-kit+)。为了测定它们对糖尿病发展的影响，将少量HSC或HPC移植到照射的4周龄受者中。造血重建迅速，PBL群体到BMT后8周恢复。在NOD-PI HSC受者中糖尿病被完全预防，在NOD-PI HPC受者中，其发病率显著下降(图3)。
实施例5NOD-PI BM预防糖尿病不是由于免疫重建受损为了排除NOD-PI BMT的保护作用是免疫重建受损的结果的可能性，首先分析了外周血白细胞(PBL)群体。T细胞消耗的BMT后10-14天，NOD和NOD-PI受者的循环白细胞数量大大减少(图4A)。相对于年龄匹配的对照，T淋巴细胞(CD4+，CD8+)与B淋巴细胞(B220+)的比例下降(分别为50-75％、25％和80-85％)，而骨髓(CD11b+)细胞的比例提高约2.5倍。在BMT后8周和16周，总PBL计数(图4A)和PBL亚群的相对比例(图4B)正常，表明这些组之间的重建相似。然后研究了BMT受者产生T细胞介导的免疫应答的能力。年龄匹配的正常NOD小鼠和NOD或NOD-PI T细胞消耗的BM的受者在BMT后100天用卵清蛋白(OVA)免疫。两周后，未处理的小鼠和任一BMT组对OVA的体外回忆应答类似(图5)。因此，NOD-PI BMT与免疫重建受损的证据无关。
实施例6细胞因子刺激的骨髓细胞含有未分化的DC前体作为“未成熟”DC(iDC)的一个来源，在GM-CSF和TGF-beta(G+T)中培养BM。这些培养物含有细胞型混合物，主要是具有环形或破碎的核的小圆细胞，它们表达骨髓分化标记Gr-1，具有未分化的骨髓前体特有的特征。少部分细胞具有单核细胞样或未成熟DC样外观，表达低水平的MHC II类，主要限于细胞内颗粒。为了进一步确定这些细胞亚群，在GM-CSF/TGF-β1与GM-CSF/IL-4之间进行培养的BM的比较，因为后者含有表型成熟的和未成熟的DC的混合物以及少量未分化的骨髓细胞。与在GM-CSF/IL-4中培养的BM细胞不同，在GM-CSF/TGF-β1中培养的BM只含有低频率的表达DC特异性标志CD11c的细胞(见图6A)，其余的几乎含有全部Gr-1+细胞。在GM-CSF/TGF-β1-培养的BM中在CD11c+DC上表达的抗原呈递(MHC II类)和共刺激分子(CD86和CD40)的水平较低，类似于在GM-CSF/IL-4中产生的表型未成熟的DC(见图6A)。功能未成熟的(CD11c+/CD86lo)DC的一个特点——内吞活性，通过FITC葡聚糖摄取法测定。在添加GM-CSF/IL-4的培养物中，只有CD11c+/CD86lo未成熟DC具有内吞活性；在添加GM-CSF/TGF-β1的培养物中，只有CD11c+细胞具有内吞活性。
来自G+T BM的iDC表达低水平的MHC II类和共刺激分子(图6)，在混合淋巴细胞反应中是弱刺激剂。来自NOD-PI小鼠的G+T BM在静脉内转移给4周龄雌性NOD小鼠时显著抑制(p＜0.01)糖尿病发展，而来自非对照NOD小鼠的G+T BM不能(图7)。进一步的研究表明，G+TBM除了CD11c+/CD11b+/Gr-1-iDC之外还含有大量未分化的CD11c-/CD11b+/Gr-1+骨髓细胞(图8)。
实施例7前体DCGr-1+细胞的消耗削弱了G+T BM抑制糖尿病的能力，而CD11c+iDC的消耗则不然(图9)。从NOD-PI中(p＜0.01)而不是从对照NOD小鼠中转移纯化的Gr-1+骨髓细胞在受者小鼠中抑制糖尿病的发展，证实这些细胞的保护作用(图10)。
与iDC不同，CD11c-/CD11b+/Gr-1+骨髓细胞不会响应激活刺激(LPS、抗-CD40)快速获得成熟CD11c+/CD86hi表型。相反，它们在GM-CSF/IL-4/TNF-α中培养5-7天中逐渐获得成熟DC特征。因此，G+T BM培养物中存在的CD11c-/CD11b+/Gr-1+细胞代表DC前体。因此，上述数据表明，编码一种疾病特异性自身抗原(胰岛素原)的骨髓DC前体能够预防自身免疫病。
实施例8骨髓细胞在体内分化为CD11c+/MHC II类+DC为了测定转移的细胞的体内分化和存活率，通过消耗CD11c+细胞，从GM-CSF/TGF-β1-培养的胰岛素原-NOD BM中纯化Gr1+细胞。然后用CFSE标记这些细胞，直接注射到脾脏内。染色脾脏冷冻切片进行免疫荧光分析。CFSE-和抗体标记的细胞(MHC II类、CD11c、CD11b或GR-1)的定位用免疫荧光显微术进行。图11证明了CFSE和检测的所有4种标记染色阳性的细胞的鉴定。左图显示CFSE标记的细胞，中图显示用德克萨斯红偶联的单克隆抗体显示的细胞，右图显示合并的图像。右图中存在亮白斑点表明双染色(Dual stating)。
免疫组织学从冷冻的OCT包埋的(Tissue-Tek，Miles Inc.Elkhart，IN)组织上切割冷冻切片(5μm)，风干，在免疫染色或封固(mounting)之前用100％冷乙醇固定。抗生物素蛋白/生物素结合部位用抗生物素蛋白/生物素阻断剂封闭(Vector，Burlingame，CA)，非特异性蛋白质相互作用用1％BSA阻断。生物素化的第一抗体以预定的最佳浓度在室温下使用1小时。洗涤后，再使用链霉抗生物素-HRP(vector ABC-Elite，Vector，Burlingame，CA)或链霉抗生物素-德克萨斯红1小时。洗涤免疫过氧化物酶载玻片，用酶底物(VectorRed，Vector，Burlingame，CA)显色。漂洗免疫荧光载玻片，在抗褪色剂(DAKO Corp.，Carpinteria，CA)中封固。
细胞离心涂片(Cytospin)用cytofuge(Shandon，Pittsburgh，PA)制备细胞离心涂片。细胞离心涂片用Diff Quik(Lab Aids Pty Ltd，Narrabeen，NSW Australia)染色，或者如上所述通过免疫组化染色。
本领域技术人员应当理解，此处所述的本发明容易进行除具体描述之外的变化和修改。应当理解，本发明包括所有这些变化和修改。本发明也单个地或者集体地包括本说明书中提到的或者指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或两个以上所述步骤或特征的任意和全部组合。
文献目录Brocker，T.，Riedinger，M.，Karjalainen，K.1997.主要组织相容性复合物(MHC)II类分子的靶向表达显示树突细胞可诱导体内胸腺细胞的阴性而不是阳性选择，J.Exp.Med.185541-550.
Burt，R.K.，Slavin，S.，Burns，W.H.，Marmont，A.M.2002.通过造血干细胞移植诱导自身免疫病中的耐受更接近于治疗了么？Blood.99768-784.
Castro-Malaspina，H.，Harris，R.E.，Gajewski，J.，Ramsay，N.，Collins，R.，Dharan，B.，King，R.，Deeg，H.J.2002.非相关供体骨髓移植用于脊髓发育不良综合征由国际骨髓供体组织资助的510名移植者结果分析。Blood 991943-1951.
Chen，W.，Bergerot，I.，Elliott，J.F.，Harrison，L.C.，Abiru，N.，Eisenbarth，G.S.，Delovitch，T.L.2001.跨胰岛素原B-C连接的肽是I型糠尿病早期自身抗原表位的证据。J.Immunol.1674926-4935.
Cui，y.，Golob，J.，Kelleher，E.，Ye，Z.，Pardoll，D.，Cheng，L.2002.对来自慢病毒转导的人造血干/祖细胞的抗原呈递细胞的靶向转基因表达。Blood 99399-408.
El-Badri，N.S.，Wang，B.Y.，Steele，A.，Cherry，Marikar，Y.，Mizobe，K.，Good，R.A.2000.通过移植足够数量的完全异基因造血干细胞成功防止自身免疫病。Transplantation 70870-877.
Frazer，I.H.，De Kluyver，R.，Leggatt，G.R.，Guo，H.Y.，Dunn，L.，White，O.，Harris，C.，Liem，A.，Lambert，P.2001.对体细胞中表达的肿瘤抗原之耐受或免疫可通过在首次抗原暴露时全身性前炎症信号确定。J.Immunol.1676180-6187.
French，M.B.，Allison，J.，Cram，D.S.，Thomas，H.E.，Dempsey-Collier，M.，Silva，A.，Georgiou，H.M.，Kay，T.W.，Harrison，L.C.，Lew，A.M.1997.在非肥胖糖尿病小鼠中小鼠胰岛素原II的表达防止糖尿病Diabetes.4634-39.
Garza，K.M.，Chan，S.M.，Suri，R.，Nguyen，L.T.，Odermatt，B.，Schoenberger，S.P.，Ohashi，P.S.2000.抗原呈递细胞在介导耐受和自身免疫中的作用，J.Exp.Med.1912021-2027.
Himeno，K.，Good，R.A.1988.从耐受供体中骨髓移植以治疗和预防BXSB小鼠中自身免疫病Proe.Natl.Acad.Sci.U.S.A.852235-2239.
Ikehara，S.，Ohtsuki，H.，Good，R.A.，Asamoto，H.，Nakamura，T.，Sekita，K.，Muso，E.，Tochino，Y.，Ida，T.，Kuzuya，H.等人.1985.通过异基因骨髓移植在非肥胖糖尿病小鼠中预防I型糖尿病，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.827743-7747.
Kaufman，C.L.，Li，H.，Ildstad，S.T.1997.非肥胖糖尿病小鼠中造血重构模式疾病抗性骨髓的异源抗性对竞争性优点的二分法，J.Immunol.1582435-2442.
Kirzner，R.P.，Engelman，R.W.，Mizutani，H.，Specter，S.，Good，R.A.2000.在自身免疫倾向的w/BF(l)小鼠中通过T细胞消耗的骨髓细胞和造血干细胞制备预防冠状血管疾病，Biol.Biood MarrowTransplant.6513-522.
LaFace，D.M.，Peck，A.B.1989.NOD小鼠与和转移相关的糖尿病非敏感性小鼠的交互异基因骨髓移植与自身免疫病的预防Diabetes.38894-901.
Leiter，E.H.1982.C57BL小鼠中多重低剂量链脲菌素诱导的高血糖和胰岛炎近交背景、性别和脂腺，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.79630-634.
Li，H.，Kaufman，C.L.，Boggs，S.S.，Johnson，P.C.，Patrene，K.D.，Ildstad，S.T.1996.由亚致死方法诱导的混合异基因嵌合预防自身免疫病和逆转非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的胰岛炎，J.Immuuol.156380-388.
Prochazka，M.，Gaskins，H.R.，Shultz，L.D.，Leiter，E.H.1992.非肥胖糖尿病scid小鼠用于与免疫缺陷相关的自发胸腺突变模型，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.893290-3294.
Ratanatharathorn，V.，Ayash，L.，Lazarus，H.M.，Fu，J.，Uberti，J.P.2001.慢性移植物抗宿主疾病临床表现和治疗，Bone MarrowTransplant.28121-129.
Rudy，G.，Stone，N.，Harrison，L.C.，Colman，P.G.，McNair，P.，Brusic，V.，French，M.B.，Honeyman，M.C.，Tait，B.，Lew，A.M.1995.来自两种β细胞自身抗原-胰岛素原和谷氨酸脱羧酶的类似肽刺激具有胰岛素依赖型糖尿病风险的个体之T细胞，Mol.Med.1625-633.
Sambrook等人，分子克隆实验室指南，Cold Spring Harbor，NewYork，USA，1990.
Shultz，L.D.，Lang，P.A.，Christianson，S.W.，Gott，B.，Lyons，B.，Umeda，S.，Leiter，E.，Hesselton，R.，Wagar，E.J.，Leif，J.H.等人.2000.NOD/LtSz-Rag1空白小鼠一种免疫缺陷和放射抗性模型用于人造血干细胞移入，HIV感染和NOD小鼠致糖尿病T细胞的适应性移转。J.Immunol.1642496-2507.
Steptoe，R.J.，Ritchie，J.M.，Harrison，L.C.2002.在自身免疫倾向的非肥胖糖尿病小鼠中来自髓先祖细胞的树突细胞产生增加。J.Immunol.1685032-5041.
权利要求
1.一种产生抗原呈递细胞(APC)的方法，该APC呈递与自身免疫病有关的自身抗原，该方法包括从实验对象中采集造血干细胞(HSC)和/或造血祖细胞(HPC)样品，在一定条件下向一种或多种HSC和/或HPC内导入编码该自身抗原的遗传物质，在所述条件下该遗传物质得到表达，致使HSC和/或HPC产生该自身抗原。
2.权利要求1的方法，其中所述APC选自树突细胞、B淋巴细胞、上皮细胞、单核细胞和巨噬细胞。
3.权利要求2的方法，其中所述APC是树突细胞。
4.权利要求1的方法，其中所述实验对象选自人、灵长类动物、绵羊、马、牛、驴、猪、山羊、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、鸟、鸡、矮脚鸡、鹅和火鸡。
5.权利要求1的方法，其中所述实验对象是人。
6.权利要求1的方法，其中所述HSC和/或HPC的来源选自髋骨骨髓、骨髓、脐带血、来自肝脏的血液、来自组织的血液和PBMC。
7.权利要求6的方法，其中所述HSC和HPC来源于髋骨骨髓。
8.权利要求1的方法，其中所述自身抗原与如下疾病有关，所述疾病选自胰岛素依赖型糖尿病、系统性红斑狼疮、局限性肠炎、心肌病、溶血性贫血、纤维肌痛、格雷夫斯氏病、溃疡性结肠炎、血管炎、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、中性粒细胞减少症、银屑病、慢性疲乏综合征、幼年型关节炎、青少年糖尿病、硬皮病、银屑病关节炎、口腔干燥-风湿性关节炎综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、桥本氏病、混合性结缔组织病、间质性膀胱炎、恶性贫血、白质脑炎、斑秃、强直性脊柱炎、原发性胆汁性肝硬变、抗GBM肾炎、抗TBM肾炎、抗磷脂综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、自身免疫性阿狄森氏病、慢性活动性肝炎、白癜风、自身免疫性高脂血症、自身免疫性心肌炎、颞动脉炎、自身免疫性甲状腺病、轴突和神经元神经病、贝切特氏病、大疱性类天疱疮、变应性哮喘、骨关节炎、恰加斯氏病、葡萄膜炎、慢性炎性脱髓鞘性多神经病(CIDP)、疤痕性类天疱疮/良性黏膜类天疱疮、寇甘氏综合征、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇病毒性心肌炎、脱髓鞘性神经病、皮肌炎、盘状狼疮、晶状体抗原性色素层炎、结节性多动脉炎、德雷斯勒氏综合征、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、埃文斯综合征、肺出血肾炎综合征、变应性鼻炎、传染性神经元炎、低丙球蛋白血症、包涵体肌炎、水泡大疱疹皮肤病、韦格纳肉芽肿、梅尼尔氏病、兰伯特-伊顿综合征、莫伦氏溃疡、非典型乳糜泻、眼疤痕性类天疱疮、寻常型天疱疮、静脉周脑脊髓炎、心包切开术后综合征、巩膜炎、精子睾丸自身免疫、僵人综合征、亚急性细菌心内膜炎(SBE)、交感性眼炎、横贯性脊髓炎和坏死性脊髓病、I型自身免疫性多腺性综合征、II型自身免疫性多腺性综合征、恶性贫血和子宫内膜异位症。
9.权利要求1的方法，其中所述自身免疫病是胰岛素依赖型糖尿病。
10.权利要求1的方法，其中所述自身抗原是胰岛素原或其免疫原性同源物、局部、片段或部分。
11.权利要求10的方法，其中所述胰岛素原是人源的。
12.权利要求10的方法，其中所述胰岛素原是人源化胰岛素原，其中该胰岛素原的来源选自牛、猪、绵羊、马、山羊、小鼠和大鼠。
13.一种预防或治疗实验对象的自身免疫病的方法，包括向该实验对象中引入呈递与自身免疫病有关的自身抗原的APC，该方法包括从该实验对象中采集造血干细胞(HSC)和/或造血祖细胞(HPC)样品，在一定条件下向一种或多种HSC和/或HPC内导入编码该自身抗原的遗传物质，在该条件下该遗传物质得到表达，致使HSC和/或HPC产生该自身抗原。
14.权利要求13的方法，其中所述APC选自树突细胞、B淋巴细胞、上皮细胞、单核细胞和巨噬细胞。
15.权利要求14的方法，其中所述APC是树突细胞。
16.权利要求13的方法，其中所述实验对象选自人、灵长类动物、绵羊、马、牛、驴、猪、山羊、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、鸟、鸡、矮脚鸡、鹅和火鸡。
17.权利要求13的方法，其中所述实验对象是人。
18.权利要求13的方法，其中所述细胞的来源选自髋骨骨髓、骨髓、脐带血、来自肝脏的血液、来自组织的血液和PBMC。
19.权利要求18的方法，其中所述细胞来源于髋骨骨髓。
20.权利要求13的方法，其中所述自身抗原与如下疾病有关，所述疾病选自I型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病、系统性红斑狼疮、局限性肠炎、心肌病、溶血性贫血、纤维肌痛、格雷夫斯氏病、溃疡性结肠炎、血管炎、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、中性粒细胞减少症、银屑病、慢性疲乏综合征、幼年型关节炎、青少年糖尿病、硬皮病、银屑病关节炎、口腔干燥-风湿性关节炎综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、桥本氏病、混合性结缔组织病、间质性膀胱炎、恶性贫血、白质脑炎、斑秃、强直性脊柱炎、原发性胆汁性肝硬变、抗GBM肾炎、抗TBM肾炎、抗磷脂综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、自身免疫性阿狄森氏病、慢性活动性肝炎、白癜风、自身免疫性高脂血症、自身免疫性心肌炎、颞动脉炎、自身免疫性甲状腺病、轴突和神经元神经病、贝切特氏病、大疱性类天疱疮、变应性哮喘、骨关节炎、恰加斯氏病、葡萄膜炎、慢性炎性脱髓鞘性多神经病(CIDP)、疤痕性类天疱疮/良性黏膜类天疱疮、寇甘氏综合征、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇病毒性心肌炎、脱髓鞘性神经病、皮肌炎、盘状狼疮、晶状体抗原性色素层炎、结节性多动脉炎、德雷斯勒氏综合征、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、埃文斯综合征、肺出血肾炎综合征、变应性鼻炎、传染性神经元炎、低丙球蛋白血症、包涵体肌炎、水泡大疱疹皮肤病、韦格纳肉芽肿、梅尼尔氏病、兰伯特-伊顿综合征、莫伦氏溃疡、非典型乳糜泻、眼疤痕性类天疱疮、寻常型天疱疮、静脉周脑脊髓炎、心包切开术后综合征、巩膜炎、精子睾丸自身免疫、僵人综合征、亚急性细菌心内膜炎(SBE)、交感性眼炎、横贯性脊髓炎和坏死性脊髓病、I型自身免疫性多腺性综合征、II型自身免疫性多腺性综合征、恶性贫血和子宫内膜异位症。
21.权利要求13的方法，其中所述自身免疫病是胰岛素依赖型糖尿病。
22.权利要求13的方法，其中所述自身抗原是胰岛素原或其免疫原性同源物、局部、片段或部分。
23.权利要求22的方法，其中所述胰岛素原是人源的。
24.权利要求22的方法，其中所述胰岛素原是人源化胰岛素原，其中该胰岛素原的来源选自猪、牛、绵羊、马、山羊、小鼠和大鼠。
25.一种治疗或预防实验对象的自身免疫病的方法，包括(a)从实验对象中采集造血干细胞(HSC)和/或造血祖细胞(HPC)样品；(b)在一定条件下向一种或多种HSC和/或HPC内导入编码所述自身抗原的遗传物质，在该条件下该遗传物质得到表达，致使HSC和/或HPC产生该自身抗原；和(c)将所述遗传修饰的细胞输注或者导入该实验对象内。
26.权利要求25的方法，其中所述HSC和/或HPC经历细胞因子介导的活动化。
27.权利要求25的方法，其中所述实验对象选自人、灵长类动物、绵羊、马、牛、驴、猪、山羊、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、鸟、鸡、矮脚鸡、鹅和火鸡。
28.权利要求25的方法，其中所述实验对象是人。
29.权利要求25的方法，其中所述HSC和/或HPC的来源选自髋骨骨髓、骨髓、脐带血、来自肝脏的血液、来自组织的血液和PBMC。
30.权利要求29的方法，其中所述HSC和/或HPC来源于髋骨骨髓。
31.权利要求25的方法，其中所述自身抗原与如下疾病有关，所述疾病选自I型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病、系统性红斑狼疮、局限性肠炎、心肌病、溶血性贫血、纤维肌痛、格雷夫斯氏病、溃疡性结肠炎、血管炎、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、中性粒细胞减少症、银屑病、慢性疲乏综合征、幼年型关节炎、青少年糖尿病、硬皮病、银屑病关节炎、口腔干燥-风湿性关节炎综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、桥本氏病、混合性结缔组织病、间质性膀胱炎、恶性贫血、白质脑炎、斑秃、强直性脊柱炎、原发性胆汁性肝硬变、抗GBM肾炎、抗TBM肾炎、抗磷脂综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、自身免疫性阿狄森氏病、慢性活动性肝炎、白癜风、自身免疫性高脂血症、自身免疫性心肌炎、颞动脉炎、自身免疫性甲状腺病、轴突和神经元神经病、贝切特氏病、大疱性类天疱疮、变应性哮喘、骨关节炎、恰加斯氏病、葡萄膜炎、慢性炎性脱髓鞘性多神经病(CIDP)、疤痕性类天疱疮/良性黏膜类天疱疮、寇甘氏综合征、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇病毒性心肌炎、脱髓鞘性神经病、皮肌炎、盘状狼疮、晶状体抗原性色素层炎、结节性多动脉炎、德雷斯勒氏综合征、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、埃文斯综合征、肺出血肾炎综合征、变应性鼻炎、传染性神经元炎、低丙球蛋白血症、包涵体肌炎、水泡大疱疹皮肤病、韦格纳肉芽肿、梅尼尔氏病、兰伯特-伊顿综合征、莫伦氏溃疡、非典型乳糜泻、眼疤痕性类天疱疮、寻常型天疱疮、静脉周脑脊髓炎、心包切开术后综合征、巩膜炎、精子睾丸自身免疫、僵人综合征、亚急性细菌心内膜炎(SBE)、交感性眼炎、横贯性脊髓炎和坏死性脊髓病、I型自身免疫性多腺性综合征、II型自身免疫性多腺性综合征、恶性贫血和子宫内膜异位症。
32.权利要求25的方法，其中所述自身免疫病是胰岛素依赖型糖尿病。
33.权利要求25的方法，其中所述自身抗原是胰岛素原或其免疫原性同源物、局部、片段或部分。
34.权利要求33的方法，其中所述胰岛素原是人源的。
35.权利要求34的方法，其中所述胰岛素原是人源化胰岛素原，其中该胰岛素原的来源选自猪、牛、绵羊、马、山羊、小鼠和大鼠。
36.一种多区室形式的试剂盒，该试剂盒包含适合接受来自实验对象的HSC和/或HPC来源的第一个区室；适合包含编码一种自身抗原的遗传物质的第二个区室；任选的适合包含试剂的第三个或更多的区室，其中该试剂盒包含一种方法的使用说明书，该方法包括从实验对象中采集造血干细胞(HSC)和/或造血祖细胞(HPC)样品，在一定条件下向一种或多种HSC和/或HPC内导入编码该自身抗原的遗传物质，在该条件下该遗传物质得到表达，致使HSC和/或HPC产生该自身抗原。
37.一种含有导入的APC的实验对象，其中使用包括下列步骤的方法产生该APC从实验对象中采集造血干细胞(HSC)和/或造血祖细胞(HPC)样品，在一定条件下向一种或多种HSC和/或HPC内导入编码该自身抗原的遗传物质，在该条件下该遗传物质得到表达，致使HSC和/或HPC产生该自身抗原。
38.一种APC在生产用于治疗自身免疫病的药物中的用途，该APC已经被遗传修饰，呈递与一种疾病有关的自身抗原，其中该APC由HSC和/或HPC产生。
39.根据权利要求38的用途，其中所述APC选自树突细胞、B淋巴细胞、上皮细胞、单核细胞和巨噬细胞。
40.权利要求2的用途，其中所述APC是树突细胞。
41.权利要求38的用途，其中所述HSC和/或HPC的来源选自人、灵长类动物、绵羊、马、牛、驴、猪、山羊、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、鸟、鸡、矮脚鸡、鹅和火鸡。
42.权利要求41的用途，其中所述HSC和/或HPC来源于人。
43.权利要求38的用途，其中所述HSC和/或HPC的来源选自髋骨骨髓、骨髓、脐带血、来自肝脏的血液、来自组织的血液和PBMC。
44.权利要求38的用途，其中所述自身抗原与如下疾病有关，所述疾病选自I型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病、系统性红斑狼疮、局限性肠炎、心肌病、溶血性贫血、纤维肌痛、格雷夫斯氏病、溃疡性结肠炎、血管炎、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、中性粒细胞减少症、银屑病、慢性疲乏综合征、幼年型关节炎、青少年糖尿病、硬皮病、银屑病关节炎、口腔干燥-风湿性关节炎综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、桥本氏病、混合性结缔组织病、间质性膀胱炎、恶性贫血、白质脑炎、斑秃、强直性脊柱炎、原发性胆汁性肝硬变、抗GBM肾炎、抗TBM肾炎、抗磷脂综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、自身免疫性阿狄森氏病、慢性活动性肝炎、白癜风、自身免疫性高脂血症、自身免疫性心肌炎、颞动脉炎、自身免疫性甲状腺病、轴突和神经元神经病、贝切特氏病、大疱性类天疱疮、变应性哮喘、骨关节炎、恰加斯氏病、葡萄膜炎、慢性炎性脱髓鞘性多神经病(CIDP)、疤痕性类天疱疮/良性黏膜类天疱疮、寇甘氏综合征、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇病毒性心肌炎、脱髓鞘性神经病、皮肌炎、盘状狼疮、晶状体抗原性色素层炎、结节性多动脉炎、德雷斯勒氏综合征、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、埃文斯综合征、肺出血肾炎综合征、变应性鼻炎、传染性神经元炎、低丙球蛋白血症、包涵体肌炎、水泡大疱疹皮肤病、韦格纳肉芽肿、梅尼尔氏病、兰伯特-伊顿综合征、莫伦氏溃疡、非典型乳糜泻、眼疤痕性类天疱疮、寻常型天疱疮、静脉周脑脊髓炎、心包切开术后综合征、巩膜炎、精子睾丸自身免疫、僵人综合征、亚急性细菌心内膜炎(SBE)、交感性眼炎、横贯性脊髓炎和坏死性脊髓病、I型自身免疫性多腺性综合征、II型自身免疫性多腺性综合征、恶性贫血和子宫内膜异位症。
45.权利要求38的用途，其中所述自身免疫病是胰岛素依赖型糖尿病。
46.权利要求38的用途，其中所述自身抗原是胰岛素原或其免疫原性同源物、局部、片段或部分。
47.权利要求46的用途，其中所述胰岛素原是人源的。
48.权利要求38的用途，其中所述胰岛素原是一种人源化胰岛素原，其中该胰岛素原的来源选自猪、牛、绵羊、马、山羊、小鼠和大鼠。
全文摘要
本发明一般地涉及一种方法，用于治疗或缓解自身免疫病(例如，但是不限于自身免疫性糖尿病)的症状，或者降低或最小化发展为该疾病的危险。更具体而言，本发明涉及遗传修饰的造血干细胞和/或造血祖细胞的用途，它们表达编码一种或多种自身抗原的遗传物质，产生可诱导免疫耐受和/或保护性免疫的抗原呈递细胞。因此本发明提供一种治疗和/或预防自身免疫病如I型糖尿病的方法。
文档编号A61K39/00GK1703505SQ03824822
公开日2005年11月30日 申请日期2003年9月16日 优先权日2002年9月16日
发明者R·J·斯特普托, L·C·哈里森 申请人:沃尔特及伊莱萨霍尔医学研究院