专利名称：水稻的与耐逆性相关的dreb类转录因子及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物中与胁迫相关的转录因子及其编码基因与应用，特别是涉及来源于水稻AP2/EREBP家族的与耐逆性相关的DREB类转录因子及其编码基因与其在培育耐逆性提高的植物中的应用。
背景技术：
干旱、低温和高盐等环境胁迫是影响农作物产量的主要因素。在这些胁迫因素的影响下，植物体内有很多基因受诱导而表达，并且它们的表达产物能够减少环境所造成的伤害并得以生存(Shinozaki，K.and Yamaguchi-Shinozaki，K.(1994).Molecular responses to drought and cold stress.Curr.Opin.Biotechnol 7，161-167)。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等(Kasuga，M.，Liu，Q.，Miura，S.，Yamaguchi-Shinozaki，K.，and Shinozaki，K.(1999).Improving plant drought，salt，and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducibletranscription factor.Nature biotechnol.17，287-291)。其中，转录因子在植物胁迫应答的基因表达调控中起到重要作用。
转录因子和植物基因启动子中的顺式元件的相互作用是调节抗逆相关基因表达的重要途径(Kazuo shinozaki，Kazuko Yamaguchi，Sehi M.2003 Regulatory networkof gene expression in the drought and cold stress responses.Current opinionin plant biology 6，410-417.)。植物对干旱的应答途径可以分为两大类依赖于ABA的ABA-dependent途径和不依赖于ABA的ABA-independent途径。许多ABA-indueible基因在它们的启动子中都含有一个十分保守的ABA应答的顺式作用元件，称为ABRE(PyACGTGGC)(Chandler PM，Robertson M 1994.Gene expressionregulated by abscisic acid and its relation to stress tolerance.Annu Rev PlantPhysiol Plant Mol Biol 45，113-141.)。但是，有些基因的诱导并不完全依赖于ABA，即它本身既受ABA，也受其它条件的诱导，例如rd29A，KIN1和KIN2(ShinozakiK，Yamaguchi-Shinozaki K(2000).Molecular responses to dehydration and lowtemperatureDifferenees and cross-talk between two stress signal ing pathways.Curr Opin Plant Biol 3，217-223.)。1994年，研究人员在对拟南芥rd29A启动子的研究中发现了一类新的顺式元件CRT/DRE(CCGAC)(Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K(1994).A novel cis-acting element in an Arabidopsis gene isinvolved in responsiveness to drought，low-temperature or high-salt stress.Plant Cell 6，251-264.)。与CRT/DRE元件结合的蛋白称为CBF/DREBs。这一类蛋白参与低温和/或干旱的诱导表达，但不依赖于ABA，属于ABA-independent途径。CBF/DREB类蛋白都含有一个保守的AP2结构域，属于AP2/EREBP类转录因子。
AP2/EREBP类转录因子是植物所特有的一类转录因子，在高等植物中广泛存在。近年来，在拟南芥、烟草、玉米、水稻、大豆和油菜中均有报道(Elliott，R.C.，Betzner，A.S.，Huttner，E.，Oakes，M.P.，Tucker，W.Q.，Gerentes，D.，Perez，P.，andSmyth，D.R.(1996).AINTEGUMENTA，an APETALA2-like gene of Arabidopsis withpleiotropic roles in ovule development and floral organ growth.Plant Cell8，155-168；Kevin，M.K.，Leonore Reiser，and Robert，L.F.(1996).TheAINTEGUMENTA gene of Arabidopsis Required for ovule and female gametophytedevelopment is related to the floral homeotic gene APETALA2.Plant Cell 8，137-153)，这表明AP2/EREBP类转录因子在高等植物中普遍存在并具有重要作用。
AP2转录因子家族成员的主要特点是含有一个高度保守的、具有三个β折叠的DNA结合区，称作AP2域(AP2 domain)。在AP2域中，有两个保守序列，一个是碱性的YRG区，是由19-22个氨基酸组成的高度保守的一段序列，它含有YRG这几个保守的氨基酸序列，YRG元件已经被证明参与与DNA的结合；第二个保守区是RAYD区，RAYD区是由42-43个氨基酸组成的一段氨基酸序列，它的核心结构是一个由18个氨基酸组成的双亲性的α-螺旋结构，这个核心结构的氨基酸序列高度保守(Okamour，J.K.，Brian Caster，Raimundc Villarroel，Marc Van Montagu，and Jofuku，K.D.(1997).The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA bindingproteins in Arabidopsis.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94，7076-7081)，RAYD元件可能参与蛋白与蛋白的相互作用。同时，经研究还发现，在YRG和RAYD保守区中，有几个氨基酸残基是极度保守的，比如RAYD保守区中第40个氨基酸-甘氨酸，在所有的AP2蛋白中都是不改变的，它对于AP2蛋白发挥其生理功能很重要(Jofuku，K.D.，den Boer，B.G.，Van Montagu，M.，and Okamuro，J.K.(1994).Control ofArabidopsis flower and seed development by the homeotic gene APETALA2.PlantCell 6，1211-1225)。
根据AP2结构域数目的不同，可以把AP2转录因子家族分为两个亚家族AP2-like家族和EREBP-like家族。AP2-like家族成员最主要的特征是在其蛋白结构中含有两个AP2结构域，这两个AP2结构域被一个由25-26个氨基酸组成的铰链区连接，铰链区的氨基酸序列也是高度保守的，AP2-like家族的另一个特征是，在其YRG序列中均含有WEAR/WESH这样一段高度保守的氨基酸序列。AP2-like家族主要在植物发育中起作用，比如拟南芥基因AP2(homeotic gene APETALA2)是这个家族中的成员之一，它不仅参与调控花分生组织的建立、花器官的分化，同时还能够调控其它与花发育有关的同源异型基因的表达，在拟南芥花发育过程中起重要作用，而且，它还参与拟南芥子房发育和种子发育过程的调节(Jofuku，K.D.，den Boer，B.G.，Van Montagu，M.，and Okamuro，J.K.(1994).Control of Arabidopsis flower and seed developmentby the homeotic gene APETALA2.Plant Cell 6，1211-1225)，该家族的另一成员ANT，在拟南芥的子房发育和雌配子体的发育过程中起关键作用。
EREBP-like家族的成员的特征是仅含有一个AP2结构域，而且在YRG保守区中没有WEAR/WESH，由7个氨基酸—WAAEIRD组成的一个高度保守的结构(Okamour，J.K.，Brian Caster，Raimundc Villarroel，Marc Van Montagu，and Jofuku，K.D.(1997).The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA binding proteinsin Arabidopsis.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94，7076-7081)。据估计，在拟南芥中，EREBP-like家族有124个成员之多(Riechmann，J.L.，Heard，J.，Martin，G.，Reuber，L.，Jiang，C.-Z.，Keddie，J.，Adam，L.，Pineda，O.，Ratcliffe，O.J.，Samaha，R.R.，Creelman，R.，Pilgrim，M.，Broun，P.，Zhang，J.-Z.，Ghandehari，D.，Sherman，B.K.，and Yu，G.-L.(2000).Arabidopsis transcriptionfactorsgenome-wide comparative analysis among eukaryotes.Science 290，2110)，家族如此庞大，也许与EREBP-like转录因子在植物体中所参与的广泛的生物学作用有关。EREBP-like转录因子参与植物对低温、干旱、病原侵害、机械伤害等胁迫应答反应，并受乙烯、水杨酸和茉莉酮酸的调节(Singh，K.，Foley，R.C.，andOnate-Sanchez，L.(2002).Transcription factors in plant defense and stressresponses.Curr.Opin.Plant Biol 5，430-436)。
EREBP-like转录因子能够与GCC盒(GCC box)和DRE/CRT(dehydrationresponsive element/C-repeat)两种顺式作用元件结合。GCC盒的序列是AGCCGCC，它存在于植物与抗性有关的基因的启动子中，它对于乙烯诱导的PR基因(pathogenesis related genes)的表达是必须和足够的(Fujimoto，S.Y.，Ohta，M.，Usui，A.，Shinshi，H.，and Ohme-Takagi，M.(2000).Arabidopsisethylene-responsive element binding factors act as transcriptional activatorsor repressors of GCC box-mediated gene expression.Plant Cell 12，393-404)；而DRE/CRT序列存在于植物对干旱、高盐和低温等环境胁迫的抗性有关的基因的启动子中，它们的过量表达能使植物抵抗干旱、高盐和冷害的袭击，所以，EREBP-like家族成员在植物的生物胁迫和非生物胁迫中都起重要的调节作用。
CBF/DREB(CRT-binding factor/DRE-binding protein)类转录因子是AP2家族中EREBP-like亚家族中的一个成员。根据其结构上的同源性，拟南芥中的CBF/DREB类转录因子可以将其分为DREB1和DREB2两大类。DREB1包括CBF1/DREB1B、CBF2/DREB1C、CBF3/DREB1A、CBF4/DREB1D、DREB1E和DREB1F六个成员，其中CBF1/DREB1B、CBF2/DREB1C和CBF3/DREB1A位于拟南芥的第四染色体上，目前研究得比较透彻(Gilmour，S.J.，Zarka，D.G.，Stockinger，E.J.，Salazar，M.P.，Houghton，J.M.，and Thomashow，M.F.(1998).Low temperature regulation of the ArabidopsisCBF family of AP2 transcriptional activators as an early step in cold-inducedCOR gene expression.Plant J.16，433-442；Liu，Q.，Kasuga，M.，Sakuma，Y.，Abe，H.，Miura，S.，Yamaguchi-Shinozaki，K.，and Shinozaki，K.(1998).Twotranscription factors，DREB1 and DREB2 with an EREBP/AP2 DNA binding domainseparate two cellular signal transduction pathways in drought-andlow-temperature-responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis.Plant Cell.10，1391-1406)，CBF4/DREB1D位于第五条染色体上(Nakamura，Y.，Sato，S.，Asamizu，E.，Kaneko，T.，Kotani，H.，Miyajima，N.，and Tabata，S.(1998).Structural analysis of Arabidopsis thaliana chromosome 5VII.Sequencefeatures of the regions of 1,013,767bp covered by sixteen physically assignedP1 and TAC clones.DNA Res.5，297-308；Thomashow，M.F.，Gilmour，S.J.，Stockinger，E.J.，Jaglo-Ottosen，K.R.，and Zarka，D.G.(2001).Role ofArabidopsis CBF transcriptional activators in cold acclimation.Plant Physiol112，171-175)，DREB1E和DREB1F位于第一条染色体上(Sakuma，Y.，Liu，Q.，Dubouzet，J.G.，Abe，H.，Shinozaki，K.，and Yamaguchi-Shinozaki，K.(2002).DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs，transcription factors involved in dehydration-and cold-inducible geneexpression.Biochem Biophys Res Commun.290，998-1009)。
DREB2类转录因子包括DREB2A和DREB2B两个成员(Nakashima，K.，Shinwari，Z.K.，Sakuma，Y.，Seki，M.，Miura，S.，Shinozaki，K.，and Yamaguchi-Shinozaki，K.(2000).Organization and expression of two Arabidopsis DREB2 genes encodingDRE-binding proteins involved in dehydration-and high-salinity-responsivegene expression.Plant Mol Biol.42，657-665)。DREB2A位于拟南芥的第五条染色体上，DREB2B位于第三条染色体上。
DREB类转录因子能够与DRE/CRT顺式作用元件结合，诱导启动子中含有DRE/CRT顺式作用元件(TACCGACAT)的基因的表达，这些基因都是与植物对干旱、高盐或低温等环境胁迫的抗性有关的基因。DRE/CRT的核心序列是ACCGAC，普遍存在于干旱、高盐或低温胁迫应答基因的启动子中，比如rd29A、kin1、cor6.6、cor15a、rd17和erd10等，对这些胁迫条件下的基因诱导表达起调控作用。所以，在植物对干旱、高盐或低温胁迫的分子应答中，一个DREB转录因子可以调控一群启动子中含有DRE/CRT元件的与胁迫耐性相关的基因的表达。
在植物中过量表达DREB类转录因子能够显著增强植物对干旱、高盐或低温等胁迫环境的抗性。在拟南芥中过量表达CBF1，转基因植物比没有转基因的植物对低温具有更强的耐受性(Jaglo-Ottosen，K.R.，Gilmour，S.J.，Zarka，D.G.，Schabenberger，O.，and Thomashow，M.F.(1998).Arabidopsis CBF1overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance.Science 280，104-106)；过量表达CBF3，转基因拟南芥获得了对干旱、高盐和低温胁迫的较高的抵抗能力(Gilmour，S.J.，Sebolt，A.M.，Salazar，M.P.，Everard，J.D.，andThomashow，M.F.(2003).Overexpression of the Arabidopsis CBF3transcriptional activator mimics multiple biochemical changes associated withcold acclimation.Plant Physiol.124，1854-1865)，但同时也引起转基因植物的高度矮化，而用诱导型启动子比如rd29A的启动子代替组成型启动子就可以克服这个负面效应，在提高植物耐旱性能的同时不会造成植物其它性状的改变(Kasuga，M.，Liu，Q.，Miura，S.，Yamaguchi-Shinozaki，K.，and Shinozaki，K.(1999).Improving plant drought，salt，and freezing tolerance by gene transfer of asingle stress-inducible transcription factor.Nature biotechnol.17，287-291)。
水稻中也存在能够识别DRE/CTR顺式作用元件或其核心序列并与之结合的DREB类转录因子。2003年，Dubouzet等从水稻中分离得到了与五个拟南芥DREB类转录因子同源的序列的cDNA，并命名为OsDREB1A、OsDREB1B、OsDREB1C、OsDREB1D、OsDREB2A，其中，OsDREB1A、OsDREB1B被低温、高盐和机械损伤诱导，OsDREB2A受干旱、高盐和低温诱导表达，而且，在拟南芥中过量表达OsDREB1A和OsDREB2A的转基因植株都表现了较高的耐干旱、高盐和低温的性能(Joseph G.Dubouzet，Yoh Sakuma2003.OsDREB genes in rice，Oryza sativa L.，encode transcription activatorsthat function in drought-，high-salt-and cold-responsive gene expression.The plant journal 33，751-763.)。近年来已经从大麦、黑麦、番茄和油菜里得到了与拟南芥中的DREB转录因子序列上同源、功能上相同或相似的基因，这些研究结果表明，DREB类转录因子在植物界是广泛存在的，并且在不同的植物体中，它们执行着相似或相同的功能。
大量对转录因子研究的结果表明，一个转录因子可能对一类相关性状的很多基因实施调节控制，从而有效改变植物的相关特性，同时很多研究结果也表明，在植物体内，包括拟南芥、烟草、大麦和玉米等，过量表达DREB类转录因子的植株都表现了较高抵抗干旱、高盐或低温胁迫的性能(Pradeep K.Agarwal，et al 2006.Role ofDREB transcription factors in abiotic and biotic stress tolerance in plants.Plant Cell Reports.25(12)1263-74.)。所以，通过转基因的方法改善作物的抗逆性，是一条行之有效的途径。
水稻是世界上最重要的粮食作物，也是单子叶植物的模式植物，它为全球近一半的人口提供食物。然而，干旱、高盐和低温等逆境胁迫，每年都会在全世界范围内造成水稻大面积的减产，全球约有40％的水稻种植区受到不同程度的环境胁迫。随着全球人口的不断增加和可耕种面积的逐年减少，提高水稻产量成为全球所共同面临的一个紧迫的挑战，而减少逆境胁迫所造成的产量损失，就能够在很大程度上缓解粮食危机。
发明内容
本发明的目的是提供属于AP2/EREBP家族的与耐逆性相关的DREB类转录因子。
本发明所提供的与耐逆性相关的DREB类转录因子，来源于稻属水稻(Oryzasativa L.)，是下述氨基酸残基序列之一
1)序列表中的SEQ ID NO1；2)序列表中的SEQ ID NO3；3)序列表中的SEQ ID NO5；4)序列表中的SEQ ID NO7；5)序列表中的SEQ ID NO9；6)序列表中的SEQ ID NO11；7)将序列表中SEQ ID NO1、3、5、7、9或11的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控植物耐逆性功能的蛋白质。
序列表中的SEQ ID NO1由224个氨基酸残基组成，其中，自氨基端第54-73位氨基酸残基为DNA结合结构域，自氨基端第54-111位氨基酸残基为AP2保守区，将具有该氨基酸残基序列的蛋白命名为OsDREB1G；序列表中的SEQ ID NO3由217个氨基酸残基组成，其中，自氨基端第46-65位氨基酸残基为DNA结合结构域，自氨基端第46-103位氨基酸残基为AP2保守区，将具有该氨基酸残基序列的蛋白命名为OsDREB1I；序列表中的SEQ ID NO5由289个氨基酸残基组成，其中，自氨基端第95-114位氨基酸残基为DNA结合结构域，自氨基端第95-152位氨基酸残基为AP2保守区，将具有该氨基酸残基序列的蛋白命名为OsDREB1H；序列表中的SEQ ID NO7由251个氨基酸残基组成，其中，自氨基端第54-74位氨基酸残基为DNA结合结构域，自氨基端第54-114位氨基酸残基为AP2保守区，将具有该氨基酸残基序列的蛋白命名为OsDREB1F；序列表中的SEQ ID NO9由373个氨基酸残基组成，其中，自氨基端第88-107位氨基酸残基为DNA结合结构域，自氨基端第88-145位氨基酸残基为AP2保守区，将具有该氨基酸残基序列的蛋白命名为OsDREB2B；序列表中的SEQ ID NO11由318个氨基酸残基组成，其中，自氨基端第27-46位氨基酸残基为DNA结合结构域，自氨基端第27-84位氨基酸残基为AP2保守区，将具有该氨基酸残基序列的蛋白命名为OsDREB2C。
所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。
编码本发明来源于水稻的与耐逆性相关的DREB类转录因子的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；2)序列表中SEQ ID NO4的DNA序列；3)序列表中SEQ ID NO6的DNA序列；4)序列表中SEQ ID NO8的DNA序列；5)序列表中SEQ ID NO10的DNA序列；6)序列表中SEQ ID NO12的DNA序列；7)编码序列表中SEQ ID NO1、3、5、7、9或11的DNA序列；
8)与序列表中SEQ ID NO2、4、6、8、10或12限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有调控植物耐逆性功能的核苷酸序列；9)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO2、4、6、8、10或12限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO2由675个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-675位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’端第160-217位碱基编码DNA结合结构域，自5’端第160-331位碱基编码AP2保守区，将具有该核苷酸序列的基因命名为OsDREB1G；序列表中的SEQ ID NO4由654个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-654位碱基，编码具有序列表中SEQ IDNO3的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’端第136-193位碱基编码DNA结合结构域，自5’端第136-307位碱基编码AP2保守区，将具有该核苷酸序列的基因命名为OsDREB1I；序列表中的SEQ ID NO6由870个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-870位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO5的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’端第283-340位碱基编码DNA结合结构域，自5’端第283-454位碱基编码AP2保守区，将具有该核苷酸序列的基因命名为OsDREB1H；序列表中的SEQ ID NO8由756个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-756位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO7的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’端第160-220位碱基编码DNA结合结构域，自5’端第160-340位碱基编码AP2保守区，将具有该核苷酸序列的基因命名为OsDREB1F；序列表中的SEQ ID NO10由1122个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-1122位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO9的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’端第262-319位碱基编码DNA结合结构域，自5’端第262-433位碱基编码AP2保守区，将具有该核苷酸序列的基因命名为OsDREB2B；序列表中的SEQ ID NO12由957个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-957位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO11的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’端第79-136位碱基编码DNA结合结构域，自5’端第79-250位碱基编码AP2保守区，将具有该核苷酸序列的基因命名为OsDREB2C。
含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个目的是提供一种提高植物耐逆性的方法。
本发明所提供的提高植物耐逆性的方法，是将编码所述水稻与耐逆性功能相关的DREB类转录因子的基因(OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B或OsDREB2C)或与所述基因具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列导入植物组织、细胞或器官，使植物耐逆性获得提高。
在上述提高植物耐逆性的方法中，编码本发明水稻与耐逆性相关的DREB类转录因子的基因(OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B或OsDREB2C)既可为所述基因的cDNA序列，也可为所述基因的基因组基因序列；与所述基因具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列，是将所述基因的cDNA或基因组基因序列用已知的方法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用(例如，反义或共抑制技术)中，部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。基因序列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变化的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。
编码本发明水稻与耐逆性相关的DREB类转录因子的基因(OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B或OsDREB2C)或其同源序列植物表达载体导入植物组织、细胞或器官；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如GatewayTW系列载体(如pH2GW7等)、pBin系列载体(如pBin 19等)、pBI系列载体(如pBI 101等)、pCAMBIA系列载体(如pCAMBIA 1301等)、per8、pX6或其它衍生植物表达载体，所述出发载体还可为可在原核生物中复制的载体，如pENTER-TOPO、PUC系列载体或pBluescript系列载体等。
使用编码本发明水稻与耐逆性相关的DREB类转录因子的基因(OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B或OsDREB2C)或其同源序列构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型(ABA、干旱、盐碱或化学诱导等)启动子；所述组成型表达启动子可为花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子，玉米Ubiquitin启动子或水稻actin1启动子等；所述组织特异性表达启动子可为根特异性表达启动子(如拟南芥Pyk10启动子(Nitz I.et al.，Pyk10，a seedling and root specific gene and promoter from Arabidopsis thaliana.Plant Sci，2001，161337))、叶特异性表达启动子(如Rubisco小亚基RBCS1启动子(Marraccini P.et al.，Rubisco small subunit of Coffea ArabicacDNAsequence，gene cloning and promoter analysis in transgenic tobacco plants.Plant Physiol.Biochem.2003，4117))、茎特异性表达启动子(如马铃薯TDF511启动子(Trindade LM.et al.，Isolation and functional characterization of a stolonspecific paromoter from potato(Solanumtuberosum L.)，Gene，2003，30377))、种子特异性表达启动子(如2S1启动子(GenBank号NM_118848.2，GI30687489)和NapinA(GenBank号M64633.1，GI349405)启动子等)、花特异性表达启动子或花粉特异性表达启动子(如烟草TA29启动子(Koltanow AN.et al.，Different temporaland spatal gene expression patterns occur during anther development.PlantCell，1990，21201))；所述诱导型启动子可为受低温、干旱、ABA、乙烯、盐碱或化学等诱导的启动子；上述启动子可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、庆大霉素标记物或卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。所述含新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因的宿主植物细胞、组织或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等进行筛选，含潮霉素磷酸转移酶(Hygromycinphosphotransferase)基因的宿主植物细胞、组织或器官可由潮霉素进行筛选。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。经上述方法进行筛选后还可采用Southern、PCR或点杂交等分子检测手段对转基因植株进行检测，以确定其是否转化有目的基因。
其中，以pH2GW7(购自inVitrogen公司)为出发载体，构建的含有编码本发明水稻与耐逆性相关的DREB类转录因子的基因的植物表达载体为pH2GW7Vector-OsDREB1G、pH2GW7 Vector-OsDREB1I、pH2GW7 Vector-OsDREB1H、pH2GW7Vector-OsDREB1F、pH2GW7 Vector-OsDREB2B或pH2GW7 Vector-OsDREB2C。
携带有编码本发明水稻与耐逆性相关的DREB类转录因子的基因(OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B或OsDREB2C)或其同源序列的植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca2+、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管导入、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。
此外，通过将转化有编码本发明水稻与耐逆性相关的DREB类转录因子的基因(OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B或OsDREB2C)或与所述基因具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列的转基因植株进行继代培养后，可从中进一步筛选出基因纯合的转基因植株。此外，还可对该转基因植株进行扩繁，可使转基因植物的抗逆性进一步改善和提高。所述转基因植物的扩繁包括无性繁殖和/或种子繁殖。
本发明的方法对双子叶植物和单子叶植物均适用，因此，所述被转化的植物细胞、组织或器官既可来源于烟草、油菜、棉花、大豆、杨树、桉树、马铃薯或牧草等双子叶植物，也可来源于水稻、玉米、小麦、大麦、高梁、谷子或草坪草等单子叶植物。
本发明提供了一组来源于水稻AP2/EREBP家族的与耐逆性相关的DREB类转录因子及其编码基因。实验证明，将本发明的基因转化水稻可显著提高水稻对逆境胁迫的耐受性，且对水稻的正常生长和经济性状没有明显的影响。本发明的蛋白及其编码基因对于植物逆境耐受性机制的研究，以及提高植物的耐逆性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物(特别是禾谷类作物)的抗逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为来自水稻的与耐逆性相关的DREB类转录因子的AP2结构域的同源性比对结果图1A为来自水稻的与耐逆性相关的DREB类转录因子与已知的拟南芥的CBF/DREB类转录因子的进化树图2为OsDREB1G/OsDREB1I/OsDREB1H/OsDREB1F/OsDREB2B/OsDREB2C转基因T1代植株的mRNA过表达的RT-PCR检测结果图3A-图3F为OsDREB1G/OsDREB1I/OsDREB1H/OsDREB1F/OsDREB2B/OsDREB2C转基因水稻不同株系耐旱苗比例的柱形4为经干旱胁迫的OsDREB1G/OsDREB1I/OsDREB1H/OsDREB1F/OsDREB2B/OsDREB2C转基因T1代耐旱植株与野生型植株图5A-图5F为OsDREB1G/OsDREB1I/OsDREB1H/OsDREB1F/OsDREB2B/OsDREB2C转基因水稻不同株系耐盐苗比例的柱形6为经盐胁迫的OsDREB1G/OsDREB1I/OsDREB1H/OsDREB1F/OsDREB2B/OsDREB2C转基因T1代耐盐植株与野生型植株图7A-图7F为OsDREB1G/OsDREB1I/OsDREB1H/OsDREB1F/OsDREB2B/OsDREB2C转基因水稻不同株系耐低温苗比例的柱形8为经低温胁迫的OsDREB1G/OsDREB1I/OsDREB1H/OsDREB1F/OsDREB2B/OsDREB2C转基因T1代耐低温植株与野生型植株图9A-图9C为OsDREB1G/OsDREB1I/OsDREB1H转基因T2代水稻经济性状检测结果的柱形图具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见《Molecular CloningA Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rdedition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物及DNA序列均由上海英骏生物技术有限公司合成。
实施例1、水稻与耐逆性相关的DREB类转录因子编码基因的获得1、水稻与耐逆性相关的DREB类转录因子编码基因序列的获得以拟南芥CBF1的核苷酸序列(GenBank号NP 567721.1)在GENBANK中进行同源基因检索，获得同源序列；其中的六个同源序列的核苷酸序列为序列表中的SEQ IDNO2、4、6、8、10和12，在水稻基因组中为单拷贝，没有内含子，分别命名为OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C。
2、OsDREB1G/OsDREB1I/OsDREB1H/OsDREB1F/OsDREB2B/OsDREB2C的PCR扩增及序列分析以水稻(Oryza sativa L.)品种中花11的基因组DNA为模板，采用巢式PCR方法扩增OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C，引物序列如下1)根据OsDREB1G ORF(开放阅读框)设计的正向引物OsDREB1G-ORF-forwardprimer为5’-ATGGACGTTTCTGCTGCGCTCAG-3’，反向引物OsDREB1G-ORF-reverseprimer为5’-GTAGCTCCATAGCTGGACCTCG-3’；根据OsDREB1G 5’UTR设计的正向引物OsDREB1G-UTR-forward primer为5’-ATCAACCTCGCTCGCTTACTCGTGT-3’；根据OsDREB1G 3’UTR设计的反向引物OsDREB1G-UTR-reverse primer为5’-AGCCTTCACCGTCTTCAGAACCCAT-3’。
2)根据OsDREB1I ORF设计的正向引物OsDREB1I-ORF-forward primer为5’-ATCGACGGCCCACGACGCC-3’，反向引物OsDREB1I-ORF-reverse primer为5’-GTAATCCCACAGCATGGGCTCCTC-3’；根据OsDREB1I 5’UTR设计的正向引物OsDREB1I-UTR-forward primer为5’-AAGCCTCCAACTACTCCAGTCCACAC-3’；根据OsDREB1I 3’UTR设计的反向引物OsDREB1I-UTR-reverse primer为5’-AGAAAGAGAACAGAGCAGAAGCAGAGT-3’。
3)根据OsDREB1H ORF设计的正向引物OsDREB1H-ORF-forward primer为5’-ATGGCCATGGCGAAGGAGCTCC-3’，反向引物OsDREB1H-ORF-reverse primer为5’-AGCATCTGTTACTCCCAAGTCCC-3’；根据OsDREB1H 5’UTR设计的正向引物OsDREB1H-UTR-forward pr imer为5’-TAAAAACCCCCCTCTCTCCTCACTAC-3’；根据OsDREB1H 3’UTR设计的反向引物OsDREB1H-UTR-reverse primer为5’-CTGCTTTTCCAAAGGTAATAAACTACAG-3’。
4)根据OsDREB1F ORF设计的正向引物OsDREB1F-ORF-forward primer为5’-ATGTGTACGAGCAAACTAGAGGAGAT-3’，反向引物OsDREB1F-ORF-reverse primer为5’-GTAGCTCCACAGAGACACGTCAG-3’；根据OsDREB1F 5’UTR设计的正向引物OsDREB1F-UTR-forward primer为5’-CAACCATAACATTTTACATCCACTTTC-3’；根据OsDREB1F 3’UTR设计的反向引物OsDREB1F-UTR-reverse primer为5’-CGAAATGAGGAAACCGTACATAGGAAT-3’。
5)根据OsDREB2B ORF设计的正向引物OsDREB2B-ORF-forward primer为5’-ATGACGGTGGATCAGAGGACGACG-3’，反向引物OsDREB2B-ORF-reverse primer为5’-CAAGCCCTCAAAGAACTGAGAGTC-3’。
6)根据OsDREB2C ORF设计的正向引物OsDREB2C-ORF-forward primer为5’-ATGGAGAGCTACGGGAGGAAGC-3’，反向引物OsDREB2C-ORF-reverse primer为5’-AATGTCCCAAATAGGGATGGGCATG-3’；根据OsDREB2C 5’UTR设计的正向引物OsDREB2C-UTR-forward primer为5’-CTCCTACTCAGTCACACTCCCCTCAC-3’；根据OsDREB2C 3’UTR设计的反向引物OsDREB2C-UTR-reverse primer为5’-AACAAGCTCTGATCTCCCCTACTTCT-3’。
50μl PCR反应体系为上、下游引物各1μl，DNA模板1μl，Taq酶0.5μl，10×dNTPs 5μl，10×PCR缓冲液(Mg2+)5μl，H2O 36.5μl。PCR反应条件为先95℃预热5min；然后94℃变性1min，58℃退火2min，共25个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，经扩增获得了大小分别为675bp、654bp、870bp、756bp、1122bp和957bp的DNA片段，与预期结果相符，回收并纯化上述片段，将其分别连接入载体pENTER-TOPO(Invitrogen公司)中，再将连接产物分别用CaCl2法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，挑选阳性单菌落加入到5mL含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12-16小时，提质粒，得到含有目的片段的重组质粒，分别命名为pENTER-TOPOVector-OsDREB1G、pENTER-TOPO Vector-OsDREB1I、pENTER-TOPO Vector-OsDREB1H、pENTER-TOPO Vector-OsDREB1F、pENTER-TOPO Vector-OsDREB2B和pENTER-TOPOVector-OsDREB2C。
对上述质粒进行测序，测序结果表明获得了序列正确的OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C，其中，OsDREB1G具有序列表中SEQ IDNO2的核苷酸序列，由675个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-675位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’端第160-217位碱基编码DNA结合结构域，自5’端第160-331位碱基编码AP2保守区，该基因位于水稻基因组的第2条染色体上，与AtCBF1/DREB1B(GenBank号NP 567721.1)的DNA结合结构域具有65％的一致性，与AtCBF1/DREB1B的氨基酸序列具有45.2％的一致性；OsDREB1I具有序列表中SEQ ID NO4的核苷酸序列，由654个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-654位碱基，编码具有序列表中SEQ IDNO3的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’端第136-193位碱基编码DNA结合结构域，自5’端第136-307位碱基编码AP2保守区，该基因位于水稻基因组的第4条染色体上，与AtCBF1/DREB1B的DNA结合结构域具有75％的一致性，与AtCBF1/DREB1B的氨基酸序列具有37％的一致性；OsDREB1H具有序列表中SEQ ID NO6的核苷酸序列，由870个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-870位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO5的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’端第283-340位碱基编码DNA结合结构域，自5’端第283-454位碱基编码AP2保守区，该基因位于水稻基因组的第10条染色体上，与AtCBF1/DREB1B的DNA结合结构域具有75％的一致性，与AtCBF1/DREB1B的氨基酸序列具有28.7％的一致性；OsDREB1F具有序列表中SEQ ID NO8的核苷酸序列，由756个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-756位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO7的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’端第160-220位碱基编码DNA结合结构域，自5’端第160-340位碱基编码AP2保守区，该基因位于水稻基因组的第8条染色体上，与AtCBF1/DREB1B的DNA结合结构域具有57.2％的一致性，与AtCBF1/DREB1B的氨基酸序列具有36％的一致性；OsDREB2B具有序列表中SEQ ID NO10的核苷酸序列，由1122个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-1122位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO9的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’端第262-319位碱基编码DNA结合结构域，自5’端第262-433位碱基编码AP2保守区，该基因位于水稻基因组的第5条染色体上，与AtCBF1/DREB1B的DNA结合结构域具有73.7％的一致性，与AtCBF1/DREB1B的氨基酸序列具有17.2％的一致性；OsDREB2C具有序列表中SEQ ID NO12的核苷酸序列，由957个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-957位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO11的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’端第79-136位碱基编码DNA结合结构域，自5’端第79-250位碱基编码AP2保守区，该基因位于水稻基因组的第5条染色体上，与AtCBF1/DREB1B的DNA结合结构域具有79％的一致性，与AtCBF1/DREB1B的氨基酸序列具有20.2％的一致性。
进一步，将本发明的OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C编码蛋白(统称为OsCBF/DREBs)的DNA结合结构域与已知的拟南芥和水稻的CBF/DREB类转录因子(GenBank号分别为NP_176491.1、NP_172721.1、NP_001031837.1、NP_567721.1、AAC99371.1、NP_567720.1、NP_187713.1、NP_200012.1、NP_001063712.1、NP_001042107.1、NP_001047629.1、NP_001053608.1)进行系统发育分析，如图1A所示(以AP2结构域的保守性为依据)，表明本发明来源于水稻的与耐逆性相关的DREB类转录因子与已知的拟南芥和水稻CBF/DREB类转录因子的DNA结合结构域具有较高的同源性，均归为同一家族的转录因子。同时，对本发明的OsCBF/DREBs的DNA结合结构域的氨基酸残基序列进行序列比对分析，结果如图1所示，表明上述各基因编码蛋白的DNA结合结构域具有74.6％的一致性，归为同一类DREB基因。
实施例2、与耐逆性相关的DREB类转录因子编码基因转基因水稻的获得用农杆菌介导法将实施例1获得的与耐逆性相关的DREB类转录因子编码基因OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C分别转化水稻，
具体方法如下1)转化农杆菌通过LR反应将实施例1中构建的重组质粒pENTER-TOPO Vector-OsDREB1G、pENTER-TOPO Vector-OsDREB1I、pENTER-TOPO Vector-OsDREB1H、pENTER-TOPOVector-OsDREB1F、pENTER-TOPO Vector-OsDREB2B和pENTER-TOPO Vector-OsDREB2C分别导入植物表达载体pH2GW7(Invitrogen公司的GatewayTWvector载体)中，LR反应体系为0.5μl LR酶，1μl 5×缓冲液，2μl TOPO-OsDREBs，1.5μl pH2GW7，补水5μl，LR反应条件为25℃水浴1-3个小时。然后，通过热激法将上述重组载体转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，挑选阳性单菌落加入到5mL含50mg/L的壮观霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12-16小时，提取质粒，用限制性内切酶EcoRI进行酶切鉴定，经酶切获得了大小分别为875bp、854bp、1070bp、956bp、1322bp和1157bp的酶切产物，与预期结果相符，再在实施例1中引物的引导下进行PCR鉴定，鉴定结果表明获得了分别含有OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C的重组植物表达载体，分别命名为pH2GW7-OsDREB1G、pH2gW7-OsDREB1I、pH2GW7-OsDREB1H、pH2GW7-OsDREB1F、pH2GW7-OsDREB2B和pH2GW7-OsDREB2C，随后将上述重组载体分别转化农杆菌AGL0菌株。
2)侵染水稻愈伤组织挑取步骤1)获得的阳性重组农杆菌的单菌落接种于含壮观霉素50mg/L和利福平50mg/L的20mL YEB液体培养基中，在28℃、150rpm下振荡培养2-3天，再于4℃、5000rpm离心3分钟，去上清，将菌体沉淀重悬于含0.1mmol/L乙酰丁香酮的AA培养基(Co(NO3)2·6H2O0.15mg/L，CaCl2110mg/L，MgSO4122mg/L，KI 3.75mg/L，NaH2PO4·H2O 150mg/L，Na2-EDTA 0.01mM，FeSO4·7H2O 139mg/L，KCl 2.95g/L，MnSO4·4H2O84.5mg/L，ZnSO4·7H2O 6.25mg/L，H3BO35mg/L，Gly 37.5mg/L，CuSO40.005mg/L，Na2MoO4·2H2O 1.25mg/L，盐酸硫胺素VB15mg/L，烟酸5mg/L，盐酸吡哆醇VB65mg/L，肌酸0.1g/L，酪蛋白水解物0.3g/L，L-Gln87.6mg/L，L-Asp26.6mg/L，蔗糖20g/L)中，在28℃下避光振荡培养1-2小时至OD600＝0.6-0.9。挑选按常规植物组织培养方法获得的水稻中花11的生长状态良好、颗粒状愈伤组织浸入上述分别转化有OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C的重组农杆菌培养液中摇动20分钟后，静置30分钟，取出，用无菌滤纸吸干多余菌液，将愈伤组织接种于N6共培养基(N6培养基+10g/L葡萄糖+1mg/L乙酰丁香酮+2，4-D 2mg/L)上培养，其中N6基本培养基的配方为(NH4)2SO40.46g/L，KNO32.83g/L，CaCl20.2g/L，MgSO40.092g/L，KH2PO40.4g/L，Na2-EDTA 0.15g/L，FeSO4·7H2O 0.11g/L，MnSO4·4H2O 0.44g/L，ZnSO4·7H2O 0.17g/L，H3BO30.14g/L，CoCl2·6H2O 0.0005g/L，CuSO4·5H2O 0.0005g/L，Na2MoO4·2H2O 0.005g/L，盐酸硫胺素VB10.01g/L，烟酸0.001g/L，盐酸吡哆醇VB60.001g/L，肌酸0.1g/L，酪蛋白水解物0.3g/L，L-Pro 0.5g/L，蔗糖30g/L，琼脂10g/L，pH5.8。2-3天后，将愈伤组织放入广口瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，然后在含500mg/L头孢霉素的无菌水中浸泡30-60分钟，再用无菌水冲洗1遍，置于无菌滤纸上晾干，最后转入筛选培养基(N6基本培养基+2，4-D 2mg/L+头孢霉素250mg/L)筛选。
3)阳性转基因水稻的获得将侵染后的水稻愈伤组织于N6共培养基中共培养3-5天后，转至含30mg/L潮霉素和400mg/L头饱霉素的N6固体培养基(N6大量元素+B5微量元素+B5有机成分+300mg/L水解酪蛋白+500mg/L脯氨酸+30g/L蔗糖+7-8g/L琼脂，pH 5.8)上筛选3周，再转入含50mg/L潮霉素和200mg/L头饱霉素的N6固体培养基上筛选4周，随后将抗性愈伤组织转入预分化培养基(N6培养基+1mg/L奈乙酸+2mg/L 6-苄基氨基嘌呤+5mg/L脱落酸)，光照培养3周，再转入分化培养基(N6培养基+1mg/L奈乙酸+2mg/L 6-苄基氨基嘌呤)上进行分化，将生长出的再生植株在壮苗培养基(1/2MS无机盐+0.5mg/L奈乙酸+0.25mg/L多效唑)上进行生根培养后移至温室中，在28℃、15小时/天的光照下培养1个月后取植株叶片，按常规方法提取总DNA，在正向引物5’-AGCTGCGCCGATGGTTTCTACAA-3’和反向引物5’-ATCGCCTCGCTCCAGTCAATG-3’的引导下，PCR扩增潮霉素磷酸转移酶基因，经扩增获得1kb DNA片段的为阳性转基因植株，检测结果表明用上述方法获得了分别转化有OsDREE1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C的转基因水稻。
实施例3、转基因T1代水稻植株的遗传分析和分子鉴定取实施例2收获的OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C的T1代转基因水稻的种子，用水浸种培养3天使其萌发，然后用25mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以未转基因水稻中花11作对照，筛选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性分离比，选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为3∶1的株系，结果表明获得了具有单位点插入的OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C转基因株系。
选取生长期为15天的单位点插入的转基因株系的植株，用Trizol试剂提取各植株总RNA，使用申能博彩公司的反转录试剂盒并参照试剂盒说明以总RNA(1μg)为模板反转录合成其cDNA，再以合成的cDNA为模板，以水稻actin基因(GenBank号P13362)为内源参照，利用相应的基因特异性引物，对转基因植株内源表达的OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C的表达水平进行半定量RT-PCR分析，检测目标基因是否过表达，以野生型水稻为对照(CK)，引物序列如下OsDREB1F-RT-F5’-TGTGTACGAGCAAACTAGAGGAGATC-3’OsDREB1F-RT-R5’-AACGTGCCGAGCCAGAGC-3’；
OsDREB1G-RT-F5’-CGCAAGCCACGACGACATAC-3’OsDREB1G-RT-R5’-CGCTACCTACGGCAGGATCAC-3’；OsDREB1H-RT-F5’-GCCGCTGCCGCCAAGAAC-3’OsDREB1H-RT-R5’-TCCCAAAGCAATGGCTCCTCAAG-3’；OsDREB1I-RT-F5’-TGCCAAGAGCCCCGACACCT-3’OsDREB1I-RT-R5’-TCCCACAGCATGGGCTCCTC-3’；OsDREB2B-RT-F5’-AATGTATGGTCCAATGGCTCG-3’OsDREB2B-RT-R5’-CGATTCAGCCTTGTCTTCATTAG-3’；OsDREB2C-RT-F5’-CTCCACCGTCACCAACAGCGT-3’OsDREB2C-RT-R5’-TCCTGCGATGTCGCTCATGTC-3’；检测水稻actin基因的引物ACTIN180-F5’-TCCGTGACATCAAGGAAAAGC-3’；ACTIN180-R5’-CCGATGAGAGAAGGCTGGAA-3’。
25μl RT-PCR反应体系为上、下游引物各0.5μl，cDNA 1μl，Taq酶0.3μl，dNTPs0.5μl，10×PCR缓冲液2.5μl，H2O 19.7μl。RT-PCR反应条件为先95℃预热5min，然后94℃ 1min，55℃ 40s，72℃ 1min，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，部分检测结果如图2所示(L1、L2、L3、L4、L5为同一基因的不同转基因植株)，表明OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C在各自的转基因植株内均获得高水平表达。
实施例4、转基因T1代植株耐旱性鉴定收获OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C T1代转基因水稻种子。用水浸种培养3天使其萌发，然后用25mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以未转基因水稻中花11作对照，筛选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性分离比，选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为3∶1的株系，结果表明获得了具有单位点插入的OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C转基因株系，将培养10天的苗进行干旱处理，同时设未转基因的水稻中花11植株作对照(WT)。将水稻幼苗种入装箱的土壤中，采用蛭石∶营养土混合比例为3∶1的混合土，土壤的含水量限定为55-65％之间(采用烘干法测量土壤含水量，根据土壤烘干前后土壤重量的差值计算土壤的含水量)。从处理即日起不再浇水，采用反复干旱法，即当同一培养箱中50％的幼苗表现出萎蔫时复水，使苗恢复，再干旱处理使之萎蔫，重复2-3次。此过程大约需要20-30天，直至绝大多数的未转基因水稻苗的叶片干枯、茎杆脱水弯曲、死亡，而各转基因株系的生长状态良好，叶片稍下垂，茎杆直立，停止筛选，复水培养。去除干旱协迫条件，在正常的复水培养条件下恢复生长15天后统计各转基因株系的成活苗数，计算耐旱苗比例，结果如图3A-图3F所示(横坐标为不同的转基因株系编号，纵坐标为耐旱苗百分比)，与野生型对照植株相比，OsDREB1H、OsDREB1I、OsDREB1F、OsDREB1G、OsDREB2B和OsDREB2C转基因水稻T1代植株对干旱胁迫的耐受性均明显提高，OsDREB1H、OsDREB1I、OsDREB1F、OsDREB1G、OsDREB2B和OsDREB2C转基因水稻T1代经耐旱处理后的植株与经耐旱处理后的未转基因对照植株如图4所示，筛选出的转基因耐旱苗在大田中继续生长获得T2代种子。
实施例5、转基因T1代植株耐盐性鉴定收获OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C T1代转基因水稻种子，用水浸种培养3天使其萌发，然后用25mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以未转基因水稻中花11作对照，筛选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性分离比，选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为3∶1的株系，结果表明获得了具有单位点插入的OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C转基因株系。继续培养10天后，将苗转移到大试管中，加入含有150mmol/L NaCl、pH值8.5～9.0的盐溶液，进行盐胁迫处理7天(28℃，2500lux，15h光照/9h)，期间每天更换盐溶液，以保持盐浓度和pH值的稳定，筛选7天后除去盐溶液，统计成活苗数，计算耐盐苗比例，结果如图5A-图5F所示(横坐标为不同的转基因株系编号，纵坐标为耐盐苗百分比)，同时以未转基因的中花11水稻苗为对照。实验结果显示，T1代转基因水稻植株对盐的耐受能力明显高于未转基因水稻植株，经盐处理后，OsDREB1H、OsDREB1I、OsDREB1F、OsDREB1G、OsDREB2B和OsDREB2C转基因水稻T1代阳性株系的植株恢复培养后能够继续生长，未转基因的中花11对照(WT)植株的叶片发黄、卷曲、干枯，茎杆不能直立，恢复培养后很快死亡(见图6)。
实施例6、转基因T1代植株耐低温性鉴定收获OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C T1代转基因水稻种子，用水浸种培养3天使其萌发，然后用25mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以未转基因水稻中花11作对照，筛选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性分离比，选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为3∶1的株系，结果表明获得了具有单位点插入的OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C转基因株系。继续培养10天后，将培养苗放入在4℃、2500lux，15h光照/9h条件下进行低温处理7天，然后恢复室温继续培养，同时以未转基因的中花11为对照，分别统计成活苗数，计算耐低温苗比例，结果如图7A-图7F所示。耐低温处理后的转基因T1代植株和对照植株如图8所示，4℃处理第7天后，阳性转基因株系的T1代植株仅叶尖部分稍有卷曲，室温培养后能够继续恢复生长，而未转基因的中花11对照(WT)植株的叶片发黄、卷曲、干枯，茎杆不能直立，室温培养后不能恢复生长，并很快死亡，表明转基因植株对低温的耐受抵抗能力明显高于未转基因植株。
实施例7、转基因T1代植株的经济性状检测取实施例4收获的OsDREB1G、OsDREB1H、OsDREB1I T2代转基因水稻在大田中种植，进行经济性状的检测，并与野生型水稻进行比对，检测项目包括有效分蘖数、穗长、穗重、结实率、千粒重和产量，并通过方差分析评定转基因水稻与未转基因对照水稻(WT)之间的差别，方法为对于转化有同一个基因的株系，取3个不同转基因株系的检测值，计算平均值，将其作为该基因转化植株的检测值；对于同一个转基因株系，取3个不同T2代转基因植株的检测值，计算平均值，将其作为该株系的检测值。具体测量方法如下(1)有效分蘖结实大于5粒的穗的总和；(2)穗长穗节至穗顶(不连芒)的长度；(3)穗重单穗的重量；(4)结实率每穗饱满粒数/每穗总粒数×100％；(5)千粒重1000粒饱满种子的质量；(6)产量单株收获的种子，晒干扬净后称重。
其中，OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H的转基因株系的检测结果如图9A-图9C所示(WT为野生型对照)，表1-表6的方差分析结果表明OsDREB1I转基因水稻的穗长、穗重和结实率与同试验区的WT的穗长、穗重和结实率差异显著，有效分蘖、千粒重和产量差异不显著；OsDREB1G转基因水稻与同试验区的WT在各项检测性状的差异均为不显著；OsDREB1H的穗长与同试验区的WT的穗长差异显著，其它性状差异不显著。上述检测结果表明，与野生型水稻相比，OsDREB1G、OsDREB1I和OsDREB1H转基因的水稻的经济性状，尤其是产量，没有明显变化。
表1 OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H转基因的水稻的有效分蘖数的方差分析结果
表2 OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H转基因的水稻的穗长的方差分析结果
表3 OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H转基因的水稻的穗重的方差分析结果
表4 OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H转基因的水稻的结实率的方差分析结果
表5 OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H转基因的水稻的结实率的方差分析结果
表6 OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H转基因的水稻的产量的方差分析结果
序列表<160>12<210>1<211>224<212>PRT<213>稻属水稻(Oryza sativa L.)<400>1Met Asp Val Ser Ala Ala Leu Ser Ser Asp Tyr Ser Ser Gly Thr Pro1 5 10 15Ser Pro Val Ala Ala Asp Ala Asp Asp Gly Ser Ser Ala Tyr Met Thr20 25 30Val Ser Ser Ala Pro Pro Lys Arg Arg Ala Gly Arg Thr Lys Phe Lys35 40 45Glu Thr Arg His Pro Val Phe Lys Gly Val Arg Arg Arg Asn Pro Gly50 55 60Arg Trp Val Cys Glu Val Arg Glu Pro His Gly Lys Gln Arg Ile Trp65 70 75 80Leu Gly Thr Phe Glu Thr Ala Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val85 90 95Ala Ala Leu Ala Leu Arg Gly Arg Ala Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp100 105 110Ser Pro Arg Arg Leu Arg Val Pro Pro Ile Gly Ala Ser His Asp Asp115 120 125Ile Arg Arg Ala Ala Ala Glu Ala Ala Glu Ala Phe Arg Pro Pro Pro130 135 140Asp Glu Ser Asn Ala Ala Thr Glu Val Ala Ala Ala Ala Ser Gly Ala145 150 155 160Thr Asn Ser Asn Ala Glu Gln Phe Ala Ser His Pro Tyr Tyr Glu Val165 170 175Met Asp Asp Gly Leu Asp Leu Gly Met Gln Gly Tyr Leu Asp Met Ala180 185 190Gln Gly Met Leu Ile Asp Pro Pro Pro Met Ala Gly Asp Pro Ala Val195 200 205Gly Ser Gly Glu Asp Asp Asn Asp Gly Glu Val Gln Leu Trp Ser Tyr210 215 220<210>2<211>675<212>DNA<213>稻属水稻(Oryza sativa L.)<400>2atggacgttt ctgctgcgct cagcagcgac tactcgtcgg ggacgccgtc gccggtggcg 60gccgacgccg acgacggctc ctccgcctac atgacggtgt cgtcggcgcc gcccaagcgg120cgagcggggc ggaccaagtt caaggagacg cggcaccccg tgttcaaggg cgtgcgccgg180aggaaccccg ggaggtgggt gtgcgaggtg cgcgagccgc acggcaagca gcggatatgg240ctcgggacgt tcgagacagc agagatggcg gcgcgcgcgc acgacgtcgc cgcgctcgcg300ctccgcggcc gcgccgcctg cctcaacttc gccgactcgc cgaggcgcct ccgcgtcccg360cccatcggcg caagccacga cgacatacgg agggcggcgg ctgaggcggc cgaggcattc420cggccgccac cagatgagag caatgcggcc accgaggtgg cagccgccgc atcgggcgcc480actaattcga acgccgaaca gttcgcctcc cacccgtact acgaggtcat ggacgatggg540ctggacttgg ggatgcaggg ctatctcgac atggcgcaag ggatgctcat tgacccgcct600ccaatggccg gtgatcctgc cgtaggtagc ggcgaagacg acaacgatgg cgaggtccag660
ctatggagct actga 675<210>3<211>217<212>PRT<213>稻属水稻(Oryza sativa L.)<400>3Met Asp Asp Ser His Asp Leu Ala Ser Pro Thr Ser Pro Asp Thr Ala1 5 10 15Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ala Thr Val20 25 30Ala Pro Lys Lys Arg Pro Arg Asn Asp Gly Arg His Pro Thr Tyr Arg35 40 45Gly Val Arg Met Arg Ser Trp Gly Lys Trp Val Ser Glu Ile Arg Glu50 55 60Pro Arg Lys Lys Ser Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Ala Thr Ala Glu65 70 75 80Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Ala Ile Lys Gly Arg85 90 95Thr Ala His Leu Asn Phe Pro Asp Leu Ala His Leu Leu Pro Arg Pro100 105 110Ala Thr Ala Ala Pro Lys Asp Val Gln Ala Ala Ala Leu Leu Ala Ala115 120 125Ala Ala Ala Asp Phe Pro Ser Val Ser Val Asp Ala Asn Ala Lys Ser130 135 140Pro Asp Thr Cys Ser Val Ala Ser Ala Ala Ser Pro Gln Pro Pro Pro145 150 155 160Pro Asp Ala Glu Ala Asp Pro Asp Ser Thr Leu Phe Asp Leu Pro Asp165 170 175Leu Leu Leu Asp Leu Arg Tyr Glu Thr Ser Ser Ser Leu Ser Cys Gly180 185 190Ala Ser Trp Ala Val Asp Asp Asp Val Ala Gly Gly Val Val Phe Arg195 200 205Leu Glu Glu Pro Met Leu Trp Asp Tyr210 215<210>4<211>654<212>DNA<213>稻属水稻(Oryza sativa L.)<400>4atggacgact cccacgacct ggcctccccg acctcccctg acacggcgtc ctcgtcgtct 60tcgtctacgt cgacatcatc gtcctccgcc accgtcgccc cgaagaagcg gccgcgcaac120gacggccggc acccgacgta ccgcggcgtg cgcatgcgga gctgggggaa gtgggtgtcc180gagatcaggg agccccgcaa gaagtcgcgc atctggctgg gcacgttcgc caccgcggag240atggccgcgc gcgcgcacga cgtggccgcg ctcgccatca agggccgcac cgcgcacctc300aacttcccgg acctcgcgca cctgctcccg cgcccggcca ccgcggcgcc caaggacgtg360caggcggcgg cgctgctcgc cgccgccgca gccgacttcc cctccgtctc cgtcgacgcc420aatgccaaga gccccgacac ctgctccgtc gccagcgccg cctcgccgca gccgccaccg480ccggacgccg aagcggaccc tgacagcacg ctgttcgacc tcccggacct gctcctggac540ctgagatacg agacgtcctc gagcctctcg tgcggggcgt cgtgggccgt cgatgacgac600gtggccggcg gcgtcgtgtt ccgcctcgag gagcccatgc tgtgggatta ctga 654<210>5
<211>289<212>PRT<213>稻属水稻(Oryza sativa L.)<400>5Met Ala Met Ala Lys Glu Leu Gln Glu Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser1 5 10 15Ser Ala Ala Ser Thr Ser Ser Cys Ser Ser Ala Val Thr Asp Ala Trp20 25 30Ser Ser Pro Ala Arg Pro Asn Ala Val Ala Gly Gly Lys Arg Lys Lys35 40 45Glu Val Val Gly Glu Ala Asp Glu Ala Ala Gly Gly Gly Ala Gly Glu50 55 60Glu Glu Glu Glu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Ala Gly Lys Ser Ser Ala65 70 75 80Ala Thr Lys Lys Arg Lys Arg Ser Ser Asp Gly Lys His Pro Val Tyr85 90 95Arg Gly Val Arg Met Arg Ala Trp Gly Lys Trp Val Ser Glu Ile Arg100 105 110Glu Pro Arg Lys Lys Ser Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala115 120 125Asp Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Ala Ile Lys Gly130 135 140Arg Ala Ala His Leu Asn Phe Pro Asp Leu Ala Gly Val Leu Pro Arg145 150 155 160Ala Ala Ser Ala Ser Pro Lys Asp Val Gln Ala Ala Ala Ala Leu Ala165 170 175Ala Ala Phe Thr Thr Ser Pro Ser Ser Ser Pro Ser Ser Ser Leu Ser180 185 190Ala Asp Asp Val Ala Pro Cys Val Val His Ala Asp Ala Asp Glu Gln195 200 205Pro Ala Ala Ala Ala Lys Asn Asp Asp Asp Asp Gly Ser Thr Thr Ala210 215 220Pro Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Glu Gln Gln Leu225 230 235 240Phe Asp Leu Pro Asp Leu Leu Phe Asp Ile Gln Asp Gly Pro Phe Gly245 250 255Phe Pro Ala Met Trp Ala Pro Leu Ala Asp Val Asp Glu Val Asn Ala260 265 270Glu Leu Arg Leu Glu Glu Pro Leu Leu Trp Asp Leu Gly Val Thr Asp275 280 285Ala<210>6<211>870<212>DNA<213>稻属水稻(Oryza sativa L.)<400>6atggccatgg cgaaggagct ccaagaaacc tcctcgtctt cgtcctcctc ggctgcctcc 60acgtcctcct gctcctccgc cgtcacggac gcgtggtcgt cgccggccag acccaatgct120gtggccgggg ggaagaggaa gaaggaggtg gtaggagagg ctgatgaggc tgcaggcggc180ggcgcaggag aggaggaaga ggaggaggcg gaggcggcgg cggcggggaa gtcgtcggcg240gcgacgaaga agaggaagcg gagcagcgac gggaagcacc cggtgtaccg cggcgtgcgg300atgcgggcgt gggggaagtg ggtgtcggag atccgcgagc cgcggaagaa gtcgcgcatc360tggctcggca cgttccccac cgccgacatg gccgcgcgcg cccacgacgt cgccgcgctc420
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1.来自水稻的与耐逆性相关的DREB类转录因子，是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)序列表中的SEQ ID NO3；3)序列表中的SEQ ID NO5；4)序列表中的SEQ ID NO7；5)序列表中的SEQ ID NO9；6)序列表中的SEQ ID NO11；7)将序列表中SEQ ID NO1、3、5、7、9或11的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控植物耐逆性功能的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的转录因子，其特征在于所述蛋白的氨基酸残基序列为序列表中的SEQ ID NO1、3、5、7、9或11。
3.编码权利要求1或2所述转录因子的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；2)序列表中SEQ ID NO4的DNA序列；3)序列表中SEQ ID NO6的DNA序列；4)序列表中SEQ ID NO8的DNA序列；5)序列表中SEQ ID NO10的DNA序列；6)序列表中SEQ ID NO12的DNA序列；7)编码序列表中SEQ ID NO1、3、5、7、9或11的DNA序列；8)与序列表中SEQ ID NO2、4、6、8、10或12限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有调控植物耐逆性功能的核苷酸序列；9)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO2、4、6、8、10或12限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO2、4、6、8、10或12。
6.含有权利要求3或4或5所述基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。
7.一种提高植物耐逆性的方法，是将权利要求3或4或5所述编码水稻与耐逆性相关的DREB类转录因子的基因或与所述基因具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列导入植物组织、细胞或器官，植物耐逆性获得提高。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述编码水稻与耐逆性相关的DREB类转录因子的基因或与该基因具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列通过含有该基因或与该基因具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列的植物表达载体导入植物组织、细胞或器官；用于构建所述植物表达载体的出发载体为GatewayTW系列载体、pBin系列载体、pBI系列载体、pCAMBIA系列载体、per8或pX6。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于以所述GatewayTW系列载体中的pH2GW7为出发载体构建的植物表达载体为pH2GW7 Vector-OsDREB1G、pH2GW7Vector-OsDREB1I、pH2GW7 Vector-OsDREB1H、pH2GW7 Vector-OsDREB1F、pH2GW7Vector-OsDREB2B或pH2GW7 Vector-OsDREB2C。
10.根据权利要求7-9任一项所述的方法，其特征在于所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。
全文摘要
本发明公开了一个来源于水稻的与耐逆性相关的DREB类转录因子及其编码基因与应用。该转录因子是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)序列表中的SEQ ID NO3；3)序列表中的SEQ ID NO5；4)序列表中的SEQ ID NO7；5)序列表中的SEQ ID NO9；6)序列表中的SEQ ID NO11；7)将序列表中SEQ ID NO1、3、5、7、9或11的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控植物耐逆性功能的蛋白质。本发明的蛋白及其编码基因将在植物的耐逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号C12N15/29GK101062943SQ20071009894
公开日2007年10月31日 申请日期2007年4月29日 优先权日2007年4月29日
发明者王喜萍, 孟秀萍, 黄晓翠, 刘春霞, 辛莉, 张嘉瑶, 杨建宇, 夏勉, 邓兴旺 申请人:北京未名凯拓农业生物技术有限公司 被以下专利引用 (1),