抑制survivin基因表达的双链siRNA、其应用及包含其的表达质粒及传递体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及抑制survivin基因表达的双链SiRNA分 子及其在制备抗肿瘤药物中的应用，包含其的表达质粒及传递体。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是当前威胁人类生命健康的主要杀手之一，尽管各种的治疗方法不断出 现，但目前还没有找到真正有效的根治方法。肿瘤的治疗一直是长期困扰医学界的世界性 难题。逃避凋亡是所有肿瘤的特征，它使得肿瘤细胞在异常生长刺激下存活，并抵抗化疗和 放疗。抗凋亡蛋白survivin通过与凋亡信号作用成为新的最有潜能的治疗靶标来抑制肿 瘤细胞的生长。
[0003] 凋亡抑制基因 survivin是1997年发现的一种重要的肿瘤相关基因，含4个外显 子和3个内含子。基因编码产物为由142个氨基酸组成的分子量为16. 2KD的蛋白。它能 抑制细胞凋亡和调节细胞有丝分裂，是联系细胞周期和细胞凋亡界面的重要因子。该基因 几乎在所有种类的肿瘤组织中特异性地表达，而正常组织几乎没有表达；该基因在肿瘤细 胞中高表达后，不但促进肿瘤细胞的抗凋亡过程，促进肿瘤细胞有丝分裂还参与血管形成 和化疗耐受等多种功能。因此，抑制survivin基因的表达可以有效防止肿瘤浸润、转移，促 进肿瘤细胞的凋亡。
[0004] RNA干扰（RNAinterference，RNAi)现象是一种在进化上保守的抵御转基因或外 来病毒侵犯的防御机制，是一种序列特异性的转录后基因沉默。其原理是：RNase III核酶 家族的Dicer与双链RNA结合后，将其剪切成21 - 23nt及3-端突出的小干扰RNA(Small interfering RNA siRNA)，随后 siRNA 与 RNA 诱导沉默复合物（RNA induced Silencing complex RISC)结合并被解旋成单链，活化的RISC受到已成单链的siRNA引导，序列特异性 地结合在靶mRNA上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达的转录 后基因沉默机制.RNAi已作为一种简单有效的基因敲除的技术广泛地应用于功能基因组 学研究以及抗病毒、抗肿瘤治疗的研究中。该项技术的发现为疾病治疗尤其是癌症的治疗 开辟了全新的途径，为科研工作者提供了一个全新的基因治疗理念。
[0005] 应用RNA干扰技术，利用靶向survivin基因转录后的mRNA的siRNA药物，干扰基 因转录，进而诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的有丝分裂，抑制肿瘤转移时的血管形成和 降低肿瘤细胞放化疗的耐受性。Survivin蛋白作为目前发现的最强的凋亡抑制因子，利用 抑制survivin基因的表达来对肿瘤进行抑制，不断受到广泛关注和重视，有望成为治疗肿 瘤的新方法。
[0006] 由于siRNA体内不稳定的理化性质，递送siRNA成为RNAi干扰技术发展的最大 障碍。因此研发能够保护促进细胞吸收siRNA正确细胞定位和包内体逃逸，结合具有高生 物相容性与减少非特异沉默和毒性反应的体内递送系统是siRNA成功用于临床治疗的关 键.体内siRNA递送系统分为两类：病毒载体递送和非病毒载体递送。重组病毒载体包括 逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒。病毒载体是尚效的核酸递送系统，但是由于它 们具有潜在的致突变力、引起毒性免疫反应、大量生产造价高昂等缺陷，病毒载体递送系统 的临床应用受到限制。非病毒载体主要包括对SiRNA进行化学修饰、阳离子聚合物、脂质 体、细胞渗透性肽、及靶向融合蛋白等。双链siRNA分子具有高特异性、高效性等技术优势， 但是双链siRNA分子药物在临床应用中仍存在一些技术难题有待解决。为了合理、有效地 解决siRNA存在的生物稳定性差、体内半衰期短并降低siRNA可能存在的脱靶效应等技术 难题，化学修饰技术、脂质体包载siRNA分子已经成为解决当前siRNA药物技术难题的最为 有效途径之一
[0007] 单层和多室脂质体正广泛应用于药物递送系统。脂质体可以使用单一或者多种类 型的脂质进行构建，在体内含水环境中，这样的物质可以形成具有脂双层的脂质体。球形外 部的极性基团可以形成纳米颗粒复合体，而内部的亲水基团有利于核酸类物质的存在。而 且脂质体结构上的不定型性使得脂质与核酸在体内便于运输。
[0008] 在临床运用中，由于细胞免疫反应，血清稳定性差等因素，化学修饰的siRNA比天 然siRNA更为人们所运用。从siRNA发现至今，研究人员使用了各种各样的化学修饰手段 来优化siRNA的运用，也取得了许多不错的成果。目前，已有许多种siRNA的修饰方法，归 纳起来，一共分为三大类：siRNA糖环修饰，siRNA骨架修饰和siRNA碱基修饰，这些修饰手 段为提高siRNA的血清稳定性，降低siRNA的脱靶效应，提高siRNA的特异性等方面提供了 有效的解决方法。
[0009] siRNA糖环修饰是指在核糖核酸的糖环的各个位置进行化学修饰。糖环修饰是 siRNA化学修饰中运用的最为广泛和成熟的方法，包括2' -修饰（2' -OMe，2' -F，2' -Μ0Ε， 2' -FANA，CE，EA)，4' -修饰（4, -S，4' -S-FANA)，5' -修饰（5' -OMe)，异构修饰（LNA，UNA， ALN，OXE，ENA，HNA，ANA，HM)以及这些修饰的组合修饰。修饰后的siRNA可能具有更高的 Tm值，更强的血清稳定性和更好的活性。
【发明内容】
[0010] 本发明公开一种抑制survivin基因表达的双链siRNA分子及其在制备抗肿瘤药 物中的应用，是一种新的高效广谱siRNA序列，可以促进细胞的凋亡及抑制肿瘤细胞的增 殖和转移。
[0011] 本发明所述的双链siRNA分子，其特征在于一种高效革巴向survivin基因的mRNA 的广谱双链的小分子干扰RNA (siRNA)，由下述核苷酸序列的正义链的和反义链组成：
[0012] 正义链 5 ' -GGCCCUUGUCUAAGUGCAA-3 ' ;(SEQ ID N0:1)
[0013] 反义链 5 ' -UUGCACUUAGACAAGGGCC-3 '。（SEQ ID N0:2)
[0014] 根据本发明的另一方面，本发明还提出了一种双链siRNA分子，由下述核苷酸序 列的正义链的和反义链组成：
[0015] 正义链：5 ' -GGCCCUUGUCUAAGUGCAA XX-3 ' ; (SEQ ID N0:3)
[0016] 反义链：5 ' -UUGCACUUAGACAAGGGCC MN-3 '。（SEQ ID N0:4)
[0017] 其中，XX为dTdT (或表示为tt)、TT或UU，M和N分别独立的为C、G、A、T、dC、dG、 dA或dT ;C代表胞嘧啶核糖核苷酸、G代表鸟嘌呤核糖核苷酸、A代表腺嘌呤核糖核苷酸、T 代表胸腺嘧啶核糖核苷酸、U代表尿嘧啶核糖核苷酸dC代表胞嘧啶脱氧核糖核苷酸、dG代 表鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、dA代表腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、dT代表脱氧胸腺嘧啶核糖核苷 酸。
[0018] 进一步优选的双链SiRNA分子，由下述核苷酸序列的正义链的和反义链组成：
[0019] 正义链：5 ' -GGCCCUUGUCUAAGUGCAAdTdT-3 ' ; (SEQ ID N0:5)
[0020] 反义链：5 ' -UUGCACUUAGACAAGGGCC UA-3 '。（SEQ ID N0:6)
[0021] 本发明的siRNA分子来源于针对survivin基因开放阅读框的功能保守区而制备 的SiRNA分子库，其优点在于所制备的SiRNA随机分布于survivin基因开放阅读框区段， 长度可控性分布于19_23bp，可以提高有效靶点的命中率。
[0022] 本发明还提出了一种质粒，所述质粒包含前面所述的任意一种双链siRNA分子。 由此，利用质粒转染动物细胞，能够有效的沉默surivivin基因，进而诱导细胞凋亡、抑制 肿瘤细胞分裂、抑制肿瘤血管的生成，从而能够有效的治疗肿瘤。进一步，该双链siRNA分 子与质粒能够有效的用于抗肿瘤药物的制备