专利名称：与自身免疫疾病相关的自身和非－自身抗原的识别的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域，尤其涉及与人自身免疫反应相关的自身和非-自身抗原的识别。本发明还涉及鉴定这种自身抗原的方法，并提供与寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris)相关的这种抗原的实施例。本发明同样涉及将这种抗原用于体外测定，动物模型，治疗剂和疫苗中。
背景技术：
人自身免疫疾病与特殊的主要的组织相容性复合体(“MHC”)I类或II类基因的特定等位基因有着显著的遗传学联系。该领域是通过对与强直性脊柱炎，一种慢性炎症性关节病的易感性相关联的HLA-B27的种系发现而建立的。(Brewerton等人，1973；Schlosstein等人，1973)。现在对于各种人自身免疫疾病已经记录MHC相关的易感性，仅仅举几个例子，包括胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)，类风湿性关节炎(RA)，寻常型天疱疮(PV)，多发性脑硬化(MS)和重症肌无力(MG)，(Todd等人，1987；Ahmed等人，1990；Ahmed等人1991；Lanchbury & Panayi，1991；Spielman & Nathenson，1982；Protti等人，1993)。
与自身免疫病最通常相关的MHC基因座是HLA-DRB的基因座(又名DRB1)，一种具有超过50个已知等位基因的高度多态的基因座。
例如，大量的流行病学的工作已经证明了类风湿性关节炎与DR4(DRB1*0401，DRB1*0404)和DR1(DRB1*0101)等位基因相关联，而与DR4等位基因的关联相比于DR1还带来更高的风险(Lanchbury &Panayi，1991)。当对象是DRB1*0401和/或DRB1*0404的纯合子的或杂合子的时候，风险会明显增大。对关节炎与三种在结构相似的DR等位基因之间的联系进行的观察发现，由于DRB1*0401，0404和0101在DRβ67-71簇中共用决定性的多态性残基，从而使得“共用表位”假说的得以发展。(Gregersen等人1987；Lanchbury & Panayi，1991)。这些残基(尤其在DRβ71中)似乎在确定肽与疾病相关分子相结合的选择中起决定性的作用。
寻常型天疱疮(PV)是一种皮肤自身免疫病，其中对表皮细胞粘着分子(桥粒芯糖蛋白3)产生了高滴度的自身抗体，结果使角化细胞不能附着(皮肤棘层松解)并且严重起泡(Amagai等人，1991)。在不同的种族群中疾病或者与DR4等位基因(DRB1*0402)或者与稀少的DQ1等位基因(DQB1*05032)相关，仅仅一小部分的PV病人不具有上述易感性基因中之任一种(Ahmed等人，1991；Ahmed等人，1990；Scharf等人，1988)。与天疱疮相关的DR4亚型和与RA相关的DR4亚类仅仅在DRβ67-71簇的三个位置上有所不同。PV相关分子在决定位点(DRβ71)带有负电荷(谷氨酸)；相邻位置(DRβ70)也是带负电荷的。与PV相关的DR4亚型是唯一一个在DRβ71带有负电荷的；在与RA相关的DR4分子中，在DRβ71发现的是正电荷(Arg)。
为此，已经在对可能涉及自身免疫的自身肽表位与各种细菌和病毒病原体之间的序列同源性鉴定方面作出了努力。这些同源性检索集中在用序列同一性进行的排对上。但是在鉴定可以与来自有自身免疫病的病人的、估计可能致病的T细胞系起交叉反应的病原体的表位鉴定中，利用这样的排对还没有成功的报道(Oldstone 1990)。最近发现在柯萨奇病毒蛋白和怀疑在糖尿病中是自身抗原的GAD65的表位之间有序列同一性。从老鼠体内，这些肽可以交互地产生多克隆的T细胞系，而这些T细胞又与其他的肽起交叉反应(Tian，等人，1994)然而，没有证据可以证明这些肽能够刺激来自糖尿病患的鼠(或人)的克隆。
在本领域中的最新发展，尤其是特定的的等位基因特异性的肽结合基序的鉴定使得本领域发生了转变(Madden等人，1991；Rotschke &FaIk，1991)。以这些知识为基础，在本领域中可以在细节水平上重新评价MHC与对自身免疫疾病敏感性相关联的结构上的基础，足以解决长期存在的问题。通过对天然加工的肽的序列分析和对已知表位的突变分析，已经确定了肽与几个MHC I类和II类的结合的基序。发现与肽结合的MHC I类很短(通常8-10个氨基酸长度)，并且拥有两个主要的MHC锚定定残基；发现结合肽的MHC II类较长，而且在大小上更不均一(Madden等人，1991；Rotschke & FaIk，1991；Jardetzky等人，1991，Chicz等人，1993)。可是由于大小的不均一性，证明了更难以根据序列比对确定MHC II类的结合基序。近年来，对HLA-DR1的晶体结构分析证明接近于该肽的N-末端有占优势的疏水性锚定残基，而且在肽的几个其他位置发现了次级锚定残基(Brown等人，1993)。然而，即使是这些工作也不能对HLA-DR蛋白的结合口袋，结构所要求的或用于MHC结合抗原的这些口袋的形成所涉及的具体残基给出一个详细的描述。
在最近的披露中，给出了一种HLA-DR抗原袋详细的描述(Stern等人，1994)。该信息，加上确定MHC结合和TCR接触(例如Wucherpfennig等人，1994a，)所需的那些自身或非-自身抗原的氨基酸的功能信息，的也许能揭示各种的HLA-DR同种异型的结合基序，鉴定涉及自身免疫病的自身表位，并且为鉴定可能引发人自身免疫反应的细菌和病毒的表位提供一种方法。
发明概述本发明一方面提供了来源于人桥粒芯糖蛋白3蛋白的并在自身免疫病寻常型天疱疮(PV)中涉及作为自身表位的分离的多肽。这些多肽基本上由在此披露的并命名为SEQ ID NO1的氨基酸序列组成。这些多肽由SEQ ID NO1组成。尤其是，本发明提供了由这些序列组成的分离的多肽，这些序列的中心MHC结合残基，或这些序列的内核MHC结合残基。
本发明的组合物包含可药用的载体和SEQ ID NO1的多肽。该组合物还可以包含该多肽的可药用的盐。可药用的盐优选醋酸盐。
本发明的组合物可以进一步含有可药用的添加剂，例如糖类或表面活性剂。可接受的糖类例如是葡萄糖和甘露糖醇。在一个具体实施方式
中，组合物是用大约5％的糖类配制的。组合物可以进一步含有缓冲剂，例如二水柠檬酸钠和一水柠檬酸，和填充剂，例如甘露糖醇。在进一步的具体实施方式
中，表面活性剂，例如可以是吐温20或吐温80，添加到组合物中的量可以从大约0.01％到大约5％。本发明的一个具体实施方式
含有该多肽的免疫原性的组合物。
在一个
具体实施例方式
中，组合物含有冻干的SEQ ID NO1的多肽。在一个具体实施方式
中，该冻干的多肽再次溶解的时间小于15分钟，更优选该再次溶解时间小于10分钟，更优选该再次溶解时间小于5分钟，而更优选该再次溶解时间小于3分钟。
在一个
具体实施例方式
中，肽的纯度大于90％，更优选，纯度大于93％，更优选，纯度大于95％，而更优选纯度大于96％。
在一个
具体实施例方式
中，组合物带有的细菌内毒素污染物小于大约5EU/mL，更优选，细菌内毒素污染物小于大约3EU/mL，更优选，细菌内毒素污染物小于大约2EU/mL，而更优选，细菌内毒素污染物小于大约1.25EU/mL。
本发明的组合物更优选的组成如表3所示。
在另一套具体实施方式
中，本发明提供了用于使个体对于自身抗原耐受的药物制剂。该制剂包括可药用的载体和分离的人的多肽，该多肽包含对应于与人自身免疫病相关的HLA-DR的基序的氨基酸序列。这些多肽能够与HLA-DR蛋白结合形成复合体，该复合体在带有自身免疫病的患者体内激活自身反应的T细胞。该肽不是来源于人胶原或人髓鞘碱性蛋白。
在一个具体的实施方式中，在HLA-DR蛋白是HLA-DR4蛋白和自身免疫病是寻常型天疱疮时提供了这样的药物制剂。另外，对于寻常型天疱疮提供了特殊的基序，并提供了具有该基序的肽的药物。该药物特殊的具体实施方式
包含了如上所述的相对于寻常型天疱疮的各种多肽。因此，同样提供了对于使个体耐受寻常型天疱疮自身抗原的方法。
本发明另一方面提供了用于针对涉及自身免疫病病原学的人病原体进行接种的药物。这些药物制剂包含可药用的载体和针对人病原体有效免疫的免疫原性制剂。该人病原体是一种在其天然的形式中包含对应于自身免疫病相关的HLA-DR基序的氨基酸序列的多肽的病原体。这些多肽能够与HLA-DR蛋白结合形成复合体，该复合体激活成为自身反应的T细胞并引发自身免疫病。但是本发明的制剂特别地不包含这样的多肽，相反地包含来自病原体的其他的抗原。
在一个
具体实施例方式
中，所提供的药物制剂中含有的HLA-DR蛋白是HLA-DR4蛋白，而自身免疫病是寻常型天疱疮。另外，对寻常型天疱疮提供了特定的基序，而提供的药物没有含该基序的肽。该药物的具体实施方式
包含的制剂没有如上所述的相对于寻常型天疱疮的各种多肽。因此，还提供了使个体产生免疫针对可能引起寻常型天疱疮的病原体的方法。
本发明还提供了用于评价能够诱导自身免疫反应的肽的一般方法。这些方法包括选择与自身免疫反应相关的MHC HLA-DR分子，选择至少两个主要的HLA-DR分子的MHC结合口袋，鉴定在每个被选择的袋口中结合的氨基酸残基的组，开发出适于HLA-DR分子的序列基序，其中该组氨基酸在基序相应位置确定允许的氨基酸，然后将肽的氨基酸序列与序列基序相比较。与该基序匹配的肽更有可能诱导自身免疫病。另外，如果有已知的表位与该疾病相关，该方法可进一步包括至少选择该表位的一个TCR接触残基，鉴定可能作为TCR触点的一组氨基酸残基，和在适当的位置所包含该基序的这组氨基酸。在优选的具体实施方式
中，基序包括在至少与P1 MHC结合口袋和至少P4和P6口袋之一相对应的位置对残基的限制。
在本发明的另一个具体实施方式
中，特别提供了用于鉴定外源的涉及人自身免疫反应的抗原的方法。这些方法包括与前面描述的方法同样的步骤，不过进一步包括了将得到的序列基序与一组人病原体相比较。在优选的具体实施方式
中，来自正常人肠内菌丛的一种和多种细菌的肽序列不在考虑范围之内。在另一个优选的具体实施方式
中，排除了来自一种和多种与疾病发病率不相关的病原体的序列。在一个更优选的具体实施方式
中，利用基序做为搜索条件在计算机数据库中检索和评价人病原体肽。
本发明一方面提供了来源于人桥粒芯糖蛋白3(Dsg3)蛋白的分离的肽及其应用。这些肽，例如，基本上由SEQ ID NO1组成，并与HLA-DR4蛋白结合形成在带有寻常型天疱疮的患者体内激活自身反应T细胞的复合体。
本发明的某些方法包含对个体施用药物学有效量的Dsg3肽或肽模拟物，其能够与HLA-DR蛋白结合形成在带有自身免疫病的患者体内激活自身反应的T细胞的复合体。肽模拟物的施用导致患者的耐受，或者该肽模拟物可被用作疫苗。
在另一方面，本发明提供了含有与HLA-DR分子结合的Dsg3肽的编码序列的核酸。在某些具体实施方式
中，这种核酸可被用来，例如，生产Dsg3肽，包括融合蛋白。在其他的具体实施方式
中，这种核酸可施用给患者以便在体内产生Dsg3肽。
在某些方面，该Dsg3治疗药物包括含有第一多肽和第二多肽的融合蛋白，其中第一多肽基本上由Dsg3肽/肽模拟物组成，第二多肽含有载体蛋白，制造蛋白，或稳定蛋白。
在某些
具体实施例方式
中，本发明的化合物由以下基序来表示EPNHLNSKIAFKIVSQEPA(SEQ ID NO1)1 4 6基序11 4 6基序2发明详细说明I.综述A.MHC II类HLA-DR分子模拟基序HLA-DR结合位点特征为五个主要的可能与抗原氨基酸侧链结合的口袋(Stern等人，1994，其完整的公开在此一并引用)。参见
图1。与第一个主要的口袋结合的抗原的氨基酸残基命名为P1。然后剩余的残基可以通过它们相对于P1的位置来计算(朝向羧基末端延伸的用增加正数，而朝向氨基末端延伸的用增加的负数)P-i…P-1 P1 P2 P3 P4…Pj.
这样，通过定义，HLA-DR分子的第一个主要的口袋与抗原上的P1残基的侧链结合。剩余的主要的口袋与P4，P6，P7和P9残基结合。这些残基被定为主要的MHC接触残基。
残基P-1，P2，P3，P5，P8，和P11的氨基酸侧链的取向是远离HLA-DR结合位点的，因此，作为用于T细胞受体(TCR)接触残基是有效的。这些残基的AU规定为TCR接触残基。
B.MHC接触残基HLA-DR分子的第一个主要的口袋是强烈疏水的。它是由β链大约位置85，86，89，和90一系列残基，α链的大约位置31，32，和34的一系列残基和来自α链的在大约位置7和43的残基的侧链形成的。例如，在HLA-DR1(DRA，DRB1*0101)中，第一个口袋是由残基β85(Val)，β86(Gly)，β89(Phe)，β90(Thr)，α31(Phe)，α32(Phe)，α34(Phe)，α7(I1e)，和α43(Trp)形成的。对于其他的HLA-DR等位基因的相应残基是本领域已知的(参见，例如，Marsh和Bodmer，1992，在此一并引用)而且可以通过基因数据库获得。
尽管大部分形成P1口袋的残基来自于高度保守的DRα链，但是这些口袋的大小和特性也会由于口袋中所涉及的β链残基的多态性而改变。对于DRB1*0101蛋白，口袋很大而且是疏水的，并能够容纳任何脂肪族或芳族的残基。然而，β残基的多态性可能会改变P1口袋的结合能力。例如，β86残基已知是多态的。该位点最通常被Gly或Val占据。通常，当β86是Gly时(如DRB1*0101中)，任何脂肪族或芳族的残基都可能结合到口袋中。但该位置是Val时，口袋较小并且Tyr和Trp都不能被容纳。因此，当β86是Gly时，分子模拟基序的P1位置可能由选自V，L，I，A，M，F，Y，W的残基组成，而当β86是Val时，基序的P1位置可能由选自V，L，I，A，M，F的残基组成。P1口袋的其他β残基也可采用同样的考虑。
HLA-DR分子的P4口袋同样是相对较大，较浅的疏水的口袋，其方向与抗原结合位点相交叉。这种口袋可以结合各种大的脂肪族侧链，这些侧链可以沿着口袋的侧面和底部维持疏水作用。该口袋是由β链的在大约位置70，71，74，和78一系列残基，和来自β链在大约位置13以及α链的大约位置9的残基的侧链形成。例如，在HLA-DR1(DRA，DRB1*0101)中，P4口袋是由残基β70(Gln)，β71(Arg)，β74(Ala)，β78(Tyr)，β13(Phe)，和α9(Gln)形成的。对于其他的HLA-DR等位基因的相应残基是本领域已知的(参见，例如，Marsh和Bodmer，1992)而且可以通过基因数据库获得。
像P1口袋一样，P4口袋也是很大程度上疏水的，不过它的结合能力是受口袋所涉及的β残基多态性的影响。例如，不同的DR等位基因在位点β71具有不同电荷的残基在DRB1*0404中，带正电荷的Arg残基占据着位点β71，而在DRB1*0402中，位点β71是带负电荷的Glu残基。因此，尽管这些口袋通常可以结合各种脂肪族或芳族的侧链(例如，V，L，I，A，M，F，Y，W)，但是当位点β71是带正电荷的残基时，带正电荷的P4的抗原的残基不能结合，同样地当位点β71是带负电荷的残基时，带负电荷的P4残基也不能被结合。P4口袋其他的残基也可采用同样的考虑。要注意，一些残基可能涉及两个邻近口袋中每一个口袋的形成(例如，在P4和P6口袋中的β1313)，因此，通过特定的氨基酸对这些口袋中的一个的占据可能影响对另一个的占据。
HLA-DR分子的P6口袋是个相对浅的口袋，偏好于较小的P6抗原的残基(例如，A，G)。该口袋是由HLA-DR蛋白高度保守的α11，α62，α65，和α66残基和高度多态的β11和β13残基形成的。例如，在HLA-DR1(DRA，DRB1*0101)中，P6口袋是由残基α11(Glu)，α62(Asn)，α65(ValI)，α66(Asp)，β11(Leu)和β13(Phe)形成的。对于其他的HLA-DR等位基因的相应残基是本领域已知的(参见，例如，Marsh和Bodmer，1992)，而且可以通过基因数据库获得。
尽管在P6口袋中仅仅只有两个β链残基，但是在DR等位基因中它们有很大的变化。由于在β13有大的Phe残基(如在DRB1*0101中)，所以P6残基最好是小残基中的一种(例如，A，G)。但是，在其他的DR等位基因中，β13被较小的或极性的残基占据例如DRB1*0401中的β13(His)。对于这样的等位基因，P6基序可以包含某些大的和极性的残基(例如，S，T，V)，不过仍要避免最大的和芳族的残基。最后，在一些等位基因中，β11和β13都是丝氨酸残基(例如，DRB1*1101)，这时可以在基序中包括进更亲水的或更易氢键键合的残基。
HLA-DR分子的P7口袋也是一个相对浅的口袋。该口袋是由β链的五个残基形成β8，β47，β61，β67，和β71。例如，在HLA-DR1(DRA DRB*0101)中，P7口袋是由残基β28(Glu)，β47(Tyr)，β61(Trp)，β67(Leu)和β71(Arg)形成的。对于其他的HLA-DR等位基因的相应残基是本领域已知的(参见，例如，Marsh和Bodmer，1992)，而且可以通过基因数据库获得。该口袋看起来对HLA-DR1的特异性没有什么帮助，但在其他的等位基因中可能是很重要的。
HLA-DR分子的P9口袋通常是个小的疏水口袋，因此，在抗原的P9位置优选小的疏水残基。该口袋是由保守的α链的残基α69，α72，α73，和α76，以及多态的β链残基β9和β57形成的。例如，在HLA-DR1(DRA DRB1*0101)中，P9口袋是由α69(Asn)，α72(I1e)，α73(Met)，α76(Arg)，β9(Trp)和β57(Asp)形成的。于其他的HLA-DR等位基因的相应残基是本领域已知的(参见，例如，Marsh和Bodmer，1992)，而且可以通过基因数据库获得。
在与DR分子结合时，比起P1和P4口袋，P6，P7，和P9口袋好象是次要的，不过在与DR分子其他的同种型结合时它们可能更重要(例如，DQ的P9口袋可能是很重要的)。
C.接触残基当没有已知的或怀疑的涉及自身免疫反应的抗原时，与TCR接触残基相对应的基序的位点可以是非限制的。也就是说，没有已知的或怀疑的抗原，最好让基序的TCR接触位点在所有的氨基酸中变化。
另一方面，当有已知的或怀疑的涉及自身免疫反应的抗原时，，至少一些与TCR接触残基相对应的基序位点可以根据抗原的序列而限制。这样，例如，基序的P2和/或P3和/或P5位点可以限制到在与抗原相对应的位点上发现的那些残基。或者，至少基序的一些TCR接触残基可以不仅仅限制成与抗原残基相对应的残基，也可以让其在同样电荷和/或结构相似残基中进行变化(例如，K和R)。可是应当指出，对于基序的TCR接触残基较高的保守性的判定，是通过相对于已知的MHC的结合的复杂性，TCR结合具有假定更高的专一性来验证的。
D.开发HLA-DR的基序本发明中已给出的HLA-DR残基涉及P1，P4，P6，P7和P9MHC结合口袋，并给出了任何特殊的HLA-DR等位基因的核苷酸或相应的氨基酸序列，现在能够开发出对评价或预测肽与MHC蛋白的结合有用的基序。当具体的抗原是已知的(或怀疑是)与MHC蛋白结合的抗原时，该抗原的TCR接触残基也可以考虑在该基序中。
该方法首先需要选择出两个或更多的MHC结合口袋，这样肽残基的选择可以限制在基序的相应位置上。可以选定全部五个主要的结合口袋并开发出基序，其中基序在相应于这五个位置上是被限制的，或者可以少选择一些较少的基序并开发出被较少限制的基序。对本领域普通技术人员很明显的是，在数据库检索中一个很多限制的基序只能确定出数量很少的肽，而较少限制的基序可以确定出大量的肽。在所有的情况下，至少选择两个主要的结合口袋。当在所有五个MHC结合口袋中选择少于5个时，优选至少一个是P1而第二个选自P4，P6和P9。
或者在挑选要被基序限制的口袋之前或之后，这组氨基酸侧链可能在每一个这种口袋中结合，这样，必须测定将确定基序的相应位置的这组氨基酸残基。这可以由本领域的普通技术人员通过考虑形成口袋的氨基酸残基来完成。这些在上面A小节中给出的残基将决定口袋的大小和特性(即，疏水性的，亲水性的，带正电荷的，带负电荷的，不带电荷的)，因此决定可以结合在口袋中的侧链。考虑这些问题时参考图1，不过如果开发者对口袋的变体很熟悉的话就显得没有必要了。
做为一般的情况，根据在此披露的对形成HLA-DR蛋白的MHC结合口袋的残基的鉴定，本领域的普通技术人员可以很容易地开发出适于任何HLA-DR蛋白的结合基序的序列，因为众所周知这些残基有两个或更多的结合口袋。大小，疏水性和电荷是主要要考虑的。根据现在的公开，在这些要考虑的因素中每一个都可以根据公认的原理来对应。对于DRB1*0101等位基因的每个口袋，并相对于该HLA-DR蛋白，本文披露了一条基准，普通的技术人员能够开发出相应于其他HLA-DR等位基因的基序。因此，对于导致口袋更大/更小的替换，建议在相应的基序的位点应该被限制成允许含较小/较大的残基。同样地，对于疏水性更强/更弱的口袋，建议该相应的基序的位点应该限制成含有更多/更少的疏水性残基。最后，对于带正电荷/带负电荷的口袋，建议在相应的基序的位点中应该排除带正电荷/带负电荷的残基，并可以包含进带负电荷/带正电荷的残基。如上所述，本公开可以使普通的技术人员根据公认的原理开发出基序。
例如，而不是作为限制，我们考虑HLA-DR蛋白的P1口袋。上面描述了形成DRB1*0101中口袋的残基。对于DRB1*0101蛋白，P1口袋很大而且是疏水的，并能够容纳任何脂肪族或芳族的残基(例如，V，L，I，A，M，F，Y，W)。对于DRB1*1602蛋白同样如此。另一方面，在DRB1*1501蛋白中，β86位点用Val代替在DRB1*0101和DRB1*1602发现的Gly。这种替换缩小了MHC蛋白中P1口袋的大小，结果，该口袋不能容易地容纳进Tyr或Trp侧链。因此，对于DRB1*1501，P1位置的基序可以限制成选自V，L，I，A，M和F的残基。
同样地，根据本公开，本领域的普通技术人员可以考虑每种MHC结合口袋，或仅仅考虑被挑选出的口袋，并开发出涉及口袋形成的残基是已知的适于任何HLA-DR蛋白的基序。这些残基将决定口袋的大小和性质，并由此确定可以结合在口袋中的残基的大小和性质。当口袋相对较小时，最大的氨基酸残基(例如，Y，W)可以从基序的相应位点被排除掉，而或者当口袋是带电荷的时，可以排除掉带同样电荷的氨基酸残基。
如果涉及免疫反应的自身或外源的表位是已知的或可疑的，特别是如果它的TCR接触残基可以通过利用应答的T细胞克隆而确定，那么该表位的TCR接触残基也可以被考虑在基序的开发中。如同MHC接触残基，在基序中所有的或仅仅某些TCR接触残基可被限制。并且，对于MHC的位点，对更多位点的限制(或任何一个位点的更大的限制)在数据库检索中将只能确定较少的肽。不像MHC接触残基，其基序中至少两个位点应该限制，在基序中忽略TCR接触残基任何的限制都是可以接受的。
如果任何TCR接触残基位点都被限制在基序中，优选从被选择的P2，P3和P5的位点中挑选位点。因为与相对复杂的MHC结合口袋相反，TCR接触残基看起来有更强的特异性，所以优选在基序中被限制的残基而不是很窄限制的TCR接触残基位点。也就是说，优选该位点仅限于已知抗原的在相应位置发现的残基或仅限于在结构和电荷上高度相似的残基。
很明显，在本公开中，MHC和TCR的没有被选择进行限制的位点可以用X来表示。同样地，如下面的实施例所示，通过改变被限制变化程度的位点的数目公开了几种基序。
II.定义为了清楚地描述和清楚明白地点明要求保护的发明的本质的东西，至此以下提供了附加的权利要求中所用的几个术语的定义。
此处所用的“激活”或“活化”是用来表明个体的Dsg3肽与HLA-DR蛋白结合以形成在有自身免疫疾病的个体体内激活自身反应T细胞的复合体。
术语“氨基酸残基”和“肽残基”指的是羧基没有-OH的氨基酸或肽分子。一般说来，根据IUPAC-IUB Commission对生物化学的命名法(参见Biochemistiy(1972)111726-1732)的建议，此处用缩写来命名氨基酸和保护基。例如，Met，Ile，Leu，Ala和Gly分别代表甲硫氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，丙氨酸和甘氨酸的“残基”。残基指的是通过删除相应α-氨基酸羧基的OH部分和α-氨基的H部分的基团。术语“氨基酸侧链”是氨基酸除去-CH-(NH2)COOH部分的那部分，正如K.D.Kopple，“Peptides and Amino Acids”，W.A.Benjamin Inc.所定义的，New York and Amsterdam，1996，第2页和第33页；普通氨基酸这种侧链的实施例是-CH2CH2SCH3(甲硫氨酸的侧链)，-CH2(CH3)-CH2CH3(异亮氨酸的侧链)，-CH2CH(CH3)2(亮氨酸的侧链)或H-(甘氨酸的侧链)。
在很大程度上，用于本申请的氨基酸是在蛋白质中发现的天然存在的氨基酸，或天然存在的、这种氨基酸的含有氨基和羧基的合成代谢或分解代谢的产物。特别合适的氨基酸侧链包括选自下列氨基酸的侧链甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，甲硫氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，赖氨酸，精氨酸，脯氨酸，组氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，和色氨酸，以及那些已经被确定为细菌细胞壁肽聚糖组分的氨基酸和氨基酸类似物。
术语氨基酸残基进一步包括此处涉及的任何特定氨基酸的类似物，衍生物和同种物，以及包括羧基末端或氨基末端带保护基的氨基酸衍生物(例如，用氨基末端或羧基末端保护基修饰的)。例如，本发明试图利用侧链被延长或被缩短但仍能提供用于环化的羧基、氨基或其他的反应前体官能团的氨基酸类似物，以及具有适当的官能团变体侧链的氨基酸类似物。
“氨基酸基序”是一种与特殊功能活性相关的氨基酸序列，或选是保守氨基酸的类集。
术语“结合”指的是两个分子间在生理条件下由于，例如，共价，静电，疏水性，离子和/或氢-键的相互作用直接的相关，也包括例如盐桥和水桥的相互作用。
术语“细胞”，“宿主细胞”或“重组宿主细胞”在本文中可交替使用。很清楚该术语不仅仅涉及特殊的个体细胞，也涉及该细胞的子代或可能的子代。因为或者由于突变或者由于环境影响，继代中可能发生一定的改变，事实上这种子代可能与母细胞不完全相同，但是仍包括本文所用的术语范围内。与个体Dsg3治疗相接触的细胞包括培养中的细胞，作为机体系统一部分的细胞，例如器官或组织，或作为生物体一部分的细胞。
“嵌合蛋白”或者“融合蛋白”是一种由第一氨基酸序列编码的多肽与第二氨基酸序列的融合体，第二个氨基酸序列所定义的区域对第一个氨基酸序列来说是外源的，而且基本上与第一个氨基酸序列上的任何区域都不同源。嵌合蛋白可以表达出在有机体中发现的(即使是在不同的蛋白质中)外源的区域，该有机体也表达第一个蛋白，或者嵌合蛋白也许是一种蛋白结构的″种间的″，″基因间的″，等的融合体，这些蛋白结构由不同的有机体表达。
术语“化合物”，“试验化合物”和“分子”在此可交替地使用，而且其含义也包括，但不限于，肽，核酸，碳水化合物，小的有机分子，天然产物提取物库，和任何其他的分子(包括但不限于，化学品，金属和有机金属化合物)。
词组“保守的氨基酸替换”指的是根据某些共同性质对氨基酸进行分组。在氨基酸个体之间确定共同性质的一种有用的方法是分析氨基酸在同源生物体相应的蛋白之间变化的校正的频率(Schulz，G.E.和R.H.Schirmer，Principles of Protein Structure，Springer-Verlag)。根据这种分析，一组氨基酸可以定义为组内彼此之间优先互换的氨基酸，这样在它们彼此对整个蛋白质结构的影响最相(Schulz，G.E.和R.H.Schirmer，Principles of Protein Structure，Springer-Verlag)。如此确定的氨基酸的分组实施例包括(i)带电荷的组，由谷氨酸和天冬氨酸，赖氨酸，精氨酸和组氨酸组成，(ii)带正电荷的组，由赖氨酸，精氨酸和组氨酸组成，(iii)带负电荷的组，由谷氨酸和天冬氨酸组成，(iv)芳基组，由苯丙氨酸，酪氨酸，和色氨酸组成，(v)氮环组，由组氨酸和色氨酸组成，(vi)大的脂肪族非极性组，由缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸组成，(vii)弱极性组，由甲硫氨酸和半胱氨酸组成，(viii)小残基组，由丝氨酸，苏氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，甘氨酸，丙氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺和脯氨酸组成，(ix)脂族基组，由缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸和半胱氨酸组成的，和(x)小的羟基组，由丝氨酸和苏氨酸组成。
除上面给出的这些组之外，每种氨基酸残基可以构成它自己的组，而且由单个氨基酸构成的组可以仅仅指的是本领域通常所用的一个和/或三个字母的氨基酸的缩写。
“保守残基”是一种在一定范围相似的蛋白中相对不变的氨基酸。通常保守残基的改变只能通过如上所述的用于“保守氨基酸替换”的相似的氨基酸的替换。
当术语“基本上由……组成”涉及到包括一种和多种指定的氨基酸序列的肽时，表明该指定的氨基酸序列被添加了不超过20至30个氨基酸，此外这些添加的氨基酸基本上没有改变该指定氨基酸序列的功能。当术语“基本上由……组成”涉及到肽模拟物时，表明不超过20-30个的氨基酸模拟单元添加到指定的序列上，而这些添加的单元基本上没有改变指定序列的功能。
就治疗患者的方法而言，例如Dsg3肽或肽模拟物的“有效量”，指的是制剂中活性成分的量，当该制剂作为要求的给药方案的一部分而施用时，导致，例如与HLA-DR蛋白结合形成一种复合体，该复合体在患寻常型天疱疮的患者体内激活自身反应的T细胞。
“同源性”或“同一性”或“相似性”指的是两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过对排列用于比对的每个序列中的位点进行比较来确定同源性和同一性。当在比较的序列中相等的位置被同样的碱基或氨基酸占据时，那么该分子在该位置是同一的；当该相等的位点被同样的或相似的氨基酸残基(例如，空间和/或电子特性相似的)占据时，那么该分子在该位置可以被认为是同源的(相似的)。同源性/相似性或同一性的百分数表示是指在与被比较的序列共用的位置上同一的或相似的氨基酸数目的函数。“无关的”或“非同源的”的序列与本发明序列的序列的同一性小于40％，优选同一性小于25％。在对两个序列进行比较时，残基(氨基酸或核酸)的缺失或额外残基的存在同样会使同一性和同源/相似性降低。
术语“同源性”描述了以为数学基础的序列相似性的比较，该比较被用于鉴定具有相似的功能或基序的基因或蛋白。本发明的核酸和蛋白序列可以用作“查询序列”针对公共数据库进行检索来，例如，鉴定其他的家族成员，相关序列或同系物。可以利用Altschul，等人(1990)J.MoI.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版本)进行这种检索。可以用NBLAST程序，score＝100，wordlength＝12进行BLAST核苷酸检索，从而获得和本发明核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序，score＝50，wordlength＝3进行BLAST蛋白检索，从而获得和本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。可以利用Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402所描述的Gapped BLAST获得用于对比目的的空隙排列。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以用各个程序(例如，XBLAST和BLAST)的缺省参数(参见www.ncbi.nlm.nih.gov)。
在此所用的“同一性”意思是当将序列进行排列以使序列匹配最佳化，即，考虑空隙和插入数时，在两个或多个序列中相应的位置上完全相同的核苷酸或氨基酸残基的百分数。通过已知的方法，包括但不限于那些在(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，编，OxfordUniversity Press，New York，1988；BiocomputingInformatics andGenome Projects，Smith，D.W.，编，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，编，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in MolecularBiology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence AnalysisPrimer，Gribskov，M.和Devereux，J.，编，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，481073(1988)中所描述的方法，可以很容易地计算同一性。测定同一性的方法被设计为给出测试序列之间最多的匹配。此外，测定同一性的方法是在公众可用的计算机程序中编码的。测定两个序列之间同一性的计算机程序法包括，但不限于，GCG程序包(Devereux，J.等人，NucleicAcids Research 12(1)387(1984))，BLASTP，BLASTN，和FASTA(Altschul，S.F.等人，J.Molec.Biol.215403-410(1990)和Altschul等人Nuc.Acids Res.253389-3402(1997))。BLAST X程序可以公开地从NCBI及其他来源(BLAST Manual，Altschul，S.等人，NCBI NLM NIHBethesda，Md.20894；Altschul，S.，et al.，J.MoI.Biol.215403-410(1990)中获得。也可以用众所周知的Smith Waterman算法来确定同一性。
当“分离的”(可与“基本上纯的”交换使用)用于多肽时，意思是根据多肽或其部分的来源或处理方式(i)在宿主细胞中作为表达载体部分的表达产物而存在于宿主细胞中；或(ii)，与蛋白或其他的除了与其天然相连以外的化学部分相连；或(iii)不是天然产生的，例如，通过附加或添加至少将一个疏水部分到蛋白上从而使该蛋白是一种非天然的形式。依据“分离的”，该术语进一步指一种蛋白，它是(i)化学合成的；或(ii)在宿主细胞中表达并从相关蛋白和污染蛋白质中纯化出来的。该术语通常的意思指已经从与其天然共存的蛋白和核酸中分离出的多肽。优选的还可以是从例如抗体或凝胶基质(聚丙烯酰胺)这些用于纯化多肽的物质中分离出的多肽。
依据本题的方法治疗的“病人”或“患者”可以指的是人或者非人的动物。病人可以是哺乳动物例如，人，灵长类动物(例如，黑猩猩，大猩猩，猴子)，家养的动物(例如，狗，马，猫，猪，母牛)，啮齿类动物(例如，小鼠或大鼠)，等等。
术语“肽”，“多肽”和“蛋白”在此可交替使用。这些术语指的是未修饰的氨基酸链，还包括较少的修饰，例如磷酸化，糖基化和脂类修饰。术语“肽”和“肽模拟物”不是相互排斥的，而是包括实在的重叠。“Dsg3肽”是基本上由SEQ ID NO1的氨基酸基序组成的肽。
“肽模拟物”包括氨基酸链的任何修饰的形式，例如磷酸化，加帽，脂肪酸修饰并包括非天然的主链和/或侧链结构。如下所述，肽模拟物含有氨基酸链和非肽小分子间的结构上的连续体。肽模拟物通常保有可识别的类肽的多聚体单元结构。“Dsg3肽模拟物”是种设计成模仿Dsg3肽的肽模拟物，保有Dsg3肽的某些构造单元，并保有与HLA-DR蛋白结合形成一种在患寻常型天疱疮的病人体内激活自身反应的T细胞的复合体的功能。
在此使用的短语“保护基”，意思是保护反应官能团不进行不需要的化学反应的取代基。这样的保护基的实施例包括羧酸酯和硼酸酯，醇类和乙缩醛的醚，醛和酮的酮缩醇。例如，在此使用的短语“N-末端保护基”或“氨基保护基”指的是各种可以用来在合成过程中保护氨基酸或肽的N-末端不参与不需要的反应的氨基保护基。合适的基团的实施例包括酰基保护基，举例说明例如，甲酰基，丹磺酰基，乙酰基，苯甲酰基，三氟乙酰基，琥珀酰基和甲氧基琥珀酰基；芳香族的氨基甲酯保护基例如，苄氧基碳酰(Cbz)；和脂肪族的氨基甲酯保护基例如叔-丁氧基碳酰(Boc)或9-芴基甲氧碳酰(FMOC)。
“可药用的载体”在此定义成一种生理学可接受的用于病人给药而且保持与其一起被施用的肽的治疗学性质的载体。可药用的载体及其配制是熟知的，通常在例如Remington的药物科学(第十八版本，编辑A.Gennaro，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990)中有所描述。一种示范性的可药用的载体是生理盐水。在此使用的短语“可药用的载体”意思是一种可药用的材料，组合物或媒介物，例如液体或固体的填料，稀释剂，赋形剂，溶剂或包囊材料，涉及从某个器官，或躯体的某个部分的给药位点将本发明的肽传送或转运到另一个器官，或躯体的另一部分。从与制剂中其他成分不矛盾且对病人无害的意义上讲，每个载体都必须是“可接受的”。同样可药用的载体也不能改变本题的肽的比活性。一些可以作为可药用的载体的材料的实施例包括(1)糖类，例如乳糖，葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素，及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠盐，乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂的蜡；(9)油类，例如花生油，棉子油，红花油，芝麻油，橄榄油，玉米油和豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油，山梨糖醇，甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原的水；(17)等渗盐水；(18)Ringer’s溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲剂；和(21)其他的无毒的适合用于药物制剂的物质。在此使用的“小分子”意思是所提到的组合物，其分子量小于大约5kD并且最优选小于大约2.5kD。小分子可以是核酸，肽，多肽，肽模拟物，碳水化合物，脂类或其他的有机物(含碳的)或无机分子。许多药物公司都有大规模的含有系列小分子，通常是真菌的，细菌的，或藻类的提取物的化学和/或生物合剂库，可以用本发明的任何一种分析从中进行筛选。
此处用在氨基酸序列中的字母“x”是用来表示在这些位置上可能是二十个标准氨基酸中的任何一个。出于肽模拟物设计的目的，在氨基酸序列中的“x”可以被目标顺序中的氨基酸的模拟物替代，或者该氨基酸可以被基本上与肽模拟物活性不抵触的任何形式的间隔物替代。
在某些方面，本发明涉及Dsg3的治疗剂，该被设计作为含有SEQID NO1氨基酸基序的Dsg3肽的模拟物或假目标。不希望受该机制的约束，预期这些肽可以与HLA-DR蛋白结合而产生在患有自身免疫疾病的患者体内激活自身反应T细胞的复合体。这样的治疗可以，例如，包含以Dsg3的氨基酸序列为基础的肽，肽模拟物，小分子。
如在此使用的，“盐”包括可药用的盐，酯类，水化物，溶剂化物或者其他的包含任何的这些盐，酯类的化合物的衍生物，而其他的衍生物本领域的技术人员可以利用已知的衍生方法来制备，产生的化合物可以施用给动物或人而没有实在的有毒影响，且既可以有药物学活性的也可以是前体药物。可药用的盐包括，但不限于，碱金属和碱土金属的盐，包括但不限于钠盐，钾盐，锂盐，钙盐，和镁盐；过渡金属的盐，例如锌盐，铜盐，和铝盐；聚阳离子反离子盐，例如但不限于铵和被取代的铵盐和有机胺盐，例如羟烷基胺和烷基胺；无机酸的盐，例如但不限于盐酸盐和硫酸盐，有机酸的盐例如但不限于醋酸盐，乳酸盐，苹果酸盐，酒石酸盐，柠檬酸盐，抗坏血酸，琥珀酸盐，丁酸盐，戊酸盐和延胡索酸盐。在此还考虑了相应的酯类。
术语“可药用的盐”指的是Dsg3和MS肽的相对无毒的，无机的和有机的加成盐。这些盐可以在肽的最后分离和纯化过程中原位制备，或用合适的有机或无机酸对纯化肽的游离碱形式单独作用，并分离出这种形式的盐。代表性的盐包括盐酸盐，氢溴酸盐，硫酸盐，硫酸氢盐，磷酸盐，硝酸盐，醋酸盐，戊酸盐，油酸盐，棕榈酸盐，硬脂酸盐，月桂酸盐，苯甲酸盐，乳酸盐，甲苯磺酸盐，柠檬酸盐，马来酸盐，延胡索酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，napthylate，甲磺酸盐，葡庚糖酸盐，乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等等。(参见，例如，Berge等人(1977)″Pharmaceutical Salts″，J.Pharm.Sd.661-19)。
在此根据描述提出的术语“基序”意思是对可能占据某些氨基酸序列相对位点的残基的一系列的限制。基序必须限制到氨基酸序列上至少三个且最好为四个或五个位点。第一个(N-末端)和最后一个(C-末端)相对位点的被限制的氨基酸位点应该被至少两个，不超过十二个氨基酸残基分开。例如，P1和P4可能是第一个和最后一个的限制残基被，而这些残基被两个残基分开。另一个实施例是，P1和P11可能是第一个和最后一个残基被限制，而这些残基被十个残基分开。
第一个和最后一个被限制的位点之间的位点可能是被限制的或非限制的，除了基序的总共至少三个位点必须受到限制。对三个必须受到限制的位点，至少有两个必须是对应于主要的MHC结合口袋的残基。如果只有两个受限制的残基与MHC结合残基对应，那么第三个必须与TCR接触残基对应。更进一步地说，至少一个受限制的位点必须与P1或者P4的结合位点对应。被“限制”的意思是至少一个，而最好十个，氨基酸残基应该从位点中被排除。
如果它可以与基序的位点排列比对，使得在基序的每个受限制的位点，氨基酸序列包括了依据确定基序的限制而没有从位点上排除的残基，则氨基酸序列“对应”到基序。对于确定基序的限制，其可以以HLA-DR蛋白的MHC结合口袋的大小和特性以及任选已知表位的TCR接触残基衍生得到，，结合基序的受限制的位点也可以被认为与MHC结合口袋和TCR接触残基相对应。
对于蛋白或多肽，术语“分离的”意思是从它们的天然的或天然化学微观环境中被分离出。因此，分离自细菌的多肽应该是处于基本上没有大多数的其他细菌多肽的制剂中；同样地，分离的病毒多肽的制剂应该基本上没有包含病毒的其他多肽。
当术语“与…相关”用在具体的HLA-DR蛋白和自身免疫疾病或自身免疫反应的关系中时，意思是依据临床的或流行病学的研究蛋白与疾病/反应是正相关的，那么就证明当该蛋白存在时，疾病/反应发展的可能性就会增加。
术语“HLA-DR蛋白”指的是一种MHC II类HLA DR基因的特定的等位基因的特定的蛋白产物。与HLA-DR蛋白相关的疾病是一种与该特定蛋白而不仅仅与HLA-DR基因位点相关的疾病。
术语“人类病原体”指的是一种能够感染人类并引起免疫反应的细菌，病毒或原生动物。术语“特异地”是用来排除成为正常人的肠内菌丛一部分的细菌。对于该术语，“正常人肠内菌丛”是指通常栖息在人类肠道，但通常不会引起疾病的细菌，例如大肠杆菌。
当术语“自身反应性的”应用于T细胞时，指的是来自于被人类自身表位激活的人的T细胞。对于T细胞“激活”，其意思诱导增殖，分泌淋巴细胞因子(细胞因子)和/或引发效应物的活性(例如细胞毒性)。
术语“自身抗原”指的是自身蛋白或多肽，包括“自身表位”。“自身表位”指的是自身抗原的一部分，当它结合到MHC分子并通过MHC分子递呈被T细胞识别并与之。
对于使个体耐受抗原，术语“有效量”是当与MHC结合并通过MHC分子来递呈时，足以使T细胞对抗原无反应性的抗原的量，该T细胞在其他方式下对抗原是特异性的。当T细胞被递呈特异性的抗原时，无反应性的T细胞就不能激活。对于使个体对抗原产生免疫，术语“有效量”是足够诱导产生对抗原具有特异性的T细胞的免疫反应的量。典型的剂量范围是从1纳克/公斤到100毫克/公斤以至500毫克/公斤。有效量将根据年龄，性别和对抗原的敏感度这些因素而变化。
术语“核心MHC结合残基”指的是与结合到HLA-DR分子的肽P1到P9位点相应的表位的残基。术语“内核MHC结合残基”指的是那些与结合HLA-DR分子的肽的P1到P6位点相应的表位的残基。
III.发明的具体实施方式
A.肽/组合物/肽模拟物本发明提供了人类桥粒芯糖蛋白3(Dsg3)肽和肽模拟物。Dsg3肽包括hose肽，它包含了具有基序#1或者基序#2的SEQ ID NO1的结构基序。可选择，该肽能起到与HLA-DR蛋白结合形成在患有自身免疫疾病的患者体内激活自身反应T细胞的复合体。更准确地说，SEQ IDNO1的肽与HLA-DR4蛋白结合，由此形成在带有寻常型天疱疮的患者/病人体内激活自身反应T细胞的复合体。
在一个
具体实施例方式
中，该多肽基本上由SEQ ID NO1表示的氨基酸序列组成。或者，该多肽由SEQ ID NO1组成。
在进一步的发明中，本发明的组合物进一步包含可药用的添加剂以提高肽在组合物中的稳定性和/或控制组合物的释放速度。本发明的可药用的添加剂不改变本题的肽的比活性。优选的可药用的添加剂是糖类例如甘露糖醇，山梨糖醇，葡萄糖，木糖醇，海藻糖，山梨糖，蔗糖，半乳糖，右旋糖酐，葡萄糖，果糖，乳糖及其混合物。优选，本发明的糖类为葡萄糖。本发明的可药用的添加剂可以由可药用的载体和/或赋形剂葡萄糖组合而成。更优选的是，本发明的组合物是用5％的葡萄糖配制成的制剂给药。或者，优选的可药用的添加剂是一种表面活性剂例如吐温20或吐温80，用以提高肽的稳定性并降低药物溶液的胶化。更优选的是，表面活性剂是以溶液的0.01％到5％的量添加到组合物中的。添加这些可药用的添加剂提高了组合物在保存过程中的稳定性和半寿期。
在某些
具体实施例方式
中，本题的Dsg3治疗包括Dsg3肽的肽模拟物(Dsg3肽模拟物)。肽模拟物是基于或来源于肽和蛋白的化合物。一般可以通过对已知的Dsg3肽，利用一种和多种非天然的氨基酸，构造的约束，电子等排性替换，等等方式进行结构修饰从而获得本发明的Dsg3肽模拟物。本题的肽模拟物构成了肽与非肽合成结构之间结构空间的连续统一体；因此肽模拟物可用于描绘药效基团并促进肽转化成具有母本Dsg3肽的活性的非肽化合物。
Dsg3肽模拟物可以具有这样的属性，诸如是不可水解的(例如，增加了对蛋白酶或其他降解相应肽的生理条件的稳定性)或增加了与HLA-DR蛋白结合，以产生激活患有自身免疫疾病的患者体内自身反应T细胞的复合体的特异性和/或效力。出于说明的目的，本发明肽的类似物可以利用下列方法来制备，例如苯二氮(例如，参见Freidinger等人，in PeptidesChemistry and Biology，G.R.Marshall ed.，ESCOMPublisherLeiden，Netherlands，1988)，取代的γ内酰胺环(Garvey等人，in PeptidesChemistry and Biology，G.R.Marshall ed.，ESCOM PublisherLeiden，Netherlands，1988，pi 23)，C-7模拟物(Huffman等人in PeptidesChemistry and Biology，G.R.Marshall ed.，ESCOM PublisherLeiden，Netherlands，1988，p.105)，南五味子酮(keto-methylene)拟肽(Ewenson等人，(1986)J Med Chem 29295；和Ewenson等人in PeptidesStructure and Function(Proceedings of the 9th American PeptideSymposium)Pierce Chemical Co.Rockland，IL，1985)，b-翻转二肽核心(b-turn dipeptide cores)(Nagai等人(1985)Tetrahedron Letters 26647；和Sato等人(1986)J.Chem.Soc.Perldn.Trans.11231)，b-氨基醇(Gordon等人(1985)Biochem.Biophys.Res.Commun.126419；和Dann等人(1986)Biochem.Biophys.Res.Commun.13471)，二氨基酮(Natarajan等人(1984)Biochem.Biophys.Res.Commun.124141)，亚甲基氨基--修饰(Roark等人in PeptidesChemistry and Biology，G.R.Marshall编辑，ESCOM PublisherLeiden，Netherlands，1988，p134)，vinylogous多肽(Hagihara等人(1992)J.Am.Chem.Soc.1146568-70)，寡氨基苯甲酰胺(Hamuro等人(1996)J.Am.Chem.Soc.1187529-41)，vinylogous磺氨基肽(sulfonaminopeptides)(Hagihara等人(1996)Chem.Eur.J.2644-55)，aedemers(Lokey等人(1995)Nature 375303-5)，和糖基的肽模拟物(Horvat等人(1998)J.Chem.Soc.PerkinsTrans.11789-95)。通常还可以参见Session IIIAnalytic and syntheticmethods，in PeptidesChemistry and Biology，G.R.Marshall编辑，ESCOM PublisherLeiden，Netherlands，1988)。另外，美国专利No.5,422,426描述的用于生产肽和肽模拟物的高通量和组合方法。
在进一步的具体实施方式
中，本发明特别考虑了利用肽二级结构的构像限制的模拟物。已经披露出许多用于肽酰胺键的替代物。已开发出的经常用于酰胺键的替代物包括以下基团(i)反-烯烃，(ii)氟烷(fluoroalkene)，(iii)亚甲基氨基，(iv)磷酸酰胺，和(v)磺酰胺。
另外，也可以利用对Dsg3肽主链更实在的修饰的肽模拟物。这些种类的肽模拟物包括(i)颠倒-转换(retro-inverso)类似物，和(ii)N-烷基甘氨酸类似物(所谓的类肽，参见例如Simon等人(1992)Proc.Natl.Acad.ScL USA 899367-71及其他上述的肽模拟物。
这种颠倒-转换-类似物的制备可以根据本领域已知的方法，例如Sisto等人U.S.Patent 4,522,752描述的。例如可以通过下述的方法制备颠倒-转换-类似物。第一步是形成氨基酸的孪位的二胺类似物。该相当于N-末端氨基酸的孪位的二胺，例如N-末端脯氨酸的合成是通过Radhakrishna等人(1979)J.Org.Chem.441746描述的方法，用氨处理N-保护的脯氨酸类似物在HOBT-DCC耦合条件下产生出未被取代的酰胺，然后与I，I-双(三氟乙酰氧基)碘代苯(TIB)进行Hofmann--型重新排列，有效地除去来自未被取代的酰胺的羰基部分。然后产生的胺与侧链保护的(例如，苯甲基酯)第二个氨基酸，例如N-Fmoc D-苏氨酸残基在标准条件下偶合，产生拟二肽。如美国专利5,061,811(Pinori等人)所描述的，在二甲基甲酰胺中用哌啶去除掉Fmoc(芴基甲氧甲羰基)基团，产生的胺在与适当的烷基化的，侧链保护的麦德鲁姆酸的衍生物缩合之前，用双三甲硅烷基乙酰氨(BSA)进行三甲硅烷化从而产生颠倒-转换-三肽。麦德鲁姆酸是一种环状的丙二酸盐类似物，在其第五个碳上(羰基之间的碳)的R替换决定了添加的氨基酸部分。例如，如果麦德鲁姆酸的R基是甲基，那么添加的是丙氨酸部分，则-颠倒-转换三肽的化学式是PTA。与麦德鲁姆酸进行开环反应后残留的酯基在标准条件下进一步与氨基酸类似物偶合得到保护的四肽类似物。去除保护基以释放产物，再重复上述步骤来延长该四肽从而得到全长的肽模拟物。通常可以显然，混合的肽，例如包括一些标准肽键，可以由这种方法来制备。做为一般性的指导，一般是对蛋白水解敏感的位点进行修改，以使较不易受影响的酰胺键用于模拟转变的。最终产品或其中间物可以用HPLC来纯化。另一个具体实施方式
包括了利用相似的保护化学技术从C末端构建-颠倒-转换四肽。
例如这种颠倒--对映体(retro-enantio)类似物可以是将市场上可买到的D-氨基酸(或其类似物)用标准的固相-或液相肽合成技术合成的化合物。例如，在一个优选的固相合成方法中，适当的氨基保护(t-丁基氧羰基，Boc)的残基(例如D-脯氨酸)与固相载体例如氯甲基树脂共价结合。用二氯甲烷(DCM)洗涤树脂，并通过含三氟乙酸(TFA)的DCM的处理除去BOC保护基。洗涤并中和树脂，再通过与双异丙基碳化二亚胺耦合引入下一个Boc保护的D-氨基酸(例如D-苏氨酸)。再次洗涤树脂，对剩余的氨基酸(D-丙氨酸，D-脯氨酸，等等)循环重复。保护的颠倒--对映体肽完全合成后，除去保护基并通过用氢氟酸/苯甲醚/甲硫醚/茴香硫醚处理将肽从固相载体上裂解下。最终产物用HPLC纯化得到纯的颠倒-对映体类似物。
Dsg3肽的反式烯烃类似物可以根据Y.K.Shue等人(1987)Tetrahedron Letters，283225的方法来合成。其他的拟二肽可以通过上述的方法来制备，仅仅替换了适当的起始Boc氨基酸和维悌希试剂。根据使用的试剂的性质在方法中可能需要有些改动，但任何改动纯粹是常规性的而且对本领域的技术人员来说是显而易见的。
可能进一步将通过以上所述方法合成的拟二肽偶联到其他的拟二肽上，以制备用数个烯官能团代替酰胺官能团的肽类似物。例如，可以制备出相当于Pro-Pro或Glu-Tyr，等等的拟二肽，然后通过标准技术将其偶联在一起得到残基之间烯键交替的Dsg3肽类似物。
可以修改已知的合成方案来合成膦酸酯衍生物。参见，例如，Loots等人in PeptidesChemistry and Biology，(Escom Science Publishers，Leiden，1988，p.118)；Petrillo等人in PeptidesStructure and Function(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium，Pierce ChemicalCo.Rockland，IL5 1985)。
许多其他的肽模拟物的结构是本领域已知的，可以很容易地对其进行修饰用在本题的Dsg3肽模拟物中。举例说明，Dsg3肽模拟物中可以结合进1-氮杂二环[4.3.0]壬烷替代物(参见Kim等人(1997)J.Org.Chem.622847)，或N-酰基piperazic酸(参见Xi等人(1998)J.Am.Chem.Soc.12080)，或2-取代哌嗪部分作为抑制的氨基酸类似物(参见Williams等人(1996)J.Med.Chem.391345-1348)。在其他的具体实施方式
中，可以用芳基和双芳基部分，例如单环或二环的芳基的或杂芳基的原子核，或双芳基的，芳香族-杂芳基的，或双杂芳基核替换某些氨基酸残基。
在某些
具体实施例方式
中，本题的Dsg3肽或肽模拟物可以在N-末端(或其他的正常N-末端的其他末端结构例如羰基)，C-末端(或其他的正常C-末端的其他末端结构例如胺)加帽，或者两端都加。例如，Dsg3治疗剂可以包含含有一种和多种Dsg3序列的多肽，其中的多肽或者在N-末端有个乙酰基帽子，或者在C-末端有个酰胺帽子，或者两者都有。合成肽加帽的方法是公开的，例如美国专利5,994,309。
本题的Dsg3肽模拟物可以通过，例如组合的合成技术与在此描述的高通量筛选相结合而优化。
此外，其他的肽模拟物实施例包括，但不限于以蛋白为基础的化合物，以碳水化合物为基础的化合物，以脂类为基础的化合物，以核酸为基础的化合物，天然有机化合物，合成衍生的有机化合物，抗独特型抗体和/或催化抗体，或其片段。可以通过，例如，对天然的和合成的化合物文库进行筛选获得肽模拟物，该化合物能够与HLA-DR蛋白结合产生激活患有，例如寻常型天疱疮的患者的自身反应T细胞的复合体。肽模拟物还可以获自，例如，对天然的和合成的化合物的文库，尤其是化学的或组合的文库(即，序列或大小不同但没有同样的构建模块的化合物的文库)。
在某些方面，本题的Dsg3治疗剂分子，例如肽模拟物和小分子可以通过合理设计的而获得。在示范性的合理设计方法中，本发明靶肽的三维结构可以通过，例如，核磁共振(NMR)或X-射线晶体衍射法进行分析因此可以通过，例如，计算机模拟用三维结构预测可能的Dsg3治疗剂的结构。然后通过，例如，化学合成，重组DNA技术，或通过从天然来源(例如植物，动物，细菌和真菌)分离分子而制备具预测的Dsg3结构的治疗剂。因此，Dsg3治疗剂可以仿照以上序列中的一种的非限制的多肽链。所述靶肽是非限制的，想要的结构的构建可以不倚靠NMR或X-射线晶体衍射法，并且可以采用任何一种程序用于构建短肽链。
在某些
具体实施例方式
中，Dsg3肽，肽模拟物和小分子能够与HLA-DR蛋白结合形成激活患有自身免疫疾病的患者的自身反应T细胞的复合体。在示范性的具体实施方式
中，含有以SEQ ID NO1为基础的一段的Dsg3肽，肽模拟物或小分子会与HLA-DR4蛋白结合形成激活带有寻常型天疱疮的患者自身反应T细胞的复合体。可选择，肽，肽模拟物和小分子的KD不超过作为其基础的Dsg3肽的KD的10倍，以及可选择大致相等的KD或小10倍或庚小的KD。
在进一步的发明中，本发明的组合物进一步包含可药用的添加剂以提高肽在组合物中的稳定性和/或控制组合物的释放速度。本发明的可药用的添加剂不改变本题的肽的比活性。优选的可药用的添加剂是糖类例如甘露糖醇，山梨糖醇，葡萄糖，木糖醇，海藻糖，山梨糖，蔗糖，半乳糖，右旋糖酐，葡萄糖，果糖，乳糖及其混合物。优选，本发明的糖类为葡萄糖。本发明的可药用的添加剂可以由可药用的载体和/或赋形剂例如盐的组合而成。
B.融合蛋白Dsg3肽和肽模拟物可以结合进融合蛋白中。一般说来，融合蛋白提供了第二功能性的部分，诸如，例如，载体蛋白，生产蛋白或稳定蛋白。
有用的载体蛋白质包括，例如，细菌溶血素或“掺合剂”，例如丙甲菌素或巯基激活的溶细胞素。可采用的其他的载体部分包括细菌毒素，例如假单胞菌属外毒素，破伤风毒素，蓖麻毒毒素，和白喉毒素的细胞进入组分。有用的还有来自蜂毒的蜂毒素。
稳定蛋白包括增强Dsg3肽，肽模拟物或抗体稳定性的蛋白。生产蛋白包括帮助Dsg3肽产生的蛋白。融合蛋白质可以促进蛋白的表达是公知的，因此可被用于本发明Dsg3肽的表达。示范性的生产肽包括GST，多聚组氨酸，纤维素结合蛋白，壳多糖结合蛋白，等等。例如，Dsg3肽可以制备成谷胱甘肽-S-转移酶(GST-融合)蛋白。这种GST-融合蛋白可以使Dsg3肽很容易纯化，至于通过利用谷胱甘肽衍生的基质的实施例参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology，eds.Ausubel等人(N.Y.John Wiley & Sons，1991)。在另一个具体实施方式
中，编码纯化前导序列，聚--(His)/肠激酶切割位点序列的融合基因以置于Dsg3肽的N-末端，以便通过Ni2+金属树脂进行亲和层析纯化聚(His)Dsg3肽蛋白。如果需要，可以随后通过肠激酶(例如参见Hochuli等人(1987)J.Chromatography 411177；and Janknecht et al.PNAS888972)处理除去纯化前导序列。
制备融合基因的技术是本领域技术人员已知的。基本上，将各种编码不同的多肽序列的DNA片段连接起来是根据传统方法，采用平头-末端或交错-末端连接，用限制性内切酶消化以提供合适的末端，酌情填入粘性末端，用碱性磷酸酶处理以避免不合需要的连接，然后再酶催化连接。在另一个具体实施方式
中，可以通过常规方法包括自动DNA合成仪合成融合基因。或者，可以利用在两个连续的基因片段之间产生互补的外伸片段的锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述基因片段随后可以退火产生嵌合基因序列(参见，例如，Current Protocols inMolecular Biology，eds.Ausubel等人John Wiley & Sons1992)。
编码融合蛋白的核酸可操作地与调节序列连接，然后利用常规的重组DNA方法将其引入到合适的表达系统中。
C.核酸的导入另一方面，本发明涉及包含，例如在示范性的方法中，编码本发明的Dsg3肽的核酸的构建体，该核酸可操作地与至少一个用于将核酸导入病毒感染的细胞并在其中表达的转录调节序列连接。本发明制备的基因构建体是用作，例如，基因治疗方法的一部分，使被治疗的动物产生本题的治疗蛋白。
可以用本领域已知的任何一种用于DNA片段插入载体的方法来构建表达载体，该表达载体包括合适的转录/翻译调控信号以及想要的核酸序列，例如编码Dsg3肽的核苷酸序列或编码与HLA-DR蛋白结合以产生激活患自身免疫疾病的患者自身反应T细胞的复合体的肽的核酸。(参见，例如，Maniatis T.，Fritsch E.F.，和Sambrook J.(1989)Molecular Cloning(A Laboratory Manual)，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York；和Ausubel F.M.，Brent R.，Kingston R.E.，Moore，D.D.，Seidman J.G.，Smith J.A.，and Struhl K.(1992)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NewYork)。这些方法可以包括体外DNA重组和合成技术以及体内遗传重组。可以通过另一种核酸序列调节本题的核酸的表达，以便在用重组DNA分子感染的或转染的宿主中表达编码的多肽。例如，可以通过本领域已知的任何一种启动子/增强子元件来控制Dsg3肽的表达。启动子的激活可以是组织特异性的或者是通过代谢产物或施用的物质可诱导的。
可以用来体内控制Dsg3肽表达的启动子/增强子包括，但不限于被靶病毒利用的启动子，巨细胞病毒(CMV)的启动子/增强子(Karasuyama等人，1989，J.Exp.Med.，16913)，人的b-肌动蛋白启动子(Gunning等人(1987)PNAS 844831-4835)，存在于小鼠乳腺瘤病毒长末端重复序列(MMTV LTR)的糖皮质激素诱寻型启动子(Klessig等人(1984)MoI.Cell Biol.41354-1362)，Moloney鼠白血病病毒长末端重复序列(MuLV LTR)(Weiss等人(1985)RNA Tumor Viruses，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)，SV40早期或末期的区域启动子(Bernoist等人(1981)Nature 290304-310；Templeton等人(1984)MoI.Cell Biol，4817；和Sprague等人(1983)J.Virol，45773)，劳氏肉瘤病毒(RSV)3′长末端重复序列中所含有的启动子(Yamamoto等人1980，Cell，22787-797)，单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶启动子/增强子(Wagner等人(1981)PNAS 823567-71)，和单纯疱疹病毒LAT启动子(Wolfe等人(1992)Nature Genetics，1379-384)，以及角蛋白基因启动子例如角蛋白14。
本题Dsg3治疗多肽的表达构建体可以在任何一种生物学上有效的载体，例如任何一种能够在体内有效地将重组基因输送到细胞的制剂或组合物形式给药。引进的方法包括在病毒载体中插入Dsg3肽编码序列，病毒载体包括重组反转录病毒，腺病毒，腺病毒相关病毒，和单纯疱疹病毒-1，或重组的真核生物的质粒。病毒载体直接转染细胞；质粒DNA可以在例如阳离子脂质体(lipofectin)或衍生成(例如抗体结合的)，聚赖氨酸结合体，短杆菌肽S，人工病毒外壳或其他这样的胞内载体的帮助下进行输送，也可以进行基因构建体或CaPO4沉淀而直接体内注射。可以理解的是由于合适的靶细胞的转导代表着基因治疗决定性的第一步，特异的基因送递系统的选择将取决于指定靶的表现型和给药途径，例如局部或全身这些因素。
用于体内将核酸导入细胞的优选的方法是利用病毒载体，其包含编码想要的特定的Dsg3肽的核酸。用病毒载体传染细胞有下列好处即大部分的靶细胞可以接收到核酸。另外，在病毒载体中编码的分子，例如，重组的Dsg3肽，在吸收了病毒载体核酸的细胞中可有效地表达。
除病毒转化法之外，上面举例说明的那些非病毒方法也可以用来在动物的组织中表达Dsg3肽。大多数基因转移的非病毒方法依靠的是哺乳动物细胞吸收和胞内运输高分子的正常的机制。在优选的具体实施方式
中，本发明的非病毒基因送递系统依靠靶细胞内吞途径吸收编码Dsg3肽的基因。这些类型的示范性的基因送递系统包括脂质体(liposomal)衍生的系统，聚赖氨酸结合体，和人工病毒外壳。
在临床的设置中，用于治疗剂Dsg3肽编码序列的基因送递系统可以通过许多方法中的任何一种引入病人体内，每种方法都是本领域熟知的。例如，基因送递系统的药物制剂可以采用全身地，例如通过静脉注射，和通过基因送递载体提供特异的转染而主要在靶细胞中产生蛋白的特异转导，由于转录调节序列控制受体基因的表达而产生细胞型和组织型表达，或者这些方法组合使用。在其他的具体实施方式
中，由于动物体内的导入是更局限的，所以最初的重组基因传送非常有限。例如，基因送递载体可以采用通过导管(参见U.S.专利5,328,470)或“基因枪”技术。在优选的具体实施方式
中，本发明基因治疗的构建体是局部施用到皮肤或粘膜组织感染的和转化的细胞上。在一个具体实施方式
中，Dsg3肽基因构建体可以在基因治疗框架中利用例如Dev等人((1994)Cancer Treat.Rev.20105-115)描述的技术通过电穿孔法来输送。
基因治疗构建体的药物制剂可以基本上由含在可接受的稀释剂中的基因送递系统组成，或者可以包含包埋有基因送递载体的缓释基质。或者，可以完全由重组细胞产生出完整的基因送递系统，例如逆转录病毒载体，药物制剂可以包含一种和多种产生基因送递系统的细胞。
D.盐类所考虑的还有可药用衍生物的制剂，包括磺酰胺的盐类，酯类，酸类和碱类，溶剂化物，水化物和前体药物。尤其是提供中性磺酰胺化合物的衍生物，它们产生的制剂稳定性要比制剂中包含相应中性化合物的稳定性高。优选的是盐类，特别是碱金属盐，而更优选的是钠盐，包括由钠化合物制备的盐，包括但不限于，碳酸氢钠，其结果产物是钠盐和磷酸氢二钠，其结果化合物是磷酸氢二钠盐。每种化合物的钠盐都是最优选的。
从其制备衍生物，尤其是盐，优选钠盐的磺酰胺具有化学式I 盐类衍生物包括，但不限于于，碱金属和碱土金属的盐，包括但不限于于钠盐，钾盐，锂盐，钙盐，和镁盐；过渡金属的盐，例如锌盐，铜盐，金盐，和银盐及其他金属盐，例如铝盐；阳离子和聚阳离子反离子盐，例如但不限于于铵和被取代的铵盐和有机胺盐，例如羟烷基铵和烷基胺；无机酸的盐，例如但不限于盐酸盐和硫酸盐；有机酸的盐例如但不限于于醋酸盐，乳酸盐，苹果酸盐，酒石酸盐，柠檬酸盐，抗坏血酸，琥珀酸盐，丁酸，戊酸盐和延胡索酸盐。在此还考虑了任何酸类相应的酯。
优选盐类中醋酸盐盐类，包括三氟醋酸盐，N，N-双苯甲基乙二胺，氯普鲁卡因，胆碱，氨，二乙醇胺及其他的羟烷基胺，乙二胺，N-甲葡糖胺，普鲁卡因，N-苯甲基苯乙胺，1-对-氯苄基-2-吡咯烷-1’-基甲基苯并咪唑，二乙胺及其他烷基胺，哌嗪，tris(羟甲基)甲胺，铝盐，钙盐，锂盐，镁盐，钾盐，磷酸氢钠，磷酸二钠，钠盐，锌盐，钡盐，金盐，银盐和铋盐。在此优选碱金属盐，特别是钠盐。
该制剂是适于通过任何一种想要途径施用的组合物，包括溶液，悬浮液，乳剂，片剂，可分散的片剂，药丸，胶囊，粉剂，用于吸入器的干粉，缓释的制剂，用于鼻腔和呼吸输送的气溶胶，用于透皮和任何一种其他的合适途径输送的贴片。组合物应该适用于口服，或是作为水性或油性溶液或者乳剂，通过注射，包括皮下，肌内注射或者静脉注射，透皮给药及其他选择的途径而非肠道给药。
还提供了磺酰胺衍生物的冻干粉剂，其制备方法，和包含重建的冻干粉剂的剂型。同样地提供了包含粉剂的小瓶和安瓿瓶和注射器及其他合适的容器。
这样的磺酰胺描述于美国专利No.5,464,853，5,594,021，5,591,761，5,571,821，5,514,691，5,464,853，5,962,490；和公开的国际PCT申请No.WO 96/31492和WO 97/27979，在此全文一并引用。
在此提供的制剂通过所选择的途径来给药，制剂中包含有效浓度的上面提到的化合物的可药用的盐类。同样提供了输送有效剂量用于治疗自身免疫疾病，例如寻常型天疱疮的制剂。
包含磺酰胺钠盐的胶囊和片剂也是优选的。特别优选那些输送有效剂量用于治疗寻常型天疱疮的制剂。有效量和浓度是对改善任何紊乱症状有效的量。
在其他的具体实施方式
中，制剂是固体剂型或者凝胶剂，优选胶囊或者片剂。在优选的具体实施方式
中，制剂是包含有效量，一般包含按重量计算大约10-100％，优选大约50到95％，更优选大约75-85％，最优选大约80-85％的一种和多种磷酸氢二钠或者钠盐，优选钠盐，一种和多种化学式I的磺酰胺化合物的盐；大约0到25％，优选8-15％的稀释剂或者粘合剂，例如乳糖或者微晶纤维素；大约0到10％，优选大约3-7％的崩解剂，变性淀粉或者纤维素多聚体，特别是交联的羧甲基纤维素钠盐，例如crosscarmellose钠(可商业获得的Crosscarmellose钠NF名称为AC-DI-SOL，FMC公司，Philadelphia，Pa.)，或者淀粉羟基乙酸钠；和0-2％，优选0.1-2％的润滑剂，如硬脂酸镁，滑石粉和硬脂酸钙的胶囊。随着包被多聚体的溶解，崩解剂，例如crosscarmellose钠或者淀粉羟基乙酸钠，可以使纤维素基体迅速崩解立即释放出活性制剂。在所有的具体实施方式
中，可以凭经验确定活性成分和辅助配合剂的精确量，并随给药途径，被治疗的病人的病症，年龄，性别和健康状态而改变剂量。
在示范性的具体实施方式
中，制剂胶囊包含大约80-90％，优选大约83％的一种或多种化学式I的磺酰胺化合物的一种或多种钠盐；大约10-15％，优选大约11％的稀释剂或者粘合剂，例如乳糖或者微晶纤维素；大约1-10％，优选大约5％的崩解剂，例如crosscarmellose钠或者淀粉羟基乙酸钠；和大约0.1到5％，优选大约1％的润滑剂，硬脂酸镁。
在另一个在此详细描述的具体实施方式
中，制剂胶囊包含大约80-90％，优选大约80-85％的一种或多种化学式I的磺酰胺化合物的一种或多种钠盐，这取决于被选择的化合物和指症；大约10-15％，优选大约11％的稀释剂或者粘合剂，例如乳糖或者微晶纤维素；大约1-10％，优选大约5％的崩解剂，例如crosscarmellose钠或者淀粉羟基乙酸钠；和大约0.1到5％，优选大约1％的润滑剂，硬脂酸镁。在此也同样考虑了作为片剂给药的固体形式。
由包含磺酰胺钠盐的无菌冻干粉剂制备的制剂也是优选的。在此同样提供了冻干粉剂和制备该粉剂的方法。在一个具体实施方式
中，组合物是以冻干固体颗粒的形式提供的，其中包含一种和多种磷酸氢二钠或者钠盐，优选钠盐，一种或多种化学式I的磺酰胺化合物的盐类，还含有以下的一种或多种(a)缓冲剂，例如磷酸钠盐或者磷酸钾，或者柠檬酸盐；(b)增溶剂，例如LABRASOL(由Gartefosse SA，France销售的聚乙二醇-8辛酸山羊甘油酯)，二甲亚砜(DMSO)，二(三甲基甲硅烷)乙酰胺，乙醇，丙二醇乙二醇(PG)，或者聚乙烯基吡咯烷(DSG3P)；和(c)糖类或者其他的这种碳水化合物，例如山梨糖醇或者葡萄糖(一般范围是在大约1％-20％，优选大约5％-15％，更优选大约5％-10％)。
为了给药，冻干粉剂与适当的可药用的载体，例如磷酸盐缓冲盐水混合(一般制成单剂量或多剂量的制剂，大约100-500mg，优选250mg)。
在其他优选的具体实施方式
中，制剂被设计成用于非肠道给药的形式，该组合物包含一种和多种磷酸氢二钠或者钠盐，优选钠盐，一种或多种化学式I的磺酰胺化合物的盐类；缓冲剂，例如磷酸钠或者磷酸钾，或者柠檬酸盐；和糖类，例如山梨糖醇或者葡萄糖。在此详细描述的优选的具体实施方式
中，制剂包含一种和多种化学式I的磺酰胺化合物的钠盐；磷酸钠缓冲剂；和葡萄糖。葡萄糖可以以无菌葡萄糖溶液的形式添加，这种溶液可以很容易地从本领域技术人员已知的厂商那里得到。
E.鉴定肽的方法本发明涉及肽的鉴定和对肽诱导自身免疫反应或者引起自体免疫疾病的能力进行评价的方法。特别是本发明涉及方法(1)当自身表位或者自身抗原未知时，对自身肽与自身免疫疾病可能的关系进行估计，和(2)对外源肽与自身免疫疾病病因可能的联系进行估计。本发明还涉及通过本发明的方法确定出和代表与寻常型天疱疮相关的自身抗原的特定的肽。
该方法依靠的是氨基酸序列基序的改进，该基序可以与可能的自身表位相比较。每种基序描述了氨基酸序列的有限集合，其中在每个(相对的)位置上的残基可以(a)被限制到单个残基，(b)被允许在限制的成套的残基中变化，或(c)被允许在所有可能的残基中变化。为了公开中的一致性，除了没有以任何方式限制本发明，这些基序将以用字符串来表示，其中(a)限制到单个残基的位置将以该残基的单字母缩写表示，(b)允许在成套的残基中变化的位置将以成行的那些残基的单字母缩写来表示，和(c)允许在所有氨基酸残基中变化的位置将以“X”来表示。仅仅作为一个实施例，基序可以列举为第一个位置的残基可以是缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，或者苯基丙氨酸残基中的任何一个；第二个位置的残基必须是组氨酸；第三个位置的残基可能是任何一种氨基酸残基；第四个位置的残基可能是缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸或者色氨酸残基中的任何一个；而第五个位置的残基必须是赖氨酸。
本发明一个方面是通过对主要组织相容性复合体HLA-DR蛋白的结合结构域或者结合口袋，和/或T细胞受体(“TCR”)的与MHC分子结合的表位接触点的分析揭露了基序。通过提供的涉及形成MHC结合口袋的HLA-DR残基的详述的结构分析，人们能够对与任何HLA-DR蛋白结合的基序进行预测。
本发明另一个方面是当自身抗原已知或者可疑时，可以用通过在此披露的方法揭示的基序来确定涉及自身免疫反应的自身肽的表位。
本发明的另一个方面是提供了确定与自身免疫疾病相关的外源肽表位的方法。这些方法包括利用MHC和/或TCR结合基序来确定源自确定种类的可能引发人自身免疫反应的生物体或者病原体的肽。在这方面，可以根据本发明的方法或者其他的本领域已知的方法来揭示该基序。
利用这些基序作为检索，估价，或者设计准则，人们能够鉴定出具有与特定的MHC分子结合并与T细胞受体相互作用诱导T细胞和/或自身免疫反应的合理可能性的肽的种类。与纯的同源序列(排除了许多抗原性相似但序列不十分清楚的肽)或者用无限制的“保守”替换的同源序列(包含了许多在关键的保守位置不同的肽)相反，在本领域的普通技术人员估计可能与自身免疫疾病相关的特殊的肽并对肽序列数据库进行电脑搜索以确定可能涉及自身免疫反应的自身肽时，这些基序的使用表现出显著的进步。另外，利用MHC和/或TCR结合基序在有限的数据库中搜索可能涉及自身免疫疾病病原学的自身肽是一个含结合基序概念的新的应用。
以下提供了实施本发明的详细实施例。现在本发明的方法已经被用来鉴定以前未知的涉及自身免疫疾病寻常型天疱疮的自身肽表位。
因此，在另一个具体实施方式
中，本发明以分离的形式提供了这些肽，可以用在以下提到的各种诊断治疗的方法和产品中。
1.利用基序鉴定自身表位数量不断增加的自身免疫疾病现在都与MHC II类HLA-DR基因座特定的等位基因有关。对于大部分的自身免疫疾病，自身表位仍然是未知的。然而对于某些自身免疫疾病，涉及自身免疫反应的自身蛋白是已知的或者是可疑的。
本发明的一个方面是提供了鉴定涉及与HLA-DR等位基因相关的自身免疫疾病的自身表位的方法。也就是说，通过人的肽序列与本发明基序的比较，人们能够鉴定出那些最有可能是与疾病相关的自身表位的肽。
该方法可以应用于任何已知与特定的HLA DR等位基因相关联的自身免疫疾病，而且这些疾病中形成适于那些等位基因MHC的结合口袋(或者至少两个主要的口袋)的氨基酸残基是已知的。根据在此论述的方法，人们可以由此开发出一种或多种用于与疾病相关的HLA-DR蛋白的基序。当然，如果疾病是与两个或更多的等位基因相关，那么可能会开发出用于两个或更多的HLA DR蛋白的基序，特别是利用这些基序每个位置的共用残基可以开发出一个共有基序。
然后将由此开发的基序与人肽序列适当的集合相比较。人类肽序列可以包括所有已知的人类序列或者可以限制在对本领域普通技术人员来说很明显的范围里。例如，如果疾病仅限于特定的组织，那么检索可以限制在从那些组织发现的肽中。反之，如果在未受影响的组织也发现了这种肽，那么可以从检索的范围内将其排除掉。最极端的情况是，自身抗原已知或者可疑，而具体的表位是未知的，那么检索可以限制在自身抗原序列范围内(参见实施例1)。
这些方法可以用来鉴定一组与基序匹配而且很可能是自身表位的肽。通过改变基序所限制的位置的数目，和/或每个位置限制的程度，和/或检索范围的大小，这组肽中肽的数目很可能同样发生变化。如上所述，至少两个MHC接触位点(例如，P1和P4)应该是被限制的。根据在生成的这组肽的数目，在不同程度上限制的基序可被用来缩小或扩大这组肽的数目。当然，生成的这组的大小要根据方法使用者随后的意图。
一旦确定出这组肽，可选择对这些肽进行活性筛选。上述筛选方式的选择是使用者考虑的，不在本发明的范围内。无论如何，优选的筛选方法包括诱导自身反应T细胞增殖，或者诱导淋巴细胞活素(细胞活素)从这些T细胞中分泌，或者诱导其他的效应功能例如细胞毒性的能力的体外测试。在一些情况下，可以进行适当的人的体内试验，以及在其他的情况下可以利用人类疾病的动物模型。
2.鉴定与人类自身免疫疾病相关的外源表位如在背景部分提到的，流行病学证据已经暗示许多的细菌和病毒病原体可能涉及人类自身免疫疾病，并且在很多著作中都充满分子模拟的构思(Oldstone的综述，1990)。起初的目的是鉴定涉及人类自身免疫疾病特定的外源表位，可是这要取决于序列与已知的人类表位的相似性。迄今为止结果令人失望，没有病原体或者来源于病原体的肽被证明是人类自身免疫疾病的主因。
因此，本发明的另一个方面是提供了一种鉴定与人类自身免疫疾病相关的外源肽表位的方法。也就是说，首次提供了一种鉴定这种外源表位的方法，该方法利用基序鉴定最有可能是涉及人类自身免疫疾病病原的外源肽。
该方法可应用于任何已知与特殊的MHC蛋白相关联的自身免疫疾病，或者(1)通过已有技术的方法已经披露基序或(2)通过本发明的方法可能揭示基序。当自身表位已知或者可疑时，TCR接触残基可以被包括在基序中。如前所述，可以采用一种或多种基序并且组合不同来源的基序开发出共有基序。
然后将由此开发的基序或者基序与来源于人类病原体的肽序列适当的集合相比较。最方便的是利用本领域技术人员可普遍使用的遗传数据库来进行。在最优选的具体实施方式
中，检索限制在以下一个或多个范围内(1)仅仅来自于包括人的细菌或者病毒病原体的序列；(2)排除掉来自正常人的肠内菌丛(例如，大肠杆菌或其他的肠杆菌科)的序列；和(3)根据病原体地区性的或者流行病学的发病率是否与所述的自身免疫疾病发病率正/负相关来确定包括/排除来自病原体的序列。
该方法可以用来鉴定一组与基序匹配而且很可能涉人类疾病的外源的肽。如前所述，在这组肽中肽的数目可以通过利用在不同程度上限制的基序和/或通过改变检索范围来改变。并且，如前所述，随后可以对生成的这组肽进行各种已知的活性筛选。
3.通过本发明的方法鉴定自身和外源表位如下面实施例详细描述的，本发明的方法已经被用于鉴定涉及寻常型天疱疮的桥粒芯糖蛋白3蛋白的自身表位。
每个肽长度为15个残基，部分地是使用计算机数据库搜索程序产生的结果(Genetics Computer Group program“Findpatterns”)，但还是与MHC II类分子的裂缝大小相当。每个肽的第5个位置与抗原的P1残基相对应。这样，跨越MHC II类结合裂缝的P2到P11残基就与这些序列的第3到第15位的残基相对应。对于MHC和TCR结合很重要的P1到P9残基就与第4到第13位的残基相对应。对于MHC和TCR结合最重要的残基，P1到P6就与这些序列的第4到第10位的残基相对应。
有着氨基酸序列如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的Dsg3肽与人类桥粒芯糖蛋白3蛋白的186-204位残基相对应。该肽被提示做为寻常型天疱疮中的自身表位。
这些蛋白的每一种都多种的功效，因此，另一个方面，本发明提供了每种分离形式的这些肽。除序列表和表格中所列的序列以外，本发明还包含了相应于MHC结合区域的这些肽的片段。然而，对于本领域的普通技术人员来说很明显，任何至少包括P1和P4或者至少包括P1和P6或者至少包括P4和P6残基的肽的任何一个片段都可能有功效，也将落在权利要求的内含和外延范围内。特别是，包含这些至少包含如上所述MHC结合和TCR接触残基的较长的肽也被考虑为等同物。
这些肽的生产方式无关紧要，可以从它们的天然来源中分离和纯化得到或者合成产生。由于它们的长度相对较短，所以目前考虑应该通过合成来制备。这些肽的分离，纯化和合成的方法在本领域中为大家所熟知，在此无须列举。
本发明的肽可以用于体外化验，有助于寻常型天疱疮的诊断和分类。例如，如同下面的实施例中的或者通过其他已知的分析，可以对患有PV的病人的自身反应T细胞进行这些肽活性的检测。在天疱疮情况下，通过特殊的桥粒芯糖蛋白3表位，这些肽能够或者不能够引起T细胞的增殖会使诊断更简练。也可以在疾病初起之前利用对这些肽的免疫反应作为易感性或者倾向性的指标，不过应该小心以免引发自身抗原(autoantigenic)反应。
F.利用本发明鉴定的肽的产品和方法本发明还提供了利用其他的可以由本发明的方法鉴定的肽的产品和方法。这些肽以及上面披露的那些可以用在下面的每种具体实施方式
中。
本发明的肽可用于通过用这些肽使动物(例如，小鼠，兔子，非人类灵长类动物)免疫而开发动物模型。不但可以表现出对肽的反应，而且还能显现出与人体病理学相当的自身免疫疾病的动物很明显具有作为用于人类疾病研究的模型的用途。表现出对肽的反应但没有显现出任何相应的自身免疫疾病的动物将具有作为实验对象的用途，实验包括选择性的消耗T细胞或者其他的脱敏作用或者耐受形式。
重要的是，这些肽和这些肽的氨基酸类似物将具有作为治疗剂和诊断剂的效用。多肽起源的病原体，病毒或者细菌将具有作为预防接种试剂的效用。这些材料的一些效用实例包含如下。
可以以高剂量施用该肽以产生高剂量耐受性。该耐受处理描述于，例如，PCT专利申请PCT/US93/08456(国际公开号WO 94/06828)。因此，在一套具体实施方式
中，本发明提供了用于使个体对于自身抗原耐受的药物制剂。该制剂可以包含可药用的载体和分离的人的多肽，该多肽包含与人自身免疫病相关的HLA-DR的基序相当的氨基酸序列。这些多肽能够与HLA-DR蛋白结合形成一种激活患有自身免疫病患者的自身反应的T细胞的复合体。通过在此披露的或者提供本方面方法鉴定肽的利用，这样的药物可用于抵抗自身免疫反应。对人类自身免疫疾病这种耐受的利用是本领域已知的，在此无须作详细说明。已经使用过胶原蛋白用于类风湿性关节炎和髓鞘碱性蛋白用于多发性脑硬化的耐受剂量。因此本发明特别地不包含这些蛋白质。但是，其他的肽现在可以用本方法鉴定并且同样可用于治疗自身免疫疾病。
在
具体实施例方式
中，所提供的药物制剂中含有的HLA-DR蛋白是HLA-DR4蛋白，而自身免疫疾病是寻常型天疱疮。另外，利用Dsg3基序#1或者基序#2，提供了含有带这种基序的肽的药物。在最优选的具体实施方式
中，药物中包含SEQ ID NO1的多肽，因此，还提供了使个体对寻常型天疱疮自身抗原耐受的的方法。
在类似的一套具体实施方式
中，本发明提供了用在对涉及人类自身免疫疾病的人类病原体抗原耐受的个体的药物制剂。该制剂包含可药用的载体和分离的人类病原体多肽，该多肽包含与人自身免疫病相关的HLA-DR的基序相当的氨基酸序列。这些多肽能够与HLA-DR蛋白结合形成一种激活患有自身免疫病患者的自身反应的T细胞的复合体。因此，耐受的个体对这些与自身抗原可交叉反应的的抗原T细胞表现出的将是无反应或者无变应性(anergized)，从而将给予个体对这种疾病的防护。
在另一套具体实施方式
中，提供了用于针对涉及自身免疫病病原的人类病原体进行接种的药物。这些药物制剂包含可药用的载体和针对人病原体有效免疫的免疫原性制剂。该人类病原体是一种在其天然的形式中包含对于自身免疫病相关的HLA-DR来说相当于基序的氨基酸序列的多肽的病原体。这些多肽能够与HLA-DR蛋白结合形成一种激活成为自身反应T细胞的复合体并引发自身免疫病。但是本发明的制剂特别不包含这样的多肽，相反地包含来自病原体的其他的抗原。也就是说，如果已知TCR自身表位的触点，那么制备的疫苗特别地没有包含与用于HLA-DR蛋白的基序对应的多肽。因为病原体呈现一种抗原决定簇很宽泛的排列，所以可以排除那些与相关基序对应的那些抗原决定簇，制备对该病原体有效但不包含涉及自身免疫反应的肽的疫苗。
这种没有与本发明的基序相当的肽的疫苗本领域的普通技术人员可以用任何适当的方法来制备。例如，在制备流感疫苗时，可以将流感病毒的肽序列与根据本发明揭示的基序相比较。排除带有基序(例如利用病毒的片段)的蛋白然后再制备疫苗，或者可以利用重组技术制备病毒，其中改变与基序相当的序列使之与基序不匹配。在优选的具体实施方式
中，改变的残基是TCR接触残基，尤其优选改变TCR接触残基电荷。只利用，例如缺乏与人类自身免疫疾病相关的基序的细菌的一部分(例如细菌表面蛋白质或者膜相关蛋白)，或者，再次通过遗传改变疫苗细菌使残基发生变化，可以开发出类似的用于细菌性病原体的疫苗。
创造这种疫苗所考虑的基序可以在若干范围内进行挑选。如果疫苗直接作用的病原体与自身免疫疾病相关，那么可以根据在此描述的用于与该疾病有关的HLA-DR蛋白的方法来开发基序。如果还有已知的或者可疑的自身抗原，那么基序可以包含自身表位的TCR接触残基。然后将病原体蛋白的补足部分与基序相比较，以及与基序相当的肽可以从疫苗中排除掉或者可以通过重组修饰来产生没有这种肽的疫苗。或者，可以着眼特定的群体来开发疫苗。对于忍受或者具有发展为特定的自身免疫疾病的危险中的个体，可以开发出特殊的疫苗。在这种情况下，在与自身免疫疾病相关的HLA-DR蛋白的基础上再次挑选基序，以及当自身抗原已知时，那么基序可以基于自身表位的TCR接触残基。
在
具体实施例方式
中，提供了这种疫苗制剂，其中HLA-DR蛋白是HLA-DR4蛋白，而自身免疫疾病是寻常型天疱疮。尤其提供了没有与在此披露的Dsg3基序#1或者基序#2相当的肽的疫苗。疫苗的具体实施方式
包括缺少至少一种披露为SEQ ID NO1的肽的疫苗。因此，还提供了使个体对可能引起寻常型天疱疮的病原体免疫的方法。
同时这些肽在评定病原体在具体病人体内是否可能很重要时将是很有用的。例如，来自某个病人的T细胞可能对这肽的一种或多种响应而增殖，而来自另一个病人的那些T细胞可能对不同的肽或者一组肽响应而增殖。可以合成这些肽的类似物，其中T细胞受体接触残基中的一个是被取代了的。但是，这种类似物不限于通过特定的氨基酸例如丙氨酸来替换这些最初的T细胞受体接触残基。在施用到自身免疫病人身上后，这些肽类似物可用来使自身反应T细胞无变应力(钝化)(参见，例如，Sloan-Lancaster等人，1993和1994)。通过挑选不携带模拟表位的病毒或者细菌菌株，这些病毒或者细菌性病原体可能对免疫有用。来自除了携带模拟表位的病原体之外的病原体的蛋白也可被挑选用于免疫。这种治疗可以用于预防再次感染，因此可以减轻疾病或者在特别易感的人群中(最明显的实施例是病人的无病同卵双生者)预防最初的感染。
实施例实施例1寻常型天疱疮自身表位的鉴定如上所述，在不同的种族群中，寻常型天疱疮(PV)或者与DR4等位基因(DRB1*0402)或者与稀少的DQ1等位基因(DQB1*05032)相关；仅仅一小部分的PV病人不具有上述任一种易感的基因(Ahmed等人，1991；Ahmed等人，1990；Scharf等人，1988)。PV相关分子在关键位点(β71)带有一个负电荷(Glu)；相邻位置(β70)也是带负电荷的。与PV相关的DR4亚型是唯一一个在DRβ71带有负电荷的(在与RA相关的DR4分子中，在DRβ71发现的是正电荷(Arg))。尽管是多态的，P7口袋残基DRβ67(Leu/Ile)好象是不涉及肽的结合，大概仅仅起到TCR接触残基的作用(Stern等人，1994)。
因此在DRβ71多态的的残基的电荷可以解释对两种不同的与结构上类似的DR4亚型相关的自身免疫综合症的易感性与对类风湿性关节炎的易感性相关的DR4等位基因在DRβ71带正电荷(Arg)，而与寻常型天疱疮相关的DR4等位基因在DRβ71带负电荷(Glu)。因此挑选的用于任何一个DR4分子的肽在P4位置上它们的电荷可能显著差异在P4带有负电荷的肽预期与RA相关分子结合，但不与天疱疮相关的DR4分子结合；相反，预期天疱疮的肽在位置4是正电荷。由于这些分子的保守特性，对这些DR4亚型来说将不会预期其他的肽锚定残基(P1和P6)是不同的。
根据在此披露的方法开发用于选择性与HLA-DR的DRB1*0402蛋白结合的基序。涉及形成这些等位基因的P1口袋的β链的残基是β85(Val)，β86(Val)，β89(Phe)和β90(Thr)。因此，在β86位有Val(而不是在DRB1*0101中的Gly)提示基序的P1位置只限于V，L，I，M和F。丙氨酸也已经包括其中，但不是在本实施例中。P6口袋的形成部分地是通过DRB1*0402蛋白的β11(Val)和β13(His)。相对于DRB1*0101等位基因，其中的这些残基分别是Leu和Phe，DRB1*0402蛋白的P6口袋稍微大一些而且极性更强。因此，对于基序的P6位置，可以是S，T，N，和V。最后，该DR蛋白的P4口袋的形成部分地是通过残基β13(His)，β70(Asp)，β71(Glu)，β74(Ala)和β78(Tyr)。如上所述，作为β70和β71的两个带负电荷的残基产生对带正电荷的抗原残基的偏好，因此基序的P4位置限于K和R。
因此，对于寻常型天疱疮自身抗原基序定为位置P1 P2 P3 P4 P5 P6PV基序#1L N S K I A(SEQ ID NO2)PV基序#2I A F K I V(SEQ ID NO3)尽管寻常型天疱疮的自身抗原是已知的，但自身抗原内精确的表位以前仍然是未知的。但是，利用本发明方法，已经能够鉴定出可能作为自身抗原决定簇的肽的小集合。寻常型天疱疮的目标抗原是一种钙粘着蛋白家族的上皮细胞粘着分子，桥粒芯糖蛋白3(Amagai等人，1991)。桥粒芯糖蛋白3介导角化细胞之间Ca++依赖的粘着；自身抗体防碍了细胞粘着，结果皮肤起泡(Takeichi，1990)。自身抗体被认为发病因素，因为短暂的水疱疾病在新生儿中也发现过，是由于母亲的免疫球蛋白转移到胎儿体内而受到母亲的影响。将血清或者桥粒芯糖蛋白3特殊抗体的转移到小鼠也产生皮肤棘层松解(Amagai等人，1992)。
本发明与HLA-DR蛋白质有关的基序可以更进一步。在不同的种族群中，PV与稀少的DQ1亚型(DQB1*05032)相关，这些亚型与普通的DQ 1亚型仅仅在DQβ链的位置57上有所不同(Sinha，等人，1988)。在PV相关的分子中，DQβ57是带负电荷的(Asp)而在普通的DQ1亚型中则不是。在DQβ链上同样的位置还涉及对糖尿病的易感性。但是，在糖尿病中，情况又反过来了与对糖尿病的易感性有关的DQ2和DQ8分子在DQβ57不带负电荷(Todd等人，1987)。
在这些观察的基础上，明朗化的是MHC II类的β链的两个多态的位置(DRβ的位置71和DQβ的位置57)对于肽选择性结合和自身免疫的进程是很关键的。根据如上所述的准则，预期糖尿病相关的肽在位置P9带负电荷，因为这种肽仅仅与在DQβ57不带同样的电荷的DQ分子结合。相反，对于天疱疮与DQ1相关的情况，可以挑选在P9带正电荷的肽用于与疾病相关的在DQβ57带负电荷的分子。在DR4相关的自身免疫的情况下，在肽位置4的电荷给予疾病相关的DR4分子以选择性RA肽在P4带负电荷，PV肽在P4带正电荷。因此，可以证明用于选择性肽结合的基序在引发人类自身免疫疾病的关键表位的鉴定中是非常有用的。希望这种方法不仅在PV，RA或者糖尿病的肽鉴定中有用，对于其他的自身免疫疾病也是有用的，这些疾病中对肽的结合起决定性的作用的残基是与疾病易感性相关的。
IV.等同物本领域的技术人员仅仅利用常规的试验就可以得出，或者能够确定许多与本发明在此描述的特殊的具体实施方式
等同的方法。这些等同物将包括在权利要求中。
所有在此引用的参考文献和出版物在此一并全文引用。
实施例以下实施例是用来进一步举例说明本发明的某些具体实施方式
，但并不是打算限制本发明的范围。
实施例ISEQ ID NO1的肽片段的制备片段1，Ac-Glu(OtBu)-Pro-Asn(Trt)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Ile-AIa-OH，(氨基酸1-10)是利用Fmoc策略通过固相肽合成(SPPS)方法制备的。SPPS是基于将拥有适当侧链防护的Fmoc氨基酸衍生物相继添加到不溶的聚合支撑物上。碱不稳定的Fmoc基团用来进行N-α-防护。用于片段1合成的聚合支撑物是过酸(superacid)不稳定的HMPB树脂，该树脂通过Fmoc-Ala以它的羧基与树脂结合在一起而制备。用哌啶除去Fmoc基团后，用2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基uronium四氟硼酸盐(TBTU)作为偶联试剂将下一个Fmoc-氨基酸添加上。通过过程控制的三硝基苯磺酸测试(TNBS)进行反应监控。当Fmoc-氨基酸偶联完全时，通过过滤除去过量的氨基酸衍生物和偶联试剂。最后用N-甲基吡咯烷酮(NMP)和2-丙醇彻底洗涤树脂。继续重复该过程直到每个想要的氨基酸衍生物都被偶联上。最后，用乙酸酐和吡啶对肽进行乙酰化。用稀释的三氟乙酸(TFA)将产生的肽从树脂上裂解下从而制备出粗片段1。用急速层析法纯化后，对片段1进行纯度的计算。
实施例IISEQ ID NO1的肽片段2的制备利用Fmoc-策略通过固相肽合成法(SPPS)制备片段2，H-Phe-Lys(Boc)-Ile-Val-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(tBu)-Pro-Ala-OtBu，(氨基酸11-19)。SPPS是基于将拥有适当侧链防护的Fmoc氨基酸衍生物相继添加到不溶的聚合支撑物上。碱基不稳定的Fmoc基团用来进行N-α-防护。用于片段2合成的聚合支撑物是过酸不稳定的HMPB树脂，该树脂通过Fmoc-Ala以它的羧基与树脂结合在一起而制备。用哌啶除去Fmoc基团后，用TBTU作为偶联试剂将下一个Fmoc-氨基酸添加上。通过过程控制的(TNBS)测试进行反应监控。当Fmoc-氨基酸偶联完全时，通过过滤除去过量的氨基酸衍生物合偶联试剂。最后用NMP和2-丙醇彻底洗涤树脂。继续重复该过程直到每个想要的氨基酸衍生物都被偶联上。用稀释的TFA将产生的肽从树脂上裂解下，从而制备出被保护的Fmoc-11-19-)H片段。用叔丁基-2，2，2-三氯乙酰亚氨(TBTA)处理该肽以保护C-末端羧基为叔丁基-酯(-OtBu)的形式。然后从二氯甲烷/甲醇中结晶从而纯化酯化的肽。通过急速层析法纯化并干燥后，裂解下Fmoc保护基。从水中结晶得到氨基脱保护的肽，用右旋异丙醚再结晶，干燥后得到片段2。对片段2进行纯度计算。
实施例III
来自片段1和片段2的PI-0824醋酸盐的制备由片段1和2制备药物PI-O824醋酸盐有三个基本步骤。这些步骤是(1)偶联两个片段，(2)脱防护和纯化，和(3)离子交换层析产生醋酸盐，随后对最终的肽进行过滤和干燥。这些步骤概述如下。
1.偶联两个片段产生Ac-1-19OtBu用1-羟基7-氮杂苯并三唑(HOAt)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)作为偶联试剂，在N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液中将两个片段偶合在一起。通过薄层分离法(TLC)监控对整个反应的完全程度进行控制。加入水同时进行搅拌使得产生的肽沉淀下来。过滤沉淀物，再用水和乙腈洗涤，最后干燥。利用高压液相色谱法(HPLC)检测纯度。
2.脱保护和纯化用TFA/H2O除去保护基。在二异丙醚中进行沉淀后，过滤该肽，用二异丙醚洗涤并进行干燥，得到粗肽x2TFA。
通过制备性HPLC由粗肽x2TFA得到其想要的纯度。通过过程的HPLC监控对级分进行纯度检测，合并并冻干从而得到纯的肽TFA盐。用HPLC检测冻干的纯肽TFA盐的纯度。
3.肽的醋酸盐用OH形式的强阳离子交换树脂(Merck离子交换剂III)通过醋酸盐以来进行三氟醋酸盐反离子置换后，在清洁的环境中过滤(0.2μm)肽并冻干。包装最后的药物物质，肽的醋酸盐并通过质量管理进行释放检测。
实施例IV本发明的肽是桥粒芯糖蛋白3分子的一部分(残基186-204)。肽的N-末端是乙酰化的，而且该肽以醋酸盐形式分离。该肽醋酸盐的分子量为2,163道尔顿。
在液相中将10个和9个氨基酸的两个肽片段(片段1和片段2)偶联来制备该肽。利用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)策略通过标准的Merrifield固相多肽合成方法合成肽片段。两个片段偶联和脱保护后，用反相高压液相色谱(HPLC)纯化粗肽。释放检测包括外观，同一性，肽含量和纯度，溶解度，乙酸含量，水分含量，有机溶剂残留和三氟乙酸含量。
药物产品的配制是添加3％的甘露糖醇和20mM的柠檬酸钠/柠檬酸，得到含总肽0.5％的溶液。配制好的肽用过滤方法消毒，无菌条件下填装并冻干。每小瓶含50mg的肽醋酸盐。用于注射时，冻干制品用水或者5％的葡萄糖和或0.01-5％的表面活性剂重新溶解，产生的肽的终浓度为5mg/ml，pH6.3±0.5。对病人施用的组合物的分析包括重新溶解前后的外观，水分含量，顶部空间的氧气(oxygen headspace)，肽含量和纯度，渗透压，pH，细菌内毒素和无菌度。
实施例V本发明优选的具体实施方式
是稳定性增加的多肽制剂。给出了2-8℃(表1)和30℃(表2)时的稳定性数据。
表12-8℃时的稳定性
表230℃时的稳定性
实施例VI本发明的多肽包括优选的具体实施方式
。在一个具体实施方式
中，组合物进一步含有该多肽的可药用的盐。更优选的是，该可药用的盐是醋酸盐。在进一步的具体实施方式
中，该组合物进一步含有糖类，例如葡萄糖或者甘露糖醇。在进一步的具体实施方式
中，该组合物进一步含有缓冲剂，例如无水柠檬酸钠，或者柠檬酸一水化物。在进一步的具体实施方式
中，该组合物进一步含有稳定剂和/或填充剂例如甘露糖醇。
一个
具体实施例方式
中，组合物含有冻干的SEQ ID NO1的多肽。在一个具体实施方式
中，该冻干的多肽再次溶解的时间小于15分钟，更优选该再次溶解的时间小于10分钟，更优选该再次溶解的时间小于5分钟，而更优选该再次溶解的时间小于3分钟。
在一个
具体实施例方式
中，肽的纯度大于90％，更优选，纯度大于93％，更优选，纯度大于95％，而更优选纯度大于96％。
在一个
具体实施例方式
中，组合物带有的细菌内毒素污染物小于大约5EU/mL，更优选，细菌内毒素污染物小于大约3EU/mL，更优选，细菌内毒素污染物小于大约2EU/mL，而更优选，细菌内毒素污染物小于大约1.25EU/mL。
本发明的组合物更优选的成分如表3所示。
表3优选的组合物成分
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序列表<110>肽免疫公司(PEPTIMMUNE，INC)<120>与自身免疫疾病相关的自身和非-自身抗原的识别(Identification of self andnon-self antigens implicated in autoimmune disease)<130>SCT064313-47<150>US 10/799,005<151>2004-03-11<160>3<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>来源于人类桥粒芯糖蛋白3蛋白的多肽<400>1Glu Pro Asn His Leu Asn Ser Lys Ile Ala Phe Lys Ile Val Ser Gln1 5 10 15Glu Pro Ala<210>2<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>用于寻常型天疱疮自身抗原的基序<400>2Leu Asn Ser Lys Ile Ala1 5<210>3<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>用于寻常型天疱疮自身抗原的基序<400>3Ile Ala Phe Lys Ile Val1权利要求
1.一种基本上由SEQ ID NO1所代表的氨基酸序列组成的分离的多肽。
2.一种含有可药用的载体和权利要求1的多肽的组合物。
3.权利要求2的组合物，含有多肽的可药用的盐。
4.权利要求3的组合物，其中可药用的盐是醋酸盐。
5.权利要求2的组合物，进一步含有选自糖类和表面活性剂的可药用的添加剂。
6.权利要求2的组合物，进一步含有缓冲剂和填充剂。
7.权利要求5的组合物，其中糖类是葡萄糖或者甘露糖醇。
8.权利要求7的组合物，其中组合物以大约5％的葡萄糖配制用于给药。
9.权利要求5的组合物，其中表面活性剂选自吐温20和吐温80。
10.权利要求9的组合物，其中组合物是以大约0.01％到大约5％的表面活性剂来配制的。
11.权利要求2-10任一项的组合物，其中组合物是免疫原性组合物。
12.权利要求1的分离的多肽，其中的多肽在其N-末端有乙酰基帽子，在其C-末端有酰胺帽子，或者两种都有。
13.权利要求2的组合物，其中的多肽在其N-末端有乙酰基帽子，在其C-末端有酰胺帽子，或者两种都有。
全文摘要
本发明提供了与自身免疫疾病寻常型天疱疮相关的分离的肽。与寻常型天疱疮相关的肽是来源于涉及到疾病的病原学和疾病缓解的人类病原体的自身表位。还提供用于使个体耐受和/或免疫的药物制剂以及相关的方法。提供了用于鉴定其他涉及人类自身免疫疾病和类似的药物制剂的自身和非自身表位的方法，还提供了利用这些表位的方法。
文档编号C07K14/47GK1942202SQ200580010968
公开日2007年4月4日 申请日期2005年3月10日 优先权日2004年3月11日
发明者詹姆斯·拉斯穆森 申请人:肽免疫公司