专利名称：酵母菌表达系统中表达人卵透明带zp3蛋白的方法
技术领域：
本发明公开了一种人卵透明带ZP3蛋白的表达方法，特别是指一种在酵母菌表达系统中表达人卵透明带ZP3蛋白的方法。
体外试验表明，抗卵透明带抗体可通过阻断精子对透明带的粘附而完全地抑制受精，因此，它是生育调节疫苗发动免疫攻击的一个理想的靶标。由于人类和猪卵透明带存在免疫交叉反应，且猪卵透明带相对容易获得，长期以来国内外均利用猪卵透明带抗原作为透明带避孕疫苗的候选抗原，并在多种动物模型进行研究。尽管其抗生育效能显著，但也出现了可逆性的卵巢功能紊乱，从而影响了它作为生育调节疫苗的应用，有必要获取更多的抗原，尤其是人源透明带抗原进行深入研究。此外，尽管多种证据表明人类透明带自身抗体与不孕，卵巢早衰，自然流产，自身免疫性卵巢炎等疾病有关，但临床上却因抗原的来源问题长期开展不了该项检测，影响了不孕症的诊断和治疗。
随着基因工程等生物技术的发展，人们对人卵透明带蛋白的基因序列结构的认识越来越深刻完整，其DNA序列和氨基酸序列均已清楚。它含有ZP1-ZP3三个组分。至此，以人工基因重组的办法表达人卵透明带便成为了可能。人卵透明带的ZP3组分为精子受体组分，也是透明带中主要的免疫显性蛋白，故成为研究热点对象。文献Harris JD et alProtein Expression and Purification，1999，16298记载，国外研究者已在大肠杆菌、酵母、昆虫和CHO等系统中表达了人卵透明带的3个组分。但他们只在CHO细胞得到可溶性蛋白。他们在酵母系统中表达ZP3蛋白的方法是受体菌为GS115，载体质粒为pz555K，在载体质粒上插入编码ZP3蛋白23～383位氨基酸的序列。重组质粒电打孔导入受体菌GS115前，先将重组质粒采用SalI酶进行线性化。经G418筛选后，用甲醇诱导培养。但这种方法生产出来的人卵透明带蛋白，不能从酵母细胞中分泌出来，而是积聚在细胞内；而且可溶性很差，只有在如6M尿素等溶剂中才能保持溶解状态，但此时它已失去了应用价值。
本发明的人卵透明带ZP3蛋白的表达方法是通过如下技术方案来实现的。采用受体菌GS115、载体质粒pPIC9K；在目的片段之前，通过PCR的方法，引入了6个组氨酸序列；将前面带有6个组氨酸序列的编码ZP3蛋白23～408位氨基酸的目的蛋白片段插入载体质粒；重组质粒电打孔导入受体菌GS115前，采用SacI酶线性化；导入受体菌后经G418筛选，再用甲醇诱导培养；纯化后得所需蛋白。
本发明的人卵透明带ZP3蛋白表达方法，比之于现有技术，目的蛋白选用了23～408位氨基酸，其C末端保留了较为完整的跨膜区基因序列，并且为便于纯化而设计的串联组氨酸序列片段连在目的蛋白的N末端而不是C末端，采用SacI酶对重组质粒进行线性化后，从酵母基因组的AoxI基因处插入而不是从酵母基因组的His4基因处插入，从而有利于重组蛋白在酵母系统的表达和分泌。表达生成的ZP3蛋白溶解性好，能够从细胞内分泌到培养上清中，容易分离提取，便于应用。
根据ZP3蛋白的基因序列设计一对引物，上游引物为ATTGAATTCCATCATCATCATCATCATCAACCCCTCTGGCTCTTGC，下游引物为ATTGCGGCCGCAACCAGGATAACAGCAGTCAGAGTC；以含人ZP3cDNA序列的PBS质粒为模板，PCR扩增出末端带有EcoR I和Not I酶切位点的目的基因片段67～1224bp即23～408位氨基酸，并在EcoR I酶切位点后引入组氨酸序列片段；2、重组质粒的构建将上述PCR产物和pPIC9k载体质粒均在缓冲液中用EcoR I和NotI双酶切(37℃，2h)后，用T4连接酶(16℃，18h)将目的基因片段插入经双酶切处理的pPIC9k质粒中；3、重组质粒的筛选和鉴定将质粒导入DH5α中，在含AMP的LB培养基上筛选阳性克隆；扩增提取重组质粒，测序鉴定重组质粒；4、重组质粒导入Pichia pastoris表达系统重组质粒用SacI酶线性化后，用电打孔法将重组质粒导入GS115酵母菌中；5、重组子(工程菌)的筛选电击结束后，立即加入1ml，0℃，1mol/L的山梨醇，混匀，吸取200ul涂布于MD平板上，正放2h后倒置于培养箱，28-30℃培养4～5天，挑选阳性克隆，并在含4mg/ml G418的YPD板上筛选多拷贝克隆；6、重组蛋白的表达挑取4.0mg/mlG418-YPD平板上的单克隆，接种于5mlYPD培养液中，振荡培养过夜；次日吸取100ul过夜培养物接种于10mlBMGY培养液中，28-30℃振荡培养过夜；4℃下3500g离心10min，弃上清，细胞沉淀重悬于25ml BMMY培养液中，加入甲醇至终浓度为0.5％，28-30℃振荡培养4天，每24h向培养基中补加甲醇至终浓度0.5％，诱导重组蛋白的表达；7、重组蛋白的纯化用金属螯合层析(HisTrap kit)纯化重组蛋白，得重组人卵透明带ZP3蛋白产品。
重组蛋白的鉴定抗透明带抗体的制备用纯化的猪透明带ZP3抗原(与人卵透明带有极大的交叉免疫反应性)免疫兔子，得到多克隆抗血清。制备人卵巢组织切片，用酶联免疫组化的方法证实该血清可与人透明带产生免疫复合物。再用该血清孵育超排的人卵，PBS洗涤后依次用酶标二抗，DAB-H2O2反应，卵被染成金黄色。两个结果都证明该多克隆抗体可用于检测人透明带蛋白。
培养物4℃下3500g离心10min，收获上清。取培养上清1ml透析，浓缩后进行SDS-PAGE，与阴性对照菌(导入不含目的片段的pPIC9k质粒)相比，所构建的工程菌培养上清多了分子量为30～45KD的特异条带。
将SDS-PAGE结果进行Western blot实验，采用经人卵巢组织切片证实与人卵透明带有免疫学反应的兔抗猪卵透明带ZP3多克隆血清作为第一抗体，HRP酶标羊抗兔抗体作为第二抗体，显色底物采用DAB-H2O2，发现只有该组分与兔抗猪卵透明带ZP3多克隆血清有强的免疫反应，上清的其他组分、阴性对照菌培养上清均与该血清无反应，证实人ZP3组分在该系统表达成功，并具有免疫反应性。
毕赤酵母是一个新近发展起来的新型表达系统，是低等真核生物，在毕赤酵母表达人卵透明带ZP3蛋白(rhZP3)，具有经济，容易操作，生长迅速，稳定，高表达，高分泌，自身分泌蛋白少等优点。rhZP3比猪卵透明带更适合作为生育调节疫苗候选抗原。此外，它还可用于制备检测人透明带自身抗体的试剂盒，还可能作为评价精子功能的生物物质，解决多年来因抗原来源问题而不能进行检测的现状，促进不孕症的检测和治疗。
权利要求
1.一种酵母菌表达系统中表达人卵透明带ZP3蛋白的方法，采用受体菌GS115、目的蛋白及载体质粒、线性化酶等；包括的步骤有扩增目的蛋白片段、重组质粒的构建、重组质粒的筛选和鉴定、重组质粒导入Pichia pastoris表达系统、重组子(工程菌)的筛选、重组蛋白的表达、重组蛋白的纯化，其特征是所述目的蛋白是23～408位氨基酸基因片段；所述的载体质粒是pPIC9k；所述重组质粒构建时，插入该载体质粒的ZP3目的基因片段是在前面引入了6个组氨酸序列的23～408位氨基酸；所述的重组质粒导入前，先将重组质粒用SacI酶进行线性化，然后从酵母基因组的AoxI基因处插入。
2.如权利要求1所述的酵母菌表达系统中表达人卵透明带ZP3蛋白的方法，其特征是所述扩增目的蛋白片段是按如下步骤完成的根据ZP3蛋白的基因序列设计一对引物，上游引物为ATTGAATTCCATCATCATCATCATCATCAACCCCTCTGGCTCTTGC，下游引物为ATTGCGGCCGCAACCAGGATAACAGCAGTCAGAGTC；以含人ZP3cDNA序列的PBS质粒为模板，PCR扩增出末端带有EcoR I和Not I酶切位点的目的基因片段67～1224bp即23～408位氨基酸，并在EcoR I酶切位点后引入6个组氨酸序列片段；所述的重组质粒的构建是按如下步骤完成的将上述PCR产物和pPIC9k载体质粒均在缓冲液中用EcoR I和NotI双酶切(37℃，2h)后，用T4连接酶(16℃，18h)将目的基因片段插入经双酶切处理的pPIC9k质粒中。
全文摘要
本发明公开了一种酵母菌表达系统中表达人卵透明带ZP3蛋白的方法，载体质粒为pPIC9k，目的蛋白选用了23～408位氨基酸，串联组氨酸序列片段连在目的蛋白的N末端，导入前采用SacI酶对重组质粒进行线性化。表达生成的ZP3蛋白分泌及溶解性好，便于应用。
文档编号C07K14/435GK1438316SQ03113968
公开日2003年8月27日 申请日期2003年3月21日 优先权日2003年3月21日
发明者谢琪璇, 潘善培 申请人:暨南大学