专利名称：鱼类卵黄蛋白原基因及其编码蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鱼类卵黄蛋白原基因及其编码蛋白与应用。其目的是
提供一种鱼类卵黄蛋白原基因及其编码蛋白与其在^r测鱼类生殖方面的 疾病、调控鱼类生殖能力以及4全测水生环境化学品毒性中的应用。本发明 属于分子生物学及生物化学领域。
背景技术：
卵黄蛋白原(VTG)是特异地存在于非哺乳类性成熟的卵生雌性动物 血液中的一种蛋白，在内源雌二醇作用下的肝脏中产生，是几乎所有卯生 动物卵黄蛋白的前体[Sumpter， J. P. and Jobling， S. Vitellogenesis as a biomarker for estrogenic contamination of the aquatic environment. Environ Health Perspect 103 Suppl 7: 173-178 (1995)],通常只在雌鱼的血液中检出， 雄鱼或者幼鱼体内表达量很低或很难检测到。最初是1969年Pan等人对雌 性昆虫血液淋巴蛋白的特称，后来被广泛用于特指雌性动物血浆中卵黄蛋 白原[Pan， M. L., Bell W. J. and Telfer W. H. Vitellegenic blood protein synthesis by insect fat body Science N Y.165: 393-394 (1969)]。其作用不仅 为发育中的胚胎提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、维生素、磷和硫等营养 和功能型物质，还具有其他生物学功能。
卵子发生过程中卵黄的形成对于提供胚胎发生的营养具有十分关键 的作用。卵黄形成的原料一般有两种方式 一种是从卵母细胞中合成，称 为内源性合成；另一种是从卯母细胞以外的其他地方合成，然后进入卵母 细胞，称为外源性合成[Rees S.W. and Olive P. Photoperiodic changes influence the incorporation of vitellin yolk protein by oocytes of the semelparous polychaete脸mi (2Ve耐/^」 K>ew, Bioch Physiol PartA. 123:213-220 (1999)]。不同门类的动物或不同种的动物合成的方式各不相 同，而且同一种中不同的发育时期的合成方式也不一样。与内源性卵黄蛋 白原合成相关的细胞器主要有内质网、高尔基体和线粒体等，不同的物种 合成的细胞器不一致。外源性卵黄蛋白原合成，包括所有的脊推动物如鱼类、两栖类、爬行类及鸟类等。无脊推动物常见于线虫、海胆、部分软体 动物、大多数昆虫及曱壳类等。不同门类的卵黄蛋白原合成途径不一样。 大多数昆虫是在脂肪体内合成，曱壳类由肝胰腺或滤泡细胞形成。线虫的 卵黄蛋白原是在肠细胞内合成，被卵母细胞吸收后并不裂解。脊推动物如 鱼类、两栖类和鸟类都是由肝脏合成，再分泌到血液，经血液运送到卵巢， 被卵母细胞通过受体介导的内吞作用吸收到细胞内。
卵黄蛋白原是属于一个基因家族，编码大量脂蛋白，在胆固醇运输及 其它脂类代谢过程中有着重要的作用，在很多物种中已被纯化分离。通 常情况下，脊推动物的成熟雌性才产生卵黄蛋白原基因表达，但是在雌二 醇诱导下，雄性或未成熟的雌性也会大量表达。随着工业生产的发展，杀 虫剂、去污剂和其它化工产品的大量排放，对人类和野生动物产生了巨大 的危害，生殖腺发育不完全、雌雄同体、性逆转等生殖方面的疾病已引起 了广泛的关注。而雄鱼卵黄蛋白原基因的诱导也被作为一种快速和有效的 检测和筛选环境中类雌激素效应的方法，成为了 一种指示环境内分泌干扰 作用的生物指标[Zha J, Wang Z, Wang N and Ingersoll C. Histological alternation and vitellogenin induction in adult rare minnow (Go&'ocj^Wi" after exposure to ethynylestradiol and nonylphenol. Chemosphere 66:488-495 (2007) ; Barucca, M., Canapa， A., Olmo, E. and Regoli, F. Analysis of vitellogenin gene induction as a valuable biomarker of estrogenic exposure in various Mediterranean fish species. Environ Res 101: 68-73 (2006)]。
稀有齣鲫(Gobiocypris rarus)属担尼亚科，鉤鲫属，是中国特有 的稀有鱼类，分布于四川省汉源县、石棉县、双流县、都江堰市和彭县等 地。从1990年开始由中国科学院水生生物研究所将其作为新的实验动物，先后对其分布、生活习性、繁殖、饲养等方面作了系统的研究。其具有繁 殖力强，温度适应范围广，二氧化碳和溶氧耐受力高，性成熟周期短等作 为实验鱼类的优良特征，而且在水生化学品毒性测试上有极高的敏感性。虽然在生物学背景上有 着丰富的资料，但是在分子生物学和毒理学上，基因水平的数据仍然需要 大量的工作，因此，对于鉴定和分离在环境内分泌干扰物作用下的基因表 达的变化将有深远的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种鱼类卵黄蛋白原基因(本发明中定义为VTG 基因)及其编码蛋白与其在检测鱼类生殖方面的疾病、调控鱼类生殖能力 以及冲全测水生环境化学品毒性中的应用。
针对上述发明目的，本发明以实验室饲养并驯化的稀有鮑鲫为来源， 卵黄蛋白原基因从EE2短期暴露的雄鱼肝脏中扩增并进行克隆和测序。其 c DNA序列长402 bp,编码134个氨基酸。VTG基因的c DNA序列具体见 序列表中SEQ id Nq: 1的dn a序列，vtg基因编码的卯黄蛋白原 氨基酸序列具体见序列表中S E Q ID Nq: 2的氨基gl/f列。
本发明的发明人通过运用RT-PCR技术，检测了 VTG基因在幼鱼时期 的表达，结果表明未成熟的幼鱼体内没有该基因的转录产物，只有在成 鱼中才有表达。雌性肝脏组织中的带紋和预期大小一致，而雄性肝脏中无 带紋，表明该基因在雌鱼的生殖调控中具有重要的功能。
本发明通过设计特异性引物，建立了稀有鮑鲫VTG和P-actin(内参) 基因的实时定量PCR-SYBR Green萸光染料方法。运用荧光定量PCR方法 检测了暴露在环境雌激素作用下的幼鱼和成年雄鱼的表达变化，发现在雌 激素作用下幼鱼和成年雄鱼被显著诱导VTG表达，而且具有剂量效应关 系。
基于这些结果，本发明提供如下技术方案一方面，本发明提供一种鱼类卵黄蛋白原基因的c DNA序列，其特 征在于，该c DN A序列是下述核苷酸序列之一1 )序列表中S E Q I D :Nb:l的DNA序列；2 )编码序列表中S E Q ID Wq: 2的卵黄 蛋白原的DNA序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID Wq: 1限定的DNA序列杂交的核苦酸序列。
本发明同时提供一种鱼类卵黄蛋白原，其特征在于，该蛋白原是具有 下述氨基酸序列之一的蛋白质1) S EQ ID NO: 2所示的氨基酸 序列；2)由本发明所述的c DNA序列所编码的蛋白质。
本发明还提供一种含有VTG基因序列的表达载体。
另一方面，本发明提供一种VTG基因序列作为环境类雌激素预警分子 标i己物的应用。
本发明同时提供一种VTG基因序列或所述的鱼类卯黄蛋白原在制备 用于^r测鱼类生殖方面的疾病的制剂中的应用。优选的，所述鱼类生殖方 面的疾病是性腺发育不完全、雌雄同体和/或性逆转。
本发明还提供一种VTG基因序列或所述的鱼类卵黄蛋白原在调控鱼 类生殖能力方面的用途。
本发明还提供一种检测水生环境化学品毒性的测试方法，其特征在 于，所述方法包括检测所述水生环境中的鱼类中VTG基因序列或其编码蛋 白的表达水平。优选的，所述水生环境化学品毒性是雌激素效应。
本发明适用于检测鱼类生殖方面的疾病、调控鱼类生殖能力以及检测 水生环境化学品毒性，本发明的试验结果表明VTG基因的表达与雌激素效 应具有剂量效应关系，因此，本发明具有操作简便、快捷、准确的优点。
下面结合附图对本发明作进一步的说明
图1是RT-PCR检测VTG基因在EE2(乙炔基雌二醇)暴露下的表达和 正常稀有鮑鲫雌雄鱼的表达结果。在正常的雌鱼肝脏中VTG有丰富的表 达，而正常的雄鱼中没有表达；EE2暴露后，在雄鱼肝脏中VTG被明显诱 导表达。
图2是稀有鉤鲫VTG基因的重组质粒的筛选结果。从平板上随机挑 选24个白斑进行菌落PCR，再挑选条带与VTG —致的菌落进行过夜培养， 进行测序鉴定。图3是稀有鮑鲫VTG和(3-actin基因的荧光定量PCR标准曲线。 图4是荧光定量PCR检测稀有齣鲫雄鱼中VTG基因在21天E2(雌二 醇)和4-NP(壬基酚)暴露下的表达结果。*号表示有显著差异的组，尸〈0. 5。
图5是荧光定量PCR检测稀有齣鲫雌鱼中VTG基因在21天E2和4-NP 暴露下的表达结果。*号表示有显著差异的组，代O. 5。
图6是荧光定量PCR检测稀有齣鲫幼鱼中VTG基因在EE2短期暴露 下的表达结果。*号表示有显著差异的组，代O. 5。
图7是切片观察稀有鮑鲫在21天E2和4-NP暴露下的雄鱼和雌鱼性 腺组织病理学变化。A是正常的精巢，pg是生殖细胞；B是1250 u g/1 4-NP 暴露后的精巢，出现了病理学变化，rs是残存的精子，tt是变薄的管壁。 C是正常的卵巢，of是滤泡细胞；D是1250tig/1 4-NP暴露后的卵巢， 出现了较多的闭锁现象(箭头)。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实例仅限于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实 验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
1. 组织和幼鱼总RNA的提取 在液氮研磨的肝脏中加入l ml Trizol试剂和DNA酶，加0. 2 ml氯
仿，盖好管盖，剧烈振荡15s,室温放置3min。 4°C12， 000 rpm离心10min， 转移水相至新管，緩慢加入1倍体积70%乙醇，混匀。离心，去废液， 干燥，用TE (Tris EDTA緩冲液)溶解总RNA。
2. 简并聚合酶链式反应，产物纯化和克隆 先进行第一链的合成，分别取稀有齣鲫雌雄个体RNA 10 ul,加入2
u 1随机引物，70 。C反应5 min,在冰上冷却，加入1 ii 1 M-MLV (商品名， promega，美国)反转录酶，1 P 1RNA酶抑制剂，5 u 1反应緩冲液，5 y 1 dNTP
(脱氧核苷三磷酸)，加水至25ul，轻轻混合，37。C，lh;70。C，10 min,冰 浴冷却。
PCR扩增反应体系为25 Pl,其中含模板IOO ng DNA，每个引物取 0.5 umol/L， 1.5腿ol/L Mg2+， 0.2 u mol/L dNTP， 1 U Taq DNA聚 合酶，加水补至25 lil。应用热启动及降落(Touchdown, TD)PCR扩增，循环条件为94 。C预 变性6min， 94。C变性40s,前3个循环复性温度/人60 。C降至55 。C (时 间50 s), 72 。C延伸45 s;从第四个循环开始94 。C变性40 s, 55 。C复 性50 s, 72 。C延伸45 s, 35个循环，72 。C延伸8 min， 4 。C保存。取 2ul扩增产物用2 %琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶成像系统扫描记录 图像。
PCR产物用TIANGEN纯化试剂盒(天根，中国)进行纯化。连接反应 及转化步骤按p MD 19-TVector ( TaKaRa)试剂盒(TaKaRa,日本)说明 书进行。
3. VTG基因片段的篩选和测序
转化菌涂布于涂有X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-卩-D-吡喃半乳糖)和 IPTG (异丙基-(3 - D -硫代半乳糖苷)的含氨苄青霉素(Amp )的LB平板 上培养，37 。C培养过夜，随机挑取50个白色菌落，接种于2 ml含Amp 的液体培养基。用PCR方法检测质粒的插入片段，引物为通用引物SP6和 T7, PCR反应条件为94 。C预变性6 min ， 94 。C 40 s, 55 。C 50 s, 72 °C 80 s， 35个循环，72 。C延伸8 min, 4 。C保存。筛选出有差异的 阳性克隆委托北京诺赛基因公司进行测序。 一共测定12个克隆，其中6 个是卵黄蛋白原基因序列，长度均为402 bp，编码一个长度为134个氨 基酸的卵黄蛋白原，与其它物种的相似性高达88%,在稀有齣鲫中未见 报道，是一个新的卵黄蛋白原基因。
4. RT-PCR对VTG基因的检测
用P-actin作为内参基因，取总RNA进行反转录，然后进行扩增，PCR 反应条件为94°C, 10min; 94°C, 30s; 55°C, 30s; 72°C， 45s; 35个 循环。
5. 荧光定量PCR分析基因表达差异 从大肠杆菌中提取含有VTG基因片段的重组质粒，在分光光度计上测
定其DNA浓度和纯度。以10倍稀释的质粒作为模版，进行PCR,做出标 准曲线，确定模板的最佳浓度。
以反转录的DNA作为模板，在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green荧 光染料，在Bio-Rad iCycler iQTM5 Multicolor实时定量PCR检测系统进行 PCR扩增，每次反应液包含11.25 jiL of Quant 2X iQTM SYBR Green PCR master mix (Bio-Rad, USA)， 100 nM上游和下游引物和1 u 1 cDNA模板。反应条件为95°C, 4min; 60°C， 30s; 72。C, 30s，循环次数为35 - 40。 随后进行溶解曲线分析和表达分析。每次扩增重复3次以上。 6. VTG基因的雌激素诱导效果试验
由附图1 RT-PCR检测VTG基因在EE2暴露下的表达和正常雌雄鱼的表 达结果可知，以actin基因作为对照基因，在雌雄鱼中均有表达，而 且表达量一致。在正常雄鱼中无表达，雌鱼中有明显表达。在环境雌激素 EE2作用下该基因在雄鱼中表达明显受到诱导。
如附图2所示，对稀有鮑鲫VTG基因的重组质粒的筛选操作，蓝白斑 筛选后，挑选白斑进行重新扩增，经PCR检测和测序，得到含有VTG基因 片段的重组质粒。
如附图3-4所示，检测得到了稀有齣鲫VTG和P -actin基因的荧光定 量PCR标准曲线以及荧光定量PCR检测VTG基因在21天E2和4-NP暴露 下的表达。
如附图5所示，雄鱼在低浓度下VTG基因的诱导不显著，在10 |ig/l及 以上的浓度下表达显著被诱导，并呈现典型的S型剂量效应关系；雌鱼的 诱导在低浓度下有显著诱导，而随着浓度的增加诱导效应不明显，到高浓 度暴露下，表达又被显著诱导，呈现倒U型剂量效应关系。
如附图6所示，幼鱼在24h暴露下的影响较72h小，在1-6天幼鱼暴露 下VTG诱导较13和15天幼鱼影响不明显，表明VTG在幼鱼体内可以诱导， 而且随着幼鱼的性腺发育影响增加。
如附图7所示，在21天暴露下，雌鱼和雄鱼的性腺组织发生了明显的病 理学变化，精巢中精子数量减少，细胞壁变厚，精嚢中出现精子残存物，而 VTG基因在雄鱼中被诱导表达与雄鱼性腺的组织病理学改变 一致。所用的引物列表:
p-actinFor5，陽CAGGG(C/T)GT(C/G)ATGGT(G/T)GG(C/G/T)AT -3，
Rev5 ， -(G/T)GTTGGC(C/T)TTGGG( A/G)TT(C/G) AG -3 ，
VF15，- CAGGT(A/T/G/C)TT(A/G)GC(A/T)CA(A/G)GA(C/T)TG -3' 5，- AAATTCAT(A/G)GT(G/T)(C/T)TGCTGAAG -3，
VF2VTGVR15，- CC(C/T)(C/T)TCATCCAGTC(A/T/G/C)(A/G)CAAC -3，
VR25，-
AG(A/G)(A/C)A(C/G)(A/C)ACCCAGGA(A/G)TG(A/C/G)G C-3' 5'-C AGGGCGTGATGGTGGGGAT-3'
(3-actinFlDQ5394 21Rl5'-GGTTGGCTTTGGGGTTGAG-3'
VTGF25'-AAATTC ATGGTGCTGCTGAAG-3'
EF09572 8R25'-CCTTTCATCCAGTCTGCAAC-3'序列表
〈110〉 中国科学院生态环境中心
<120> 鱼类卵黄蛋白原基因及其编码蛋白与应用
〈130〉 DIC07110027
<藤 2
〈170> Patentln version 3.3
〈210〉 1 <211> 402 〈212〉 腿
<213> 稀有齣鲫(Gobiocypris rarus ) 〈400〉 1
aaattcatgg tgctgctgaa gaaggatgaa cagtctgaag aaaaccgcat gaacgttaaa 60 cttgctgaca ttgatgtaga cttgtatact ttgggcaccg atgcaaaggt taaagttaat 120 gaaatggaag ttcccatcag cagtcttccc tatcagcatc cctcaggctc catccagatc 180 aggcagaagg ctgatggttt gtcactttat gctcctagtc acgggcttca ggaagtctat 240 tttgccaatg gtcattggaa gattcaagtt gcagactgga tgaaaggaca gacctgtgga 300 ctctgtggaa aggctgatgg agagatcaga caagagtaca ctacacccag tggatacctg 360 accaagagct cagtcagctt tgcgcattcc tgggttcttc ct 402
<210〉 2
〈211〉 134
〈212〉 PRT
〈213〉 稀有齣鲫(Gobiocypris rsrus j
〈400〉 2Lys Phe Met Val Leu Leu Lys Lys Asp Glu Gin Ser Glu Glu Asn Arg 15 10 15
Met Asn Val Lys Leu Ala Asp lie Asp Val Asp Leu Tyr Thr Leu Gly 20 25 30
Thr Asp Ala Lys Val Lys Val Asn Glu Met Glu Val Pro lie Ser Ser 35 40 45
Leu Pro Tyr Gin His Pro Ser Gly Ser lie Gin lie Arg Gin Lys Ala 50 55 60
Asp Gly Leu Ser Leu Tyr Ala Pro Ser His Gly Leu Gin Glu Val Tyr 65 70 75 80
Phe Ala Asn Gly His Trp Lys lie Gin Val Ala Asp Trp Met Lys Gly 85 90 95
Gin Thr Cys Gly Leu Cys Gly Lys Ala Asp Gly Glu lie Arg Gin Glu 100 105 110
Tyr Thr Thr Pro Ser Gly Tyr Leu Thr Lys Ser Ser Val Ser Phe Ala 115 120 125
His Ser Trp Val Leu Pro 130
权利要求
1、一种鱼类卵黄蛋白原基因的cDNA序列，其特征在于，该cDNA序列是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №2的卵黄蛋白原的DNA序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
2、 一种鱼类卯黄蛋白原，其特征在于，该蛋白原是具有下述氨基酸 序列之一的蛋白质1) SEQ IDNO: 2所示的氨基酸序列；2) 由权利要求1所述的c D N A序列所编码的蛋白质。
3、 含有权利要求1所述c D N A序列的表达载体。
4、 权利要求1所述的鱼类卵黄蛋白原基因作为环境类雌激素预警分 子标记物的应用。
5、 权利要求1所述的c D N A序列或权利要求2所述的鱼类卯黄蛋 白原在制备用于检测鱼类生殖方面的疾病的制剂中的应用。
6、 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述鱼类生殖方面的 疾病是性腺发育不完全、雌雄同体和/或性逆转。
7、 权利要求1所述的c D N A序列或权利要求2所述的鱼类卵黄蛋 白原在调控鱼类生殖能力方面的用途。
8、 一种检测水生环境化学品毒性的测试方法，其特征在于，所述方 法包括检测所述水生环境中的鱼类中如权利要求2中所述的鱼类卵黄蛋 白原的表达水平。
9、 根据权利要求8所述的测试方法，其特征在于，所述水生环境化 学品毒性是雌激素效应。
全文摘要
本发明公开了一种鱼类卵黄蛋白原基因及其编码蛋白与应用。其目的是提供一种鱼类卵黄蛋白原基因及其编码蛋白与其在检测鱼类生殖方面的疾病、调控鱼类生殖能力以及检测水生环境化学品毒性中的应用。该基因的cDNA是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №2的卵黄蛋白原的DNA序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
文档编号C12N15/65GK101302513SQ20071009905
公开日2008年11月12日 申请日期2007年5月10日 优先权日2007年5月10日
发明者张小艳, 查金苗, 王子健, 饶凯锋 申请人:中国科学院生态环境研究中心