专利名称：来源于烟曲霉的与活性氧杀伤相关蛋白及其编码基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种来源于烟曲霉的与活性氧杀伤相关蛋白及其编码基因。
背景技术：
随着高效广谱抗生素的广泛应用，抗肿瘤治疗的深入开展，器官移植和外科其它介入性治疗的不断实施，皮质类固醇激素的广泛应用，以及AIDS患者的不断增多，侵袭性曲霉病(Invasive aspergillosis，IA)的发生呈现出上升趋势，而且病情十分严重，在白血病和骨髓移植受者等重症免疫受损(immunocompromised)机体中的死亡率常超过90％，已经成为这群患者发生死亡的主要原因。这种情况的出现，主要与IA的发病机制不十分清楚，IA的诊断手段不十分精确可靠，最主要的是与IA药物治疗效果欠佳，有着密切的关系。
IA主要由烟曲霉感染引起，烟曲霉是一种单倍体的丝状真菌；由于烟曲霉对人类健康的重大影响，美国和英国学者联合展开了对其基因组的测定工作，并于2005年底完成；结果表明，烟曲霉有8条染色体；总大小为29.2Mb；经与其它物种基因组序列相比较，发现有可能的蛋白编码序列9922CDS，其中约一半属于已知的蛋白家族(www.sanger.ac.uk)，另外一半则属于新基因。尽管通过检索www.tigr.org可以获得烟曲霉基因组方面的资料，但是烟曲霉某特定基因所对应于这些基因序列的具体哪些部分，却仍然是广大科学工作者努力解读和破译的重要内容，而阐明这些基因序列的功能对于IA的发病机制、诊断手段以及治疗措施的实施，具有重要的意义。
目前被批准用于治疗侵袭性曲霉感染的药物有二性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑(Voriconazole)、卡泊芬净与米卡芬净。
反应活性氧(reactive oxygen species，ROS)是指化学活性远高于基态氧的某些特殊氧化学状态或某些含氧化合物，不仅包括氧中心自由基如O2-··，和·OH，而且也包括某些氧的非自由基衍生物，如H2O2、单线态氧和次氯酸，甚至还包括过氧化物、氢过氧化物和内源性脂质及外来化合物的环氧代谢物，因为它们都含有化学性质活泼的含氧功能基团。甲萘醌(也称维生素K3)是通过产生超氧化物间接氧化glutathione活性氧。
发明内容
本发明的目的是提供一种来源于烟曲霉的与活性氧杀伤相关蛋白及其编码基因。
本发明所提供的来源于烟曲霉的与活性氧杀伤相关蛋白，名称为FAP1，来源于烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与活性氧杀伤相关的由(a)衍生的蛋白质。
其中，序列表中的序列2由615个氨基酸残基组成。
实验证明，由序列表中序列2的自氨基末端第1至316位氨基酸残基序列组成的多肽(名称为FAP1R)，也与活性氧杀伤相关，是FAP1的活性片段。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列2的自氨基末端第1至316位外进行取代和/或缺失和/或添加。
为了使(a)中的FAP1便于纯化，可在由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
上述(b)中的FAP1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的FAP1的编码基因可通过将序列表中SEQ ID №1的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述来源于烟曲霉的与活性氧杀伤相关蛋白的编码基因(FAP1)也属于本发明的保护范围。
所述来源于烟曲霉的与活性氧杀伤相关蛋白的编码基因，其核苷酸序列是编码序列表中序列2的蛋白质的多核苷酸。
所述来源于烟曲霉的与活性氧杀伤相关蛋白的编码基因的编码序列可为序列表中序列1的自5′末端第1位至1848位脱氧核糖核苷酸组成的核苷酸序列。
所述来源于烟曲霉的与活性氧杀伤相关蛋白的编码基因，具体可为如下1)或2)的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1或序列表中的序列3的自5′端第1476至3464位脱氧核糖核苷酸；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述来源于烟曲霉的与活性氧杀伤相关蛋白的DNA分子。
所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。
序列表中的序列1是FAP1的cDNA序列。序列表中的序列3是FAP1的基因组DNA序列及其侧翼序列。
含有上述来源于烟曲霉的与活性氧杀伤相关蛋白的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系和转基因宿主菌也属于本发明的保护范围。
烟曲霉孢子吸入机体肺泡后，与免疫防御系统相互作用时，产生抵抗并进一步逃脱机体中性粒细胞和肺泡巨噬细胞释放的ROS的杀伤的过程，是最终引起侵袭性感染的十分重要的环节。本发明证实，烟曲霉FAP1基因的破坏导致烟曲霉对环境中ROS过度敏感，说明FAP1及其编码基因与烟曲霉抵抗分解ROS密切相关，提示FAP1及其编码基因参与了烟曲霉抵抗宿主天然防御系统中肺泡巨噬细胞和中性粒细胞释放ROS杀伤的过程，是一个重要的新型的毒力因子。实验证明FAP1基因的破坏，使烟曲霉对ROS过度敏感，但不影响烟曲霉对常用抗真菌药物的敏感性，说明通过破坏FAP1基因，抑制FAP1所导致的ROS等物质对烟曲霉抑制活性增强的过程，与传统常用抗真菌药物的作用过程不同，因此烟曲霉FAP1及其活性片段，和/或它们的编码基因是一个新型的抗真菌药物作用靶点，为发现新型抗真菌药物作用靶位，发展高效低毒的抗真菌药物(特别是预防和/或治疗侵袭性曲霉病的药物)奠定了基础。
图1A为引物p1和p2PCR鉴定FAP1基因被敲除的阳性转化子图1B为引物p3和p4PCR鉴定FAP1基因被敲除的阳性转化子图2A为斑点法测定FAP1基因破坏株烟曲霉(Δfap1)、FAP1基因互补株(MC)、FAP1活性片段株(TR)对H2O2的敏感性图2B为斑点法测定Δfap1、MC、TR对Menadione的敏感性
具体实施例方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、烟曲霉的与活性氧杀伤相关的蛋白及其编码基因的获得发明人利用生物信息学方法从烟曲霉基因组(www.tigr.org/tdb/e2k1/afu1/)中检索出了与白念珠菌、酿酒酵母、裂殖酵母的AP-1基因同源的烟曲霉可能的AP-1基因，发现烟曲霉可能的AP-1基因(即FAP1基因)位于5号染色体上，其核苷酸序列是序列表中的序列1，编码的氨基酸序列是序列表中的序列2。
在此基础上，发明人从烟曲霉可能的AP-1基因的编码序列上游即5‘-端约1.0kb处和其下游即3‘-端约1.0kb处设计引物FAP1u-F5’-gtcaGGGCCCGAGGACGTGGTGGTTTCAGT-3’和FAP1u-R5’-tgagGGGCCCGCTGCTGAAGCTATCCCAAC-3’(小写字母为酶切位点保护序列)；以烟曲霉(Aspergillus fumigatus)AF293(#1100，购自美国Fungal Genetics StockCenter)的基因组DNA为模板，进行聚合酶链反应(PCR)，得到的扩增产物的大小约为4.8kb。然后，将该扩增产物经过DNA重组的策略，与质粒pBluescript SK+(购自Stratagene)进行重组、序列测定，测序结果表明，该PCR扩增产物的核苷酸序列是序列表中的序列3。自序列3的5′端第1至1475位脱氧核糖核苷酸为FAP1基因5’侧翼序列，自序列3的5′端第1476至3464位脱氧核糖核苷酸为FAP1基因ORF序列，自序列3的5′端第3465至4812位脱氧核糖核苷酸为FAP1基因侧翼序列，自序列3的5′端第1至20位脱氧核糖核苷酸为引物序列，自序列3的5′端第4893至4812位脱氧核糖核苷酸为引物序列。
证实FAP1基因与白念珠菌、酿酒酵母、裂殖酵母的AP-1基因高度同源。
以由烟曲霉(Aspergillus fumigatus)AF293(#1100，购自美国FungalGenetics Stock Center)的总RNA反转录得到的cDNA为模板，利用引物FAP1-cDNA-F5’-TCAGGTACCATGGCGGACTACAATACTCT-3’，FAP1-cDNA-R5’-ATTTGACGCGACCCATGA-3’进行聚合酶链反应(PCR)，扩增产物进行琼脂糖电泳分离，回收并克隆到pMD 18-T Vector载体上，进行测序分析，测序结果表明，该PCR扩增产物具有序列表中序列1的核苷酸序列，是FAP1的cDNA序列。FAP1的cDNA序列长度为1848bp。FAP1的编码序列为自序列表中序列1的5′端的第1位至第1845位脱氧核苷酸(1846-1848为终止密码子)，编码615个氨基酸(序列表中序列2)。
实施例2、与活性氧杀伤相关的蛋白功能的验证一、对烟曲霉FAP1基因进行了破坏，具体方法如下1、FAP1基因破坏载体的构建(1)含有FAP1基因的重组质粒pfap1的构建以烟曲霉(Aspergillus fumigatus)AF293(#1100，购自美国Fungal GeneticsStock Center)的基因组DNA为模板，PCR扩增FAP1基因片段。该FAP1基因片段由3’侧翼序列(1475bp)、FAP1 ORF(1989bp)和5’侧翼序列长度为(1348bp)组成。上下游引物均引入ApaI酶切位点。引物序列如下FAP1u-F5’-GTCAGGGCCCGAGGACGTGGTGGTTTCAGT-3’，FAP1u-R5’-TGAGGGGCCCGCTGCTGAAGCTATCCCAAC-3’。
PCR产物大小约为4.8kb。质粒pBluescript SK+(Stratgene)和PCR产物分别用ApaI进行酶切，然后将酶切产物用T4DNA连接酶进行连接，并转化感受态大肠杆菌DH10B。挑选阳性转化子，用ApaI酶切、PCR扩增及测序鉴定证实PCR产物克隆到pBluescript SK+(Stratgene)的ApaI位点上，PCR产物的序列如序列表中序列3所示；重组的质粒命名为pFAP1。
(2)pyrG基因的扩增及其与pFAP1质粒的重组以构巢曲霉A90(美国FungalGenetics Stock Center)的基因组DNA为模板，PCR扩增其pyrG基因，双侧引物均引入NcoI酶切位点(黑色下划线示)pyrG u-F5’-ACTCCATGGGTCAATACCGTTACACATTTCCA-3’pyrG u-R5’-TCACCATGGCCGCAGACAATGCTCTCTATC-3’。然后用NcoI分别酶切该PCR产物和质粒pFAP1，将酶切产物用T4DNA连接酶进行连接，并转化感受态大肠杆菌DH10B。挑选阳性转化子，用酶切、PCR扩增及测序鉴定证实PCR产物重组到了pFAP1上，重组的质粒命名为pfap1:pyrG。
2、烟曲霉FAP1基因的破坏烟曲霉AF293.1(#1137，购自美国Fungal Genetics Stock Center)为来源于进行基因测序的烟曲霉AF293(#1100，购自美国Fungal Genetics Stock Center)的尿嘧啶营养缺陷株，该菌株必须在含有尿嘧啶的培养基上，或者是在补充了pyrG基因时才能生长，因此，含有pyrG基因的质粒pfap1:pyrG转化烟曲霉AF293.1时可以在不含有尿嘧啶的基础培养基上筛选阳性转化子。
将烟曲霉尿嘧啶营养缺陷株AF293.1孢子接种到含有尿嘧啶和尿苷的丰富培养基MAG液体(20g/L麦芽浸汁，2g/L蛋白胨，1g/L葡萄糖，1mg/L吡咯沙敏，8.8mg/L核黄素)中，孵育到萌芽期(Germination phase)，然后以Glucanex等对细胞壁有消化作用的酶进行处理并制备原生质体；将重组质粒pfap1:pyrG，用聚乙二醇-甘油法转化到烟曲霉尿嘧啶营养缺陷株AF293.1原生质体中后，在不含有尿嘧啶的基础培养基MM(葡萄糖10g/L，NaNO3300g/L，KCl 26g/L，MgSO4:7H2O24.65g/L，KH2PO468g/L，K2HPO487.1g/L，琼脂20g/L)上筛选得到阳性转化子—转化pfap1:pyrG的烟曲霉AF293.1(能在MM中生长)。
3、阳性转化子的验证----PCR法提取烟曲霉阳性转化子的基因组DNA，以PCR法鉴定该阳性转化子是否已经获得FAP1基因破坏。PCR扩增方法筛选发生同源重组的转化子。①设计一对引物(p1、p2)，扩增FAP1基因上的一段548bp(自序列3的5′端第2156位至2703位脱氧核糖核苷酸)的DNA片段，如果FAP1基因被敲除，该DNA片段则不能被扩增出(图1A)。PCR引物为p15’-GGACGATGGAGAGTCTGAGC-3’和P25’-CCAAGAGAACGGACTTCTGC-3’。②设计1对引物(p3、p4)，该引物对中有一个引物在FAP1基因敲除盒子以外的染色体序列上退火，另一个引物在筛选标记pyrG上退火。如FAP1基因敲除掉，则该对引物应能扩增出产物(图1B)。验证FAP1敲除用引物p35’-TCAACTCTCCCCTCTGTGCT-3’，p45’-CAGCTTCTCCAGCCACTACC-3’，产物大小为2407bp。
结果如图1A和1B所示，表明确实获得了FAP1基因破坏的烟曲霉株(以Δfap1表示)。图1A中，1.Marker(100ladder DNA marker，博迈生物医学技术有限公司)，2.为野生株烟曲霉AF293对照，3、4为未敲除掉FAP1的转化子，5为敲除掉FAP1的转化子。图1B中，1为FAP1基因破坏株，2、3为FAP1未被破坏转化子，4为(100ladder DNA marker，博迈生物医学技术有限公司)。
二、FAP1基因与活性氧杀伤相关的蛋白功能的验证1、阳性转化子对ROS敏感性的测定用斑点实验法(spot assay)分别测定FAP1基因破坏的烟曲霉阳性转化子和烟曲霉AF293(#1100，购自美国Fungal Genetics Stock Center)对甲萘醌(menadione)和H2O2这两种ROS的敏感性。具体实验方法如下在含有如图2A所示不同浓度的H2O2或如图2B所示不同浓度的Menadione的MM培养基(葡萄糖10g/L，NaNO3300g/L，KCl 26g/L，MgSO4:7H2O 24.65g/L，KH2PO468g/L，K2HPO487.1g/L，琼脂20g/L)中央接种孢子5μl(1×105个/ml)，培养皿在37℃孵育72h。结果如图2A和2B所示，野生株(烟曲霉AF293，在图2A和2B中以WT表示)，在2.0mM的H2O2或15μM的Menadione存在时可以存活；而FAP1基因破坏的烟曲霉阳性转化子(在图2A和2B中以Δfap1表示)，在2.0mM的H2O2或10μM的Menadione存在时全部被杀死而不能存活。
用微量液基稀释法测定FAP1基因破坏的烟曲霉阳性转化子对常用抗真菌药物两性霉素B(Amphotericin B，AMB)、伊曲康唑(Itraconazole，ITC)、伏立康唑(Voriconazole，VOR)、卡泊芬净(Caspofungin，CAS)，和常见的ROS甲萘醌(Menadione)、H2O2的敏感性。具体实验方法如下参照美国临床与实验室标准化委员会(CLSI)的M38-A方案进行。培养基为RPMI 1640液体培养基，以终浓度为0.165mol/l的MOPS为缓冲液，调整培养基在25℃时pH值为7.0±0.1。各种抗真菌药物和ROS的工作浓度如下，AMB、ITC、VOR和CAS16-0.03μg/ml，H2O216-0.03mM，Menadione16-0.03μM。曲霉孢子菌悬液调整浓度至2×106个孢子/ml，再用RPMI1640稀释50倍。取100μl菌液接种到96孔板，最终96孔药敏板上每孔接种的孢子量为2×104个孢子/ml。药敏板于35℃下孵育48h读取结果；MIC定义为肉眼直接观察到的无真菌生长的最低药物浓度。结果如表1所示，表明FAP1基因破坏不影响烟曲霉对常用抗真菌药物的敏感性，只提高了烟曲霉对ROS的敏感性。表1中，抗真菌药物两性霉素B(AMB)、伊曲康唑(ITC)、伏立康唑(VOR)和卡泊芬净(CAS)的浓度单位为μg/ml，H2O2浓度单位为mmol/L，Menadione浓度单位为μmol/L。表1中，野生株(烟曲霉AF293)以WT表示，FAP1基因破坏的烟曲霉阳性转化子以Δfap1表示。
表1.各种抗真菌药物和氧化剂对烟曲霉Δfap1株的最小抑菌浓度
2、FAP1基因破坏烟曲霉的FAP1基因的互补以烟曲霉AF293(#1100，购自美国Fungal Genetics Stock Center)的基因组DNA为模板，利用FAP1u-F和FAP1u-R PCR扩增FAP1基因片段。该FAP1基因片段由3’侧翼序列(1348bp)、FAP1 ORF(1989bp)和5’侧翼序列长度为(1475bp)组成。上下游引物分别引入NotI和SmalI酶切位点。引物序列如下FAP1u-F5’-GTCAGGGCCCGAGGACGTGGTGGTTTCAGT-3’，FAP1u-R5’-TGAGGGGCCCGCTGCTGAAGCTATCCCAAC-3’。
将获得的PCR产物与pRG3-AMA1-NotI(购自美国Fungal Genetics StockCenter)载体分别用NotI和SmalI酶切后，用T4DNA连接酶进行连接，并转化感受态大肠杆菌DH10B(购自Stratgene)。挑选阳性转化子，用酶切、PCR扩增及测序鉴定证实该PCR产物重组到了pRG3-AMA1-NotI载体上(AMA1保证该载体自主复制但不整合到染色体上)，重组的质粒命名为pRG3-AMA1-FAP1。
由于Δfap1不能耐受1mM H2O2，而野生株烟曲霉AF293则可以，所以选择含1mMH2O2的培养基做为筛选培养基，将pRG3-AMA1-FAP1转化到Δfap1。制备烟曲霉Δfap1株原生质体方法，除培养基为MAG(20g/L麦芽浸汁，2g/L蛋白胨，1g/L葡萄糖，1mg/L吡咯沙敏，8.8mg/L核黄素)外，其它同烟曲霉AF293.1原生质体制备。方法如下取50μl Δfap1原生质体和5μg pRG3-AMA1-FAP1，加入到50μl转化液，置于冰上20min；再加入500μl转化液，室温放置30min；将以上菌液加入到3ml含1mM H2O2及1mol/l蔗糖的基础琼脂培养基(minimal medium，MM)中(为防止凝固，培养基在水浴锅中保持47℃)，混匀后再倾倒在含0.2mol/l蔗糖的MM培养皿中，37℃培养48h。以转化pRG3-AMA1-NotI的Δfap1作对照。
pRG3-AMA1-FAP1和pRG3-AMA1-NotI转化Δfap1的得到的转化子(分别命名为MC、E)传代到含有2.0mM的H2O2和10μM的Menadione的基础培养基上，结果表明转化了pRG3-AMA1-FAP1的烟曲霉Δfap1生长良好，而转化了pRG3-AMA1-NotI的烟曲霉不能生长。
烟曲霉基因转化系统是研究烟曲霉致病机制和发展新型抗真菌药物研究十分有用的分子遗传学手段和最为活跃的领域；该技术包括一个带有选择标志的载体，以及将该载体导入宿主菌的转化程序。目前烟曲霉(Aspergillus fumigatus)基因转化系统所应用的选择标志有显性选择标志，如潮霉素(hygromycin)和phleomycin，营养缺陷标志如pyrG基因和niaD基因等。发明人发现，以破坏FAP1基因的烟曲霉为受体菌，以烟曲霉FAP1基因为阳性选择标志，以H2O2或者Menadione(维生素K3)为筛选试剂，可以发展一种新型的烟曲霉基因转化系统，为烟曲霉的分子遗传学操作开辟了新的途径。
实施例2、FAP1蛋白活性区域的克隆与功能验证以烟曲霉(Aspergillus fumigatus)AF293(#1100，购自美国Fungal GeneticsStock Center)的基因组DNA为模板，利用引物Fap1-TR-F和Fap1-TR-R PCR扩增FAP1基因的活性区域FAP1-R(自序列3的5′端第1476位至2805位脱氧核糖核苷酸，编码FAP1的1-316氨基酸)及其上游侧翼序列(自序列3的5′端第423位至2805位脱氧核糖核苷酸)扩增出来，再克隆到能自主复制的穿梭质粒pRG3-AMA1-NotI(购自美国Fungal Genetics Stock Center)的BamHI和SphI酶切位点间，连接成功的质粒命名为pRG3-AMAI-NotI-TR。其中，Fap1-TR-F5’-ATTAGGATCCGATTTCTAAGCACCGGGTCA-3’，Fap 1-TR-R5’-GCTATAGGTGCATGCTTAGGGAGTGCTACTCT-3’(上下游分别引入BamHI、SphI酶切位点)。其中下游引物引入终止密码子TAA。将该质粒转化到烟曲霉Δfap1，得到的转化子命名为TR。
用斑点实验法(spot assay)分别测定如下菌株对甲萘醌(menadione)和H2O2这两种ROS的敏感性烟曲霉AF293(以WT表示)，实施例1中的FAP1基因破坏的烟曲霉阳性转化子(以Δfap1表示)、转入pRG3-AMA1-FAP1的Δfap1转化子MC及转入pRG3-AMA1-NotI的Δfap1转化子E和转化子TR。具体实验方法如下在含有如图2A所示不同浓度的H2O2或如图2B所示不同浓度的Menadione的MM培养基(葡萄糖10g/L，NaNO3300g/L，KCl 26g/L，MgSO4:7H2O 24.65g/L，KH2PO468g/L，K2HPO487.1g/L，琼脂20g/L)中央接种孢子5μl(1×105个/ml)，培养皿在37℃孵育72h。结果如图2A和2B所示，表明野生株(烟曲霉AF293，以WT表示)在2.0mM的H2O2或15μM的Menadione存在时可以存活；而FAP1基因破坏的烟曲霉阳性转化子Δfap1和转入空白对照载体pRG3-AMA1-NotI的FAP1基因破坏的烟曲霉(以E表示)在2.0mM的H2O2或10μM的Menadione存在时全部被杀死而不能存活；转入pRG3-AMAI-NotI-TR的阳性转化子TR和转入pRG3-AMA1-FAP1的Δfap1转化子MC在2.5mM的H2O2或30μM的Menadione存在时可以存活(图2A和2B)。说明含多个拷贝FAP1基因、FAP1基因活性区域的烟曲霉对上述氧化剂耐受性增强。
序列表<160>3<210>1<211>1848<212>DNA<213>烟曲霉(Aspergillus fumigatus)<400>1atggcggact acaatactct ttatcaacaa ggtctttatc tctcccccga tcaacaggac 60ctcctcctcg cagctctttc atcgaacaac ccgactcaga aacaacaaac agtgacgcac120aactccgaag ccaaccagaa cctcaatcac acacccggcc atgcttcttc cggtagcttc180agtgtttctc cccccagtgg tttggacggc tcggtgaatc agtcaactac tttcggctac240gaagatagtc cttacctgga tctgaatccc gacttcgacc ttgattttct gggcaacgag300agcttgattg gtgatctgcc cccgagcttg ccttcgactg aagactatga gcctggtgat360aagcgaaagg atatcgatgg acaagtaaat gacaaagagg attcgggcaa gaagcgacgg420gagagcgatg agaaagcagc caagaagcct ggtagaaagc cactgacctc ggaacctact480tcgaagcgca aggctcagaa tcgcgcagct cagcgagcct tccgggagcg gaaagaaaag540cacctgaagg atctggaggc caaggtggag gagctacaga aagcttctga taatgcaaac600caagagaacg gacttctgcg cgctcaggtg gagcgtttac aactagagct caaggagtat660cgcaagcgtc tctcctgggt aacgagcacc agcggcctct ctcctgttaa tgctatccca720ggtgcatact ccaaaggcat gtatggtctg aacaataatg agttcatgtt cgacttcccc780aagttcgggg atctgcccgg ttcacacttg ttcaccaata cgcaaacaag caagtcgaat840cagaacaaag cgaaggacaa cccgacagca actccacgta gcgaagctca ggtccccggt900gtcctcaacc gcaacgatct gaaaatctcg agccccaacg gcctttccaa cggaccatca960cccgccaagt ccacaccaag cggccagaca ccgaattcgc aaacatctac acgacctggc 1020tctggtacat tgaacggagc cgttgataac aatggagctg ccaggggcta ccaggtcaat 1080tcgtcgtaca gcgcgagcac aaagcaggca acccacgata cccctagctc agactctcca 1140tcgtcctctt cagattcgca ccagagccag ctgctctctt ccaatgggac ctcacctgag 1200ccatctttgc actcgcctgc cgtaaaggcg actgagagta gcactcccca tgcatgcacc 1260
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Glu Asp Ser Pro Tyr Leu Asp Leu Asn Pro Asp Phe Asp Leu Asp Phe85 90 95Leu Gly Asn Glu Ser Leu Ile Gly Asp Leu Pro Pro Ser Leu Pro Ser100 105 110Thr Glu Asp Tyr Glu Pro Gly Asp Lys Arg Lys Asp Ile Asp Gly Gln115 120 125Val Asn Asp Lys Glu Asp Ser Gly Lys Lys Arg Arg Glu Ser Asp Glu130 135 140Lys Ala Ala Lys Lys Pro Gly Arg Lys Pro Leu Thr Ser Glu Pro Thr145 150 155 160Ser Lys Arg Lys Ala Gln Asn Arg Ala Ala Gln Arg Ala Phe Arg Glu165 170 175Arg Lys Glu Lys His Leu Lys Asp Leu Glu Ala Lys Val Glu Glu Leu180 185 190Gln Lys Ala Ser Asp Asn Ala Asn Gln Glu Asn Gly Leu Leu Arg Ala195 200 205Gln Val Glu Arg Leu Gln Leu Glu Leu Lys Glu Tyr Arg Lys Arg Leu210 215 220Ser Trp Val Thr Ser Thr Ser Gly Leu Ser Pro Val Asn Ala Ile Pro225 230 235 240Gly Ala Tyr Ser Lys Gly Met Tyr Gly Leu Asn Asn Asn Glu Phe Met245 250 255
Phe Asp Phe Pro Lys Phe Gly Asp Leu Pro Gly Ser His Leu Phe Thr260 265 270Asn Thr Gln Thr Ser Lys Ser Asn Gln Asn Lys Ala Lys Asp Asn Pro275 280 285Thr Ala Thr Pro Arg Ser Glu Ala Gln Val Pro Gly Val Leu Asn Arg290 295 300Asn Asp Leu Lys Ile Ser Ser Pro Asn Gly Leu Ser Asn Gly Pro Ser305 310 315 320Pro Ala Lys Ser Thr Pro Ser Gly Gln Thr Pro Asn Ser Gln Thr Ser325 330 335Thr Arg Pro Gly Ser Gly Thr Leu Asn Gly Ala Val Asp Asn Asn Gly340 345 350Ala Ala Arg Gly Tyr Gln Val Asn Ser Ser Tyr Ser Ala Ser Thr Lys355 360 365Gln Ala Thr His Asp Thr Pro Ser Ser Asp Ser Pro Ser Ser Ser Ser370 375 380Asp Ser His Gln Ser Gln Leu Leu Ser Ser Asn Gly Thr Ser Pro Glu385 390 395 400Pro Ser Leu His Ser Pro Ala Val Lys Ala Thr Glu Ser Ser Thr Pro405 410 415His Ala Cys Thr Tyr Thr Thr Ile Asn Gly Glu Glu Ser Phe Cys Ala420 425 430
Gln Leu Ser Met Ala Cys Gly Asn Ile Asn Asn Pro Ile Pro Ala Val435 440 445Arg Gln Asn Ser Glu Ser Ala Ser Asn Thr Pro Ser His Ala Asn Ser450 455 460Ser Asp Lys Ala Leu Gly Leu Asp Phe Phe Ala Gln Gln Asn Gly Gly465 470 475 480Gln Phe Asp Pro Val Leu Phe Gly Asp Trp Arg Glu Pro Gln Asp Ala485 490 495Ile Leu Ser Gln Asp Phe Gly Thr Phe Phe Asp Asp Ala Phe Pro Leu500 505 510Pro Asp Leu Gly Ser Pro Ser His Asn Phe Ser Glu Ala Thr Lys Gln515 520 525Pro Ala Ala Pro Lys Lys Asp LeuIle Ala Glu Ile Asp Ser Lys Leu530 535 540Asp Glu Asp Glu Glu Val Val Pro Gly Glu Asp Lys Ser Gln Met Leu545 550 555 560Thr Cys Asn Lys Ile Trp Asp Arg Leu Gln Ser Met Glu Lys Phe Arg565 570 575Asn Gly Glu Ile Asp Val Asp Asn Leu Cys Ser Glu Leu Arg Thr Lys580 585 590Ala Arg Cys Ser Glu Gly Gly Val Val Val Asn Gln Lys Asp Val Glu
595 600 605Asp Ile Met Gly Arg Val Lys610 615<210>3<211>4812<212>DNA<213>烟曲霉(Aspergillus fumigatus)<400>3gctgctgaag ctatcccaac tatccctcca gagcaggtag tagatacaga acaacgccct 60caacgggcac ccccacgctg cagtgactgc catattctag gccataggcg attgcaatgt120ccgcagcgca agaataacta gatttagtaa taaaatcatg ttttaggggt tcaaaatagc180ctccaatttc ggccgcggcc aaattctatg gtatggtgat ccgctcggtt gcgtgatccg240ctcgcttacc gattacgtta attagtaact aagcaagcaa gtttaatttc ccccggttga300aagagggacc attgcacgga agtagcaagt cagcttctga ctgagcattt ctatggctgg360aactagataa tatggcgcgt ggaacttcgt cggcacggag agaaccaata tccggccaaa420tgtgatttct aagcaccggg tcactcaaaa tttccgctct aaagcagcgg gagccatcag480atacaaccat tggcttccat ctatctactg gcccttgttc aaccaataaa agctatcgac540aattgacgct gcctttctgc acccaatttg ccccccatga tcctatggaa acacccatcc600taagactggc ctaaggcgtt gattgattgc cttgtgaacc gctccatcgc cgcccccgtc660ttcttggaaa agtggaaaat gatggccttc ggtttcatcc ttgtaccacc tcccctctca720gccacgtctc tctcacttca cctattctca tcagtagaat cccctgtctc aattcccact780tcgaatctct tcatctccgc aggcttcttc ctggcctgaa aatcaatcac tcatatccaa840cgacctattc tcaatcggac cctgatttgc cgctttcggc agcccctcat cgccagctat900caagcggtac cgctgcgcca ttccactcta tacgacatct ttccatctga cactaggcca960ctaggccaca ctctggcatc agctcttggc cgctgcaacc ttttatctta atctcaccac 1020cttttttttg accctttcgc tgccactgta cttctcatcg actctcctcc gtcatcaatt 1080ctttcgctca tattgtgata tctcattcga ctcgcttgga gagcctggaa tccgcttgac 1140tgtatctttt ctgattgtcc cacattccct tttgtcttca catcaacggg attgatgcct 1200tgttgaagcg gggtggaatc ataagagctt tagtggcctt tccgtcttca tcagcattta 1260
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1.来源于烟曲霉的与活性氧杀伤相关蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与活性氧杀伤相关的由(a)衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于所述来源于烟曲霉的与活性氧杀伤相关蛋白的活性片段是由序列表中序列2的自氨基末端第1至316位氨基酸残基序列组成的多肽。
3.权利要求1所述的来源于烟曲霉的与活性氧杀伤相关蛋白的编码基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述来源于烟曲霉的与活性氧杀伤相关蛋白的编码基因，为如下1)或2)的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1或序列表中的序列3的自5′端1476至3464位脱氧核糖核苷酸；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述来源于烟曲霉的与活性氧杀伤相关蛋白的DNA分子。
5.含有权利要求3或4所述的来源于烟曲霉的与活性氧杀伤相关蛋白的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或转基因宿主菌。
6.权利要求1所述的来源于烟曲霉的与活性氧杀伤相关蛋白，和/或权利要求1所述的来源于烟曲霉的与活性氧杀伤相关蛋白编码基因在筛选抗真菌药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述抗真菌药物为预防和/或治疗侵袭性曲霉病的药物。
8.权利要求1所述的来源于烟曲霉的与活性氧杀伤相关蛋白的活性片段，是由序列表中序列2的自氨基末端第1至316位氨基酸残基序列组成的多肽。
9.权利要求8所述的活性片段的编码基因。
10.权利要求8所述的活性片段和/或权利要求8所述的活性片段的编码基因，在筛选抗真菌药物中的应用；所述抗真菌药物为预防和/或治疗侵袭性曲霉病的药物。
全文摘要
本发明公开了一种来源于烟曲霉的与活性氧杀伤相关蛋白及其编码基因。该来源于烟曲霉的与活性氧杀伤相关蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与活性氧杀伤相关的由(a)衍生的蛋白质。该来源于烟曲霉的与活性氧杀伤相关蛋白，是一个新型的抗真菌药物作用靶点，为发现新型抗真菌药物作用靶位，发展高效低毒的抗真菌药物奠定了基础。
文档编号C12N15/31GK101062942SQ20071009894
公开日2007年10月31日 申请日期2007年4月29日 优先权日2007年4月29日
发明者刘伟, 乔建军, 李若瑜 申请人:北京大学第一医院