一种植物抗病性蛋白及其编码基因与应用的制作方法

专利名称：一种植物抗病性蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物抗病性蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
植物与各种潜在的病原微生物在自然界共存，这些微生物包括真菌、细菌、线虫和病毒等等，在长期共进化过程中植物形成了对病原微生物精细的信号感知和防御机制。先天免疫是植物对抗病原菌侵染的重要防御方式，根据植物抗性反应的不同，先天免疫可以分为基础抗性和抗病基因介导的抗性两类，这两类抗性虽然有明显的差异，但有可能共享一些共同的分子机制。基础抗性是指植物的模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)识别多种病原菌共有的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，然后通过MAPK(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)或其它信号途径启动防卫反应。抗病基因介导的抗性模式最初是由Flor在对亚麻锈病的抗病性进行遗传分析时提出的，假定不同的病原菌小种携带不同的无毒基因，植物的抗病基因产物识别特定病原菌的无毒基因产物，并通过信号传导启动防卫反应，这种模式能很好地解释农业生产上作物不同品种的抗病性差异，并能指导育种过程中将抗病品种的抗病基因转入感病品种以获得抗性。正因为如此，几十年来对抗病基因介导的抗性进行了大量的研究，目前已经克隆了很多来自不同植物的抗病基因，根据它们蛋白的结构特点主要可以分为5类，其中Nucleotide Binding Site-Leucine Rich Repeat(NBS-LRR)是最大的一类抗病基因家族，而且到目前为止发现NBS-LRR基因主要与抗病功能相关，因此NBS-LRR蛋白有可能是植物免疫系统的核心组分。
到目前为止已经从水稻中克隆了6个抗白叶枯病基因和6个抗稻瘟病基因，6个抗白叶枯病基因分别为Xa21、Xa1、Xa26、xa5、Xa27和xa13，其中只有Xa1属于NBS-LRR基因家族，Xa21和Xa26都属于受体类似激酶家族，而xa5、xa13和Xa27是特殊结构的抗病基因，不能归类到典型的5类抗病基因中；6个抗稻瘟病基因分别为Pib、Pita、Pi9、Pid2、Pi2和Pizt，它们来自4个不同的位点，其中Pi9、Pi2和Pizt是同一个基因位点的不同等位基因。除了Pid2编码一个丝苏氨酸受体类似激酶，其它5个抗稻瘟病基因全部都属于NBS-LRR基因家族，另外这6个已克隆的抗稻瘟病基因中除了Pi9来源于小粒野生稻，其它5个基因都来源于籼稻。从目前克隆的水稻抗病基因来看，抗白叶枯病基因分属多个不同类别，而抗稻瘟病基因主要是NBS-LRR基因。
水稻分为籼、粳两个亚种，位于北温带的日本和朝鲜半岛主要种植粳稻，位于热带的东南亚和南亚国家，如印度、菲律宾、印度尼西亚、泰国等主要种植籼稻，中国的长江流域被认为是水稻的主要发源地，中国的北方稻区主要种植粳稻而南方稻区主要种植籼稻。凌忠专等利用7个日本代表菌系对中国的水稻品种进行抗病基因分析，发现可以推断中国北方大部分粳稻品种的基因型，但很难确定中国南方籼稻品种的基因型，其中中国南方的许多感病的籼稻品种对所有7个菌系全部表现抗病，这说明来自日本粳稻种植区的菌系不能侵染中国南方的籼稻品种。另外对籼稻品种的抗稻瘟病基因进行遗传分析也显示，与大部分粳稻品种相比多数籼稻品种所含的抗稻瘟病基因更加复杂，通常需要构建近等基因系或重组自交系才能进行基因定位。在我们实验室利用分别来自中国北方粳稻区和南方籼稻区的稻瘟病菌对籼粳稻栽培品种进行接菌鉴定的实验也表明，在北京的条件下，多数籼稻的抗性明显好于北方的粳稻品种。我们对籼、粳稻品种对来自不同地区的稻瘟病菌的抗性分析还发现，多数籼稻品种对粳稻区菌的抗性要好于对籼稻区菌，而多数粳稻品种对籼稻区菌的抗性要好于对粳稻区菌。郝中娜等在中国南方的浙江地区做过类似分析，也得到了同样的结论。这说明大部分籼、粳稻品种对不同生态区的稻瘟病菌的抗性存在差异。
随着对籼稻93-11和粳稻日本晴全基因组的测序进展，多个研究组对水稻全基因组编码的NBS-LRR基因进行了分析，结果显示水稻基因组编码了近500个NBS-LRR基因，大约占水稻整个基因组编码基因的1％，与拟南芥基因组中所占的比例接近。拟南芥Col-0的基因组编码了149个NBS-LRR基因，根据由它们编码的蛋白N端结构的不同，可将拟南芥的NBS-LRR基因分成含有Toll/Interliukin-1受体类似结构的TNL(TIR-NBS-LRR)和含有Coiled-coil结构的CNL(CC-NBS-LRR)两大类。比较水稻与拟南芥的NBS-LRR基因，最大的差异在于水稻没有TNL类基因，而在拟南芥中TNL类基因占大多数，水稻NBS-LRR基因中的大部分在N端编码未知的结构，部分基因在N端编码了Coiled-coil结构。此外，在水稻的NBS-LRR基因编码的蛋白的亮氨酸重复区有较大的变异，其大小可以从350到700个氨基酸不等；虽然整个区域是富含亮氨酸的，但大部分的亮氨酸重复结构都不完整，没有清晰可辩的重复单元。
稻瘟病是水稻的重要病害，在水稻种植区流行时严重影响产量，造成经济损失。利用水稻自身的抗病基因是经济有效的防止稻瘟病流行的方法，并且能克服使用化学杀菌剂带来的环境危害。目前已经有多个抗稻瘟病基因在农业生产上得到成功利用，但是单一抗病基因的大面积推广往往对致病的稻瘟病菌造成选择，而致病菌的流行导致抗病品种在几年内感病化，因此提供新的抗源、克隆新抗稻瘟病基因对水稻抗病育种非常重要。

发明内容
本发明的目的是提供一种植物抗病性蛋白及其编码基因与应用。
本发明所提供的植物抗病性蛋白，名称为PID3，来源于水稻属水稻(Oryzasativa var.Lansheng)，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列3的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗病相关功能的由(a)衍生的蛋白质。
其中，序列表中的序列3由924个氨基酸残基组成。自序列表中序列3的氨基酸第158-466位氨基酸编码了NBS结构域，其中包含四个保守的motif，它们的序列分别为GMGGIGKTA(自序列表中序列3的氨基酸第202-210位氨基酸)、KRYVLVLDDVW(自序列表中序列3的氨基酸第280-290位氨基酸)、IGRIILTSRNYDV(自序列表中序列3的氨基酸第307-319位氨基酸)、GLPIAI(自序列表中序列3的氨基酸第373-378位氨基酸)，这四个保守的motif分别代表kinase 1a(p-loop)、kinase 2、kinase 3a和GLPL motif；蛋白的C端预测了13个LRR重复单元，其氨基酸序列分别是PNVSSLHSLPKSVKLLSVLDLTDSSVDRLP(自序列表中序列3的氨基酸第565-594位氨基酸)、KEVFGLFNLRFLGLRRTKISKLP(自序列表中序列3的氨基酸第595-617位氨基酸)、SSIGRLKNLLVLDAWKCKIVKLP(自序列表中序列3的氨基酸第618-640位氨基酸)、LAITKLQKLTHLIVTSKAVVVSKQFVPSVGVPAP(自序列表中序列3的氨基酸第641-674位氨基酸)、LRICSMTTLQTLLLMEASS(自序列表中序列3的氨基酸第675-693位氨基酸)、QMVHHLGSLVELRTFRISKVRSCHCE(自序列表中序列3的氨基酸第694-719位氨基酸)、QLFMAITNMIHLTRLGIQADSSQEV(自序列表中序列3的氨基酸第720-744位氨基酸)、LHLESLKPPPLLQKLFLQGTLSHESL(自序列表中序列3的氨基酸第745-770位氨基酸)、PHFVSVSNLNNLTFLRLAGSRIDE(自序列表中序列3的氨基酸第771-794位氨基酸)、NAFLNLEGLQQLVKLQLYDAFDGMNIY(自序列表中序列3的氨基酸第795-821位氨基酸)、FHENSFPKLRILKIWGAPHLNEIKMTK(自序列表中序列3的氨基酸第822-848位氨基酸)、GAVASLTHLKFLLCPNLKQLP(自序列表中序列3的氨基酸第849-869位氨基酸)、CGIEHVRTLEELTLDHTAEELVDRV(自序列表中序列3的氨基酸第870-894位氨基酸)；另外在NBS结构域与LRR区域之间有保守的MHD motifMHDILRV(自序列表中序列3的氨基酸第502-508位氨基酸)和NBS LRR linker motifEQNFCIVVNHS(自序列表中序列3的氨基酸第516-526位氨基酸)。
为了使(a)中的PID3分泌到细胞周质或培养基中或使其功能稳定，可在由序列表中序列3的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端连接上信号肽序列，为了(a)中的PID3便于纯化，可在由序列表中序列3的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列

上述(b)中的PID3可人工合成，也可先合成其编码基因，再按照下述方法进行生物表达得到。上述(b)中的PID3的编码基因可通过将序列表中序列1或序列2的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端连上信号肽的编码序列，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述植物抗病性蛋白的编码基因(pid3)也属于本发明的保护范围。
上述植物抗病性蛋白的基因组基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)编码序列表中序列3所示蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
其中，序列表中序列1是由6235个脱氧核苷酸组成，其读码框为自序列1的5’端第3010到第5781位核苷酸。
上述植物抗病性蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中序列2的DNA序列；2)编码序列表中序列3所示蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中序列2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
其中，序列表中序列2是由2969个脱氧核苷酸组成，自3′端的第63-2834位核苷酸为编码序列(ORF)。
上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
含有上述植物抗病基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
本发明所提供的抗稻瘟病基因Pid3可利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将导入植物细胞，获得抗病的或抗病增强的转基因细胞系及转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核昔酸前可加上任何一种一般性启动子、增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物或转基因植物细胞进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记GUS基因、荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。为了转基因植物释放的安全性，在构建植物表达载体时也可不携带任何标记基因，在苗期直接用稻瘟病菌接种进行筛选。
含有本发明Pid3的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等。
本发明的抗病性蛋白及其编码基因可用于培育抗病植物品种，特别是培育抗稻瘟病植物品种；对扩大作物种植范围，提高农作物产量具有重要意义。


图1为Pid3全长cDNA的序列分析图2为Pid3与小麦、大麦、玉米中NBS-LRR蛋白的氨基酸序列比对图3为pCAM-Pid3的结构简4为转pCAM-Pid3 T0代植株对稻瘟病菌株Zhong-10-8-14显示抗性检测结果图5为转pCAM-Pid3植株T1代对Zhong-10-8-14的抗性检测及PCR检测具体实施方式
下述实施例中提到的实验方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、抗病(稻瘟病)性蛋白及其编码基因的获得利用高保真PCR策略，以抗病籼稻品种地谷(购自四川农业大学水稻研究所)基因组DNA为模板，以ACCgaattcCACACATTGTACACCTACGACCAC和ACCgtcgacGAACGACAAGTGCGACATGATTG为引物(分别加入EcoRI和SalI酶切位点，下划线表示加入的酶切位点)，扩增体系为Pfu酶2U，基因组DNA模板0.1μg，10×PCR反应buffer 5微升，浓度为2.5mmol/L的dNTP 2微升，浓度为5μmol/L的上游引物和下游引物各1微升，无菌水补足50微升，PCR反应按如下程序进行预变性94℃ 5min；然后94℃ 45S，56℃ 45S，72℃ 1.45min，共35个循环；最后保温72℃ 10min。扩增得到6235 bp的DNA片段，经测序表明，该片段具有序列表中序列1的核苷酸序列，其读码框为自序列1的5’端第3010到第5781位核苷酸，将该基因命名为Pid3，Pid3编码序列表中序列3的氨基酸序列。
为了得到Pid3的全长cDNA片段，进行了5’RACE、3’RACE和RT-PCR分析。提取水稻幼苗叶片的总RNA，反转录得到第一链cDNA，根据Clontech公司的SMARTTMRACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)试剂盒说明书进行5’RACE和3’RACE扩增Pid3的全长cDNA片段。
5’RACE扩增以试剂盒中提供的5’接头引物，以及CCATCTTGCACATCCTCTTGAGTG为基因特异引物，以上述第一链cDNA为模板，进行5’RACE扩增，扩增体系为Pfu酶2U，模板0.1μg，10×PCR反应buffer 5微升，浓度为2.5mmol/L的dNTP 2微升，浓度为5μmol/L的上游引物和下游引物各1微升，无菌水补足50微升，PCR反应按如下程序进行预变性94℃ 5分钟；然后94℃ 45秒，56℃ 45秒，72℃ 2分钟，重复30个循环；最后72℃ 10分钟。
3’RACE扩增以试剂盒中提供的3’接头引物，以及ACATCTTATTGGAGAAGCAC为基因特异引物，以上述第一链cDNA为模板，进行3’RACE扩增，扩增体系为Pfu酶2U，模板0.1μg，10×PCR反应buffer 5微升，浓度为2.5mmol/L的dNTP 2微升，浓度为5μmol/L的上游引物和下游引物各1微升，无菌水补足50微升，PCR反应按如下程序进行预变性94℃ 5分钟；然后94℃ 45秒，56℃ 45秒，72℃ 2分钟，重复30个循环；最后72℃ 10分钟。
以Pid3基因内的特异上游引物GAAGCTAGCAAGCTATGGCGGAG和下游引物ACGTCACAAATCATTCGCTC，以上述第一链cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增体系为Pfu酶2U，模板0.1μg，10×PCR反应buffer 5微升，浓度为2.5mmol/L的dNTP 2微升，浓度为5μmol/L的上游引物和下游引物各1微升，无菌水补足50微升，PCR反应按如下程序进行预变性94℃ 5分钟；然后94℃ 45秒，56℃ 45秒，72℃ 5分钟，重复30个循环；最后72℃ 10分钟。测序表明以上5’RACE、3’RACE和RT-PCR得到的片段具有序列表中序列2的核苷酸序列。序列表中序列2的核苷酸序列全长2969bp，其转录起始位置在ATG上游第63bp处(序列2的5’端第1位核苷酸)，polyA加尾在TAA下游第135bp处位置(序列2的5’端第2969位核苷酸)(图1)。
其中，序列表中序列1是由6235个脱氧核苷酸组成，其读码框为自序列1的5’端第3010到第5781位碱基；序列表中序列2是由2969个脱氧核苷酸组成，自3′端的第63-2834位核苷酸为编码序列(ORF)。
Pid3及其cDNA序列编码一个non-TIR类的NBS-LRR蛋白，将其命名为PID3；PID3具有序列表中序列3的氨基酸残基序列。
在蛋白结构分析网站SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)和pfam(http://pfam.wustl.edu/)对Pid3的蛋白序列的各个结构域进行分析，结果表明自序列表中序列3的氨基端第158-466位氨基酸编码了NBS结构域，其中包含四个保守的motif，它们的序列为GMGGIGKTA(自序列表中序列3的氨基酸第202-210位氨基酸)、KRYVLVLDDVW(自序列表中序列3的氨基酸第280-290位氨基酸)、IGRIILTSRNYDV(自序列表中序列3的氨基酸第307-319位氨基酸)、GLPIAI(自序列表中序列3的氨基酸第373-378位氨基酸373-378aa)，分别代表kinase 1a(p-loop)、kinase 2、kinase 3a和GLPL motif。对拟南芥基因组编码的NBS-LRR蛋白进行的分析表明在LRR区域有L××L××L××L×L××这样重复的结构单元，但对水稻基因组编码的NBS-LRR蛋白的分析发现LRR重复单元在大小和序列上有较大的变异，很难准确预测重复单元的位置，我们在Pid3蛋白的C端预测了13个LRR重复单元，重复结构不是非常完整，它们的序列分别为PNVSSLHSLPKSVKLLSVLDLTDSSVDRLP(自序列表中序列3的氨基酸第565-594位氨基酸)、KEVFGLFNLRFLGLRRTKISKLP(自序列表中序列3的氨基酸第595-617位氨基酸)、SSIGRLKNLLVLDAWKCKIVKLP(自序列表中序列3的氨基酸第618-640位氨基酸)、LAITKLQKLTHLIVTSKAVVVSKQFVPSVGVPAP(自序列表中序列3的氨基酸第641-674位氨基酸)、LRICSMTTLQTLLLMEASS(自序列表中序列3的氨基酸第675-693位氨基酸)、QMVHHLGSLVELRTFRISKVRSCHCE(自序列表中序列3的氨基酸第694-719位氨基酸)、QLFMAITNMIHLTRLGIQADSSQEV(自序列表中序列3的氨基酸第720-744位氨基酸)、LHLESLKPPPLLQKLFLQGTLSHESL(自序列表中序列3的氨基酸第745-770位氨基酸)、PHFVSVSNLNNLTFLRLAGSRIDE(自序列表中序列3的氨基酸第771-794位氨基酸)、NAFLNLEGLQQLVKLQLYDAFDGMNIY(自序列表中序列3的氨基酸第795-821位氨基酸)、FHENSFPKLRILKIWGAPHLNEIKMTK(自序列表中序列3的氨基酸第822-848位氨基酸)、GAVASLTHLKFLLCPNLKQLP(自序列表中序列3的氨基酸第849-869位氨基酸)、CGIEHVRTLEELTLDHTAEELVDRV(自序列表中序列3的氨基酸第870-894位氨基酸)，与水稻中已经克隆的Pib、Pita和Pi9/Pi2/Pizt的情况类似。另外在NBS结构域与LRR区域之间有保守的MHD motifMHDILRV(自序列表中序列3的氨基酸第502-508位氨基酸)和NBS LRR linker motifEQNFCIVVNHS(自序列表中序列3的氨基酸第516-526位氨基酸)。水稻没有TIR类NBS-LRR蛋白，大部分基因在N端编码未知的结构，部分基因在N端编码了Coiled-coil结构，在PID3的N端有一段保守的motifRSLALSIEDVVD(自序列表中序列3的氨基酸第78-89位氨基酸)，但没有发现Coiled-coil结构，因此Pid3是属于non-TIR类的NBS-LRR基因。
水稻中与Pid3相似性最高的NBS-LRR基因位于第1染色体上，有全长cDNA序列(Kome clone nameJ023059I04，Genbank accession numberAK111827)，两者氨基酸序列相似性67.1％。将Pid3编码的氨基酸序列在NCBI网站做BlastP分析，在小麦、大麦和玉米等作物中都有同源的抗病蛋白，其中Pid3与大麦的HV1LRR1(Genbank accession numberAAD46469)相似性40.5％，与小麦的LRR14和LRR19(Genbank accession numberAAK20742、AAK20736)相似性分别为42.8％和43.5％，与玉米的RXO1(Genbank accession numberAAX31149)相似性32.5％，把Pid3与这几个蛋白的氨基酸序列进行同源比对，如图2所示，虽然它们的氨基酸序列同源性只在40％左右，但蛋白的整体结构非常类似，NBS结构域的保守motif和LRR区域保守亮氨酸的位置都很一致。与水稻中已经克隆的几个抗稻瘟病NBS-LRR蛋白比较，Pid3与Pib(Genbank accession numberAB013449)的相似性只有19.0％，与Pita(Genbank accession numberAF207842)的相似性为20.5％，与Pi9(Genbankaccession numberDQ285630)的相似性为25.4％。
实施例2、抗稻瘟病蛋白及其编码基因Pid3的转基因功能验证为了进一步证实Pid3的抗稻瘟病功能，我们进行了水稻转Pid3基因实验。
利用高保真PCR策略，以抗病籼稻品种地谷基因组DNA为模板，以ACCgaattcCACACATTGTACACCTACGACCAC和ACCgtcgacGAACGACAAGTGCGACATGATTG为引物(分别加入EcoRI和SalI酶切位点，下划线表示加入的酶切位点)，扩增体系为Pfu酶2U，基因组DNA模板0.1μg，10×PCR反应buffer 5微升，浓度为2.5mmol/L的dNTP 2微升，浓度为5μmol/L的上游引物和下游引物各1微升，无菌水补足50微升，PCR反应按如下程序进行预变性94℃ 5分钟；然后94℃ 45秒，56℃ 45秒，72℃ 6分钟，重复30个循环；最后保温72℃ 10分钟。扩增6235bp的DNA片段，经测序表明，该片段为Pid3基因片段，包含Pid3完整的编码区序列，起始密码子ATG上游3010bp的启动子区以及终止密码子TAA下游451bp序列。将PCR扩增得到的片段，用EcoRI和SalI酶切，插入到双元转化载体pCAMBIA1300的EcoRI和SalI酶切位点之间，将经过测序表明含有Pid3基因片段的重组载体命名为pCAM-Pid3(结构简图如图3所示)。将pCAM-Pid3转入农杆菌LBA4404中，然后对水稻感病粳稻品种TP309(该品种对稻瘟病菌Zhong-10-8-14没有抗性)(Chen，X.，Shang，J.，Chen，D.，Lei，C.，Zou，Y.，Zhai，W.，Liu，G.，Xu，J.，Ling，Z.，Cao，G.，et al.(2006).A B-lectin receptor kinase geneconferring rice blast resistance.Plant J 46，794-804)的成熟胚诱导愈伤组织进行农杆菌转化，将转化后的愈伤组织转移到共培养培养基(NB基本培养基+100uM乙酰丁香酮)上于26℃暗培养2天。然后用无菌水彻底洗涤愈伤组织几次，然后将在愈伤组织含噻孢霉素500mg/L的无菌水中120rpm振荡洗涤2小时，洗涤后的愈伤铺在含潮霉素50mg/L的选择培养基(NB基本培养基+2mg/L 2，4-D+500mg/L噻孢霉素+50mg/L潮霉素)上培养3周进行第1次选择。然后转移到新的选择培养基(NB基本培养基+2mg/L 2，4-D+500mg/L噻孢霉素+50mg/L潮霉素)上继续培养2-3周进行第2次选择。将经两次选择培养后生长旺盛的愈伤组织在预分化培养基(NB基本培养基+5mg/L ABA+2mg/L NAA+50mg/L潮霉素)上于26℃暗培养2-3周，然后转移到分化培养基(NB基本培养基+0.5mg/L NAA+1.0mg/L IAA+50mg/L潮霉素，)上持续光照下26℃继续培养2-3周至分化出苗，当再生苗长至10cm高时移植到土壤中，在温室中长至成熟。结果一共得到21个T0代转pCAM-Pid3植株。
利用稻瘟病菌Zhong-10-8-14(Zheng，X.，Chen，X.，Zhang，X.，Lin，Z.，Shang，J.，Xu，J.，Zhai，W.，and Zhu，L.(2004).Isolation and identification of a gene in response to rice blast disease in rice.Plant Mol Biol 54，99-109)孢子悬浮液用喷雾接种的方法对转pCAM-Pid3 T0代植株与水稻品种TP309(对照)进行稻瘟病抗性检测，稻瘟病抗性检测的具体方法为水稻培养至三叶期，用无菌水配置5×104孢子/毫升的Zhong-10-8-14孢子悬浮液，加入0.02％的Tween20，均匀喷雾到稻苗上，于26℃遮光保持100％湿度24小时，然后移到有喷雾装置的25～28℃温室中，一周后进行抗性调查。结果表明与对照品种TP309比较，转pCAM-Pid3 T0代植株获得了对稻瘟病菌株Zhong-10-8-14的抗性，而水稻品种TP309(对照)则表现严重感病(图4，图4中A显示转基因株系15接菌后叶片没有任何病斑出现，图4中B显示对照品种TP309叶片感病病斑)。
T0代转pCAM-Pid3植株自交产生的种子及其长成的植株即为T1代转pCAM-Pid3植株。同样利用稻瘟病菌孢子悬浮液喷雾接种的方法，对100株T1代转pCAM-Pid3植株进行抗性鉴定和转基因分子鉴定，转基因分子鉴定根据转化载体序列设计引物GACGGTGTCGTCCATCACAGTTT和ACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAA进行PCR检测，能扩增495bp的条带即为阳性，部分PCR鉴定和相应植株的抗稻瘟病性鉴定的结果如图5所示，图5中A为稻瘟菌抗性检测结果，图5中B为对应植株的PCR鉴定扩增条带，图5中B中泳道M为分子量标准，泳道4、6、9、13、14均为PCR鉴定阴性的植株的扩增产物电泳结果，其余均为PCR鉴定阳性的植株的扩增产物电泳结果。结果显示所有表现抗性的植株都能扩增495bp的条带，而感病的植株不能扩增得到该条带，表明转基因后代的抗性是转入Pid3基因的结果。
序列表<160>3<210>1<211>6235<212>DNA<213>水稻属水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>1cacacattgt acacctacga ccaccgttca ccgttcagag actaagacta tggtggtgtt 60tggatccagg gactaaattt tagtgcctga catatcggat gtttgaacac taattagaag120tattaaatgt agactaataa taaaactaat tgcataaata agagctaatt cgcaagaaat180ttttaagcct aattaatcca taactagcac atgtttacta tagcatcaca taggctaatt240atggattaat tagtctcaat agattcgcct cgcgaattag tccaaagtta tggaatgggt300tttgtcatta gtctacattt gatacttctc attagcgtct aaacatccga tgtgatttta360gtccctgatc taatcagccc ctggctggca aattctatga atgatgaagt aacaacacac420aattcactat caacgagcat atcgtctgcc acttcatttt aggtataata ttcaaattta480attctatcat aaaccttatt aacgttgatt gccttgctga atctgattaa tgtctttatg540tttataataa actttattga tgctgattgc attgctagcc ctggctgaga aagggtatat600atatgaattg tctttatctg atctaacaaa atattaaacg atgaggttag tccatgcatt660ttttatatta atttgtcctc tcttcacaaa gtaaataagc taatgctaac aatacatatc720gatatatctc aattcatgca aattaagatc gaaatatggc aatcgagtta gctataattc780ccgttataaa ttccaacaag atactgtctc cgttccaaaa taagtgcagc catggatatc840cgtgtaccgt ccgtctgatt tgaaaaattt ataatttttt aaaaaattag tcacacataa900agtactattc atgttttata acctaataca ataaaaatac taatcatgaa aaaaattcaa960ataagacgaa tggtcaaacg ctggatatga atttttataa aactacactt attttgggac 1020gaaaggagta catatttttc ctttgttacc gttagcacgt tttttaaact ggtaaatggt 1080gtcttcgagt gaaaactttc ttcatagaag ttgctataga aaacaaataa atccatttat 1140taagtttttt ataattaaaa ttcaattaat catgtgctaa tgacttatct cgttttgtgt 1200gcgtacttaa tcttcatatt ccatcagctt caaacgggcc ttaaatcttt ttacatgagt 1260ttatttaatc ctctagggtt aatttaattt tggtgacgta taataattgt tttaatattt 1320atgcctttaa gggtcagcaa attaattttt tcttgatctg aattagaata aatttaattt 1380
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Lys Met Gly Thr Trp Ser Arg Leu Ala Gly Asn Leu Gln Asp Ile Lys115 120 125Val Asn Leu Lys Asn Ala Ala Glu Arg Arg Ile Arg Tyr Asp Leu Lys130 135 140Gly Val Glu Arg Gly Ala Lys Ser Thr Ala Gly Arg Arg Ser Ser Asn145 150 155 160Trp Arg Ser Asp Ser Val Leu Phe Lys Arg Glu Asp Glu Leu Val Gly165 170 175Ile Glu Lys Lys Arg Asp Leu Leu Met Lys Trp Val Lys Asp Glu Glu180 185 190Gln Arg Arg Met Val Val Ser Val Trp Gly Met Gly Gly Ile Gly Lys195 200 205Thr Ala Leu Val Ala Asn Val Tyr Asn Ala Ile Lys Ala Asp Phe Asp210 215 220Thr Cys Ala Trp Ile Thr Val Ser Gln Ser Tyr Glu Ala Asp Asp Leu225 230 235 240Leu Arg Arg Thr Ala Gln Glu Phe Arg Lys Asn Asp Arg Lys Lys Asp245 250 255Phe Pro Val Asp Val Asp Ile Thr Asn Tyr Arg Gly Leu Val Glu Thr260 265 270Thr Arg Ser Tyr Leu Glu Asn Lys Arg Tyr Val Leu Val Leu Asp Asp275 280 285Val Trp Asn Ala Asn Val Trp Phe Asp Ser Lys Asp Ala Phe Glu Asp290 295 300Gly Asn Ile Gly Arg Ile Ile Leu Thr Ser Arg Asn Tyr Asp Val Ala305 310 315 320Leu Leu Ala His Glu Thr His Ile Ile Asn Leu Gln Pro Leu Glu Lys325 330 335His His Ala Trp Asp Leu Phe Cys Lys Glu Ala Phe Trp Lys Asn Glu340 345 350Ile Arg Asn Cys Pro Pro Glu Leu Gln Pro Trp Ala Asn Asn Phe Val355 360 365
Asp Lys Cys Asn Gly Leu Pro Ile Ala Ile Val Cys Ile Gly Arg Leu370 375 380Leu Ser Phe Gln Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Trp Glu Lys Val Tyr Lys385 390 395 400Asn Leu Glu Met Gln Leu Thr Asn Asn Ser Ile Met Asp Met Met Asn405 410 415Ile Ile Leu Lys Ile Ser Leu Glu Asp Leu Pro His Asn Ile Lys Asn420 425 430Cys Phe Leu Tyr Cys Ser Met Phe Pro Glu Asn Tyr Val Met Lys Arg435 440 445Lys Ser Leu Val Arg Leu Trp Val Ala Glu Gly Phe Ile Glu Glu Thr450 455 460Glu His Arg Thr Leu Glu Glu Val Ala Glu His Tyr Leu Thr Glu Leu465 470 475 480Val Asn Arg Cys Leu Leu Leu Leu Val Lys Arg Asn Glu Ala Gly His485 490 495Val His Glu Val Gln Met His Asp Ile Leu Arg Val Leu Ala Leu Ser500 505 510Lys Ala Arg Glu Gln Asn Phe Cys Ile Val Val Asn His Ser Arg Ser515 520 525Thr His Leu Ile Gly Glu Ala Arg Arg Leu Ser Ile Gln Arg Gly Asp530 535 540Phe Ala Gln Leu Ala Asp His Ala Pro His Leu Arg Ser Leu Leu Leu545 550 555 560Phe Gln Ser Ser Pro Asn Val Ser Ser Leu His Ser Leu Pro Lys Ser565 570 575Val Lys Leu Leu Ser Val Leu Asp Leu Thr Asp Ser Ser Val Asp Arg580 585 590Leu Pro Lys Glu Val Phe Gly Leu Phe Asn Leu Arg Phe Leu Gly Leu595 600 605Arg Arg Thr Lys Ile Ser Lys Leu Pro Ser Ser Ile Gly Arg Leu Lys610 615 620
Asn Leu Leu Val Leu Asp Ala Trp Lys Cys Lys Ile Val Lys Leu Pro625 630 635 640Leu Ala Ile Thr Lys Leu Gln Lys Leu Thr His Leu Ile Val Thr Ser645 650 655Lys Ala Val Val Val Ser Lys Gln Phe Val Pro Ser Val Gly Val Pro660 665 670Ala Pro Leu Arg Ile Cys Ser Met Thr Thr Leu Gln Thr Leu Leu Leu675 680 685Met Glu Ala Ser Ser Gln Met Val His His Leu Gly Ser Leu Val Glu690 695 700Leu Arg Thr Phe Arg Ile Ser Lys Val Arg Ser Cys His Cys Glu Gln705 710 715 720Leu Phe Met Ala Ile Thr Asn Met Ile His Leu Thr Arg Leu Gly Ile725 730 735Gln Ala Asp Ser Ser Gln Glu Val Leu His Leu Glu Ser Leu Lys Pro740 745 750Pro Pro Leu Leu Gln Lys Leu Phe Leu Gln Gly Thr Leu Ser His Glu755 760 765Ser Leu Pro His Phe Val Ser Val Ser Asn Leu Asn Asn Leu Thr Phe770 775 780Leu Arg Leu Ala Gly Ser Arg Ile Asp Glu Asn Ala Phe Leu Asn Leu785 790 795 800Glu Gly Leu Gln Gln Leu Val Lys Leu Gln Leu Tyr Asp Ala Phe Asp805 810 815Gly Met Asn Ile Tyr Phe His Glu Asn Ser Phe Pro Lys Leu Arg Ile820 825 830Leu Lys Ile Trp Gly Ala Pro His Leu Asn Glu Ile Lys Met Thr Lys835 840 845Gly Ala Val Ala Ser Leu Thr His Leu Lys Phe Leu Leu Cys Pro Asn850 855 860Leu Lys Gln Leu Pro Cys Gly Ile Glu His Val Arg Thr Leu Glu Glu865 870 875 880
Leu Thr Leu Asp His Thr Ala Glu Glu Leu Val Asp Arg Val Arg Arg885 890 895Lys Lys Glu Arg Met Ile Cys Asp Val Gln Arg Val Tyr Val Gly Phe900 905 910Ile Arg Asn Gly Val Leu Ala Ala Glu Arg Ile Gln915 920
权利要求
1.一种植物抗病性蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列3的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗病性功能的由(a)衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的耐逆相关蛋白，其特征在于所述植物抗病性蛋白，其氨基酸残基序列是序列表中序列3。
3.权利要求1或2所述植物抗病性蛋白的编码基因。
4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于所述植物抗病性蛋白的编码基因其编码序列为序列表中序列1的自5′端第3010到第5781位核苷酸。
5.根据权利要求4所述的编码基因，其特征在于所述植物抗病性蛋白的基因组基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)编码序列表中序列3蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
6.根据权利要求4所述的的编码基因，其特征在于所述植物抗病性蛋白的cDNA基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中序列2的DNA序列；2)编码序列表中序列3蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中序列2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
7.含有权利要求3-6中任意一项所述植物抗病性蛋白的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或宿主菌。
8.权利要求3-6中任意一项所述植物抗病性蛋白在培育具有抗病性或抗病性提高的植物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述抗病性为对稻瘟菌的抗性；所述植物为水稻。
全文摘要
本发明公开了一种植物抗病性蛋白及其编码基因与应用。该植物抗病性蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列3的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗病性功能的由(a)衍生的蛋白质。本发明的抗病性蛋白及其编码基因对培育抗病植物品种，扩大作物种植范围，提高农作物产量具有重要意义。
文档编号C12N15/82GK101062944SQ20071009932
公开日2007年10月31日 申请日期2007年5月16日 优先权日2007年5月16日
发明者朱立煌, 尚俊军, 陈学伟, 王静, 徐吉臣 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所