专利名称：一种肝素酶i融合蛋白及其编码基因与表达方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和发酵工程领域中一种肝素酶I融合蛋白及其编码基因与表达方法。
背景技术：
肝素酶(heparinase)是一类作用于肝素的多糖裂解酶，在许多种微生物中发现，包括棒杆菌Corynebacterium sp.(高宁国等，肝素酶产生菌的筛选及发酵条件，微生物学报1999 Vol.3964-67)、鞘胺醇杆菌Sphingobacterium sp.(高宁国等，鞘胺醇杆菌肝素酶的产生，微生物学报2003 Vol.43813-816)、枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis(王忠彦等，肝素酶产生菌的筛选及其粗酶性质的研究，四川大学学报(自然科学版)2002 Vol.39777-779)、环状芽孢杆菌Bacillus circulans(Yasutaka Tahara et al.，Purification and characterization of heparinasethat degrades both heparin and heparin sulfate from Bacillus circulansBioSci.Biotechnol.Biochem.2002 Vol.661181-1184)、解肝素拟杆菌Prevotellaheparinolytica(Kazuyuki Sugahara et al.，Characterization of heparinasefrom an oral bacterium Prevotella heparinolytica J.Biochem.1998Vol.123283-288)、粪便拟杆菌Bacteroides stercoris HJ-15(Dong Hyuu Kim etal.，Purification and characterization of a novel heparinase from Bacteroidesstercoris HJ-15 J.Biochem.2000 Vol.128323-328)和肝素黄杆菌Flavabacteriumheparinum(Sasiekharan，R.1991 Ph.D.Thesis，Havard University)。但是来自肝素黄杆菌的肝素酶是商业化的唯一来源。来自肝素黄杆菌的肝素酶主要有三种，分别命名为肝素酶I(EC 4.2.2.7)、II(NO EC code)和III(EC 4.2.2.8)(RobertJ.Linhardt et al.，Purification and characterization of heparin lyases fromFlavobacterium heparinum JBC 1992 Vol.26724347-24355)。
肝素酶的研究有十分重要的意义(Sasiekharan，R.1991 Ph.D.Thesis，HavardUniversity；Sasiekharan，R.et al.，A comparative analysis of the primarysequences and characteristics of heparinase I，II，and III from Flavobacteriumheparinum Biochemical and Biophysical Research Communication 1996Vol.229770-777)肝素酶是多糖裂解酶的一种，用于研究肝素酶及其底物多糖肝素之间的相互作用有助于阐明多糖裂解酶的作用机制；肝素酶可以用于解析肝素等复杂粘多糖的结构及其生物学功能；肝素酶可以用于解析人体内的凝血和抗凝血机制；肝素酶可以用于制备低分子的抗凝血药物低分子肝素；肝素酶可以用作临床血液肝素化的去除，防止手术后出血；肝素酶用于PCR反应前血液制品的处理。
肝素酶I通常是从肝素黄杆菌发酵液中提纯获得的，通常需要经过多步的色谱纯化，收率比较低。肝素黄杆菌增长速度慢，肝素酶的生产稳定性差，而且，产肝素酶需要价格昂贵的肝素诱导，增加了酶的成本。因此，目前利用黄杆菌生产肝素酶的成本极高，限制了肝素酶的应用发展。Ram Sasiekharan(1993)(Sasiekharan，R.et al.，Cloning and expression of heparinase I gene fromFlavobacterium heparinum Proc.Natl. Acad.Sci.USA 1993 Vol.903660-3664)首先通过氨基酸测序，设计引物扩增得到了肝素酶I的基因序列并重组在大肠杆菌中实现了肝素酶的表达(表1)；但表达产物不能正确折叠形成有活性的蛋白。RamSasiekharan(1996)(Sasiekharan，R.et al.，Expression in Escherichia coli，Purification and characterization of heparinase I from Flavobacteriumheparinum Biochem.J.1996 Vol.315589-597)利用pET表达系统提高了蛋白表达量(14.4mg/L发酵液)(表1)，但重组肝素酶I仍然形成包涵体，需要复性才能形成活性蛋白。Oded Shoseyov(1999)(Etai Shpigel，et al.，Immobilizationof recombinant heparinase I fused to cellulose-binding domain Biotechnologyand Bioengineering 1999 Vol.6517-23)利用纤维素结合蛋白(CBD)与肝素酶融合，利用融合蛋白实现了CBD-hep、hep-CBD的融合表达，通过纤维素柱亲合分离，并提高了肝素酶I的表达量(150mg/L发酵液)(表1)；但是尽管在低IPTG(0.5mM)下诱导，该融合蛋白仍然形成包涵体，需要复性才能形成有活性的重组肝素酶I。
表1.肝素酶I重组表达研究现状
来自大肠杆菌的天然的麦芽糖结合蛋白MBP能够与麦芽糖特异吸附，参与大肠杆菌对麦芽糖的转运和利用。MBP不但能与amylose结合，实现亲和分离，也能与马铃薯淀粉结合实现亲和分离(廉德君等，一种改进的融合蛋白亲和层析纯化方法，生物化学与生物物理进展1998 Vol.25283-284；Usha Srinivasan et al.，Aconvenient method for affinity purification of maltose binding proteinfusions Journal of Biotechnology 1998 Vol.62163-167)，从而可大大降低酶的分离纯化的成本。
发明创造内容本发明的目的是提供一种肝素酶I融合蛋白及其编码基因。
本发明所提供的肝素酶I融合蛋白，名称为MBP-HepA，是具有序列表中SEQ ID№2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。
序列表中的SEQ ID №2由756个氨基酸残基组成。
肝素酶I融合蛋白编码基因，名称为MBP-HepA，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列1中的DNA序列由2271个碱基组成，该基因的开放阅读框架为自5’端第1到第2271位碱基。
含有本发明基因的表达载体、细胞系及工程菌，如pMal-hepA和含有pMal-hepA的大肠杆菌E.coli TB1(pMAL-hepA)均属于本发明的保护范围。
扩增该融合蛋白编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明的第二个目的是提供一种表达肝素酶I融合蛋白的方法。
本发明所提供的表达肝素酶I融合蛋白的方法，是将含有上述肝素酶I融合蛋白编码基因的重组表达载体导入表达宿主菌，表达肝素酶I融合蛋白。
其中，所述肝素酶I融合蛋白编码基因的重组表达载体为pMal-hepA。
pMal-hepA是通过BamHI和PstI将肝素酶I编码基因全序列插入pMal p2x，pMalc2x(物理图谱如图7所示，购买自NEB公司)表达载体中得到的肝素酶I融合蛋白编码基因的重组表达载体。其中，所述肝素酶I编码基因全序列是以肝素黄杆菌的染色体组DNA为模板，以5’GCCTGGATCCCAGCAAAAAAAATCCGGTAAC 3’和5’GCTTCTGCAGTCTGGCAGTTTCGCTGTAC 3’为引物，按照常规PCR方法得到的。
所述宿主菌可为大肠杆菌，所述大肠杆菌可为以下菌株Bl21、JM109、DH5α、TB1等。
肝素酶I融合蛋白的诱导表达条件可为0.01-1mM IPTG 10-42摄氏度诱导16小时；所采用的培养基中的酵母提取物浓度可为1g/L-20g/L，还可在培养基中加入1％-5％乙醇和/或0.05-2mg/L卡那霉素和/或0.01-2.0mg/L氯霉素等热休克物质。其中，该表达条件优选为工程菌在37摄氏度培养3小时后，加入0.3mM IPTG 15摄氏度诱导16小时；所采用的培养基优选为NaCl 10g/L，酵母膏为7.5g/L，蛋白胨10g/L，1％(质量百分比)乙醇，0.6mg/L氯霉素。
本发明构建了防止包涵体形成的融合表达载体，并通过amylose树脂实现一步亲和分离。通过融合蛋白首次实现肝素酶I在大肠杆菌中90％以上以有活性、正确折叠的可溶蛋白形式存在；大肠杆菌E.coli TB1(pMAL-hepA)在37摄氏度培养3小时后加入0.3mM IPTG，诱导温度15摄氏度，培养基中酵母粉浓度0.75％，乙醇1％，生产的肝素酶酶活可达270U/L(108UL-1OD600-1)发酵液，表达量可达150mg/L发酵液，并通过亲和分离实现了该融合蛋白的一步纯化。本发明通过改变IPTG浓度，加入IPTG时间，诱导温度，培养基成份等优化提高了融和蛋白的产量和肝素酶活。本发明将在肝素酶I的生产中发挥重要作用。
图1为表达载体pMal-hepA的构建过程示意2为从肝素黄杆菌中PCR扩增得到的肝素酶I基因电泳图谱图3为转化子菌落PCR和双酶切验证电泳图谱图4a为E.coli TB1(pMAL-hepA)在37℃不同诱导时间的蛋白质电泳图谱图4b为E.coli TB1(pMAL-hepA)在21℃不同诱导时间的蛋白质电泳图谱图5为融合蛋白MBP-HEPA通过直链淀粉树脂亲和分离的SDS-PAGE电泳图谱图6为pMal-hepA的物理图谱图7为pMal p2x，pMal c2x的物理图谱具体实施方式
实施例1、肝素酶I融合蛋白MBP-HepA的表达1、表达载体pMal-hepA的构建表达载体pMal-hepA的构建过程如图1所示，具体过程如下从肝素黄杆菌的染色体组DNA中扩增肝素酶I基因，所用的上下游引物分别为5’GCCTGGATCCCAGCAAAAAAAATCCGGTAAC 3’(带下划线的碱基为BamHI的酶切位点)，5’GCTTCTGCAGTCTGGCAGTTTCGCTGTAC 3’(带下划线的碱基为PstI酶切位点)，分别引入BamHI和PstI酶切位点，扩增的反应体系为50ng模板DNA，100pmol每种引物，1×扩增缓冲液，200μmol/L每种dNTP，1单位高保Pfu酶；扩增程序为95摄氏度变性5分钟，50-60摄氏度引物退火45秒，72摄氏度引物延伸90秒，30个循环后，72摄氏度延伸5分钟结束反应。该PCR结果如图2所示，表明扩增得到1.1kb的肝素酶I基因片段。图2中，1-6分别为引物退火温度为50、51、53、55、58或59℃扩增结果，7为分子量marker 15kb，箭头所指处为1.1kb目标片断。
将pMal-p2x和pMal-c2x载体和PCR产物分别用BamHI和PstI双酶切，用T4DNA连接酶连接，转化JM109，以5’GCCTGGATCCCAGCAAAAAAAATCCGGTAAC 3’和5’GCTTCTGCAGTCTGGCAGTTTCGCTGTAC 3’为引物，通过菌落PCR筛选转化子，再提质粒通过BamHI和PstI双酶切验证。验证结果如图3所示，菌落PCR结果表明在55℃左右，目的基因片断能够得到有效扩增。转化大肠杆菌TB1，得到两株含正确连接的重组质粒载体菌株，其中一株命名为重组大肠杆菌TB1(pMal-hepA)。图3中，1，8分别为2k和λ/HindIII marker；5-7为PCR验证的转化子，2-4为5-7双酶切后电泳图，箭头所指为肝素酶I基因条带；其中6，7为正确连接的pMal-hepA。
2、肝素酶I融合蛋白MBP-HepA的表达重组大肠杆菌TB1(pMal-hepA)在LB培养基(含100μg/ml Amp)37℃培养3小时，加入1mM IPTG分别在37℃和21℃进行诱导培养。每隔一定时间取菌液做全细胞SDS-PAGE电泳，诱导后菌液取40ml在10000rpm下离心10min，用20mM Tris-HCl洗涤两次，重悬在4ml 20mMTris.HCl中超声破碎(输出功率为300W，每次超声3秒和间歇3秒的处理99次)，取上清液50μl做SDS-PAGE分析。结果如图4a和图4b所示，不同诱导温度对蛋白活性的影响比较明显。在37℃诱导，目标蛋白以无活性包涵体的形式存在，而21℃诱导，可溶蛋白的量明显增加。图4a中，1，9为蛋白质marker，2-4为诱导时间0，6，16小时全细胞电泳图，5，6为3，4的细胞破碎后沉淀，7，8为3，4的上清液，箭头所指处为融合蛋白MBP-hepA(94KDa)。图4b中，1-6为诱导时间t＝0、2、3、4、9、21的全细胞电泳图，7为分子量maerker；8，9为5、6的细胞破碎后沉淀，10，11为8，9的上清液，箭头所指处为融合蛋白MBP-hepA(94KDa)。
重组大肠杆菌TB1(pMal-hepA)在LB培养基(含100μg/ml Amp)37℃培养3小时，加入1mM IPTG分别在37℃，21℃和15℃进行诱导培养16小时。将细胞离心分离、Tris buffer pH7.0洗涤两次后，重悬在4ml Tris buffer中，进行细胞破碎。将破碎液离心后，测上清液中的肝素酶活。酶活的分析采用天青A(Azure A)方法，1U的酶活的定义30℃每小时降解1mg底物肝素所需要的蛋白量。结果表明不同诱导温度下所得到的肝素酶活分别为37℃，14U/L发酵液(2.9UL-1OD600-1)；21℃，89U/L发酵液(18.5UL-1OD600-1)，15℃，270U/L发酵液(108UL-1OD600-1)。
实施例2、通过直链淀粉柱纯化肝素酶I融合蛋白MBP-HepA本发明中利用的融合伙伴(fusion partner)麦芽糖结合蛋白MBP能够与直链淀粉亲和吸附实现一步分离。具体的亲和分离步骤如下将0.3mM IPTG诱导表达16小时的菌体100ml，10000rpm离心5min；同时设未诱导表达的菌体对照。接着按以下两个方案分别操作方案一用柱平衡液Column buffer(20mM TrisHCl，200mM NaCl，pH 7.4)洗涤两次，重悬在5ml column buffer中，进行超声(输出功率为300W，每次超声3秒和间歇3秒的处理99次)。
方案二渗透压冲击。将菌体重悬在100ml osmotic shock buffer I中(20-40％蔗糖，30mMTrisHCl，1mMEDTA)15min，搅拌。离心10000rpm 10min，重悬在等体积0.5mM硫酸镁中，冰浴10-15min，离心10000rpm10min。
离心后上清夜以0.5ml/min通过2ml预平衡的直链淀粉亲和分离柱，通过10mM0.5ml/min麦芽糖洗脱并收集。
每一步取50μl做SDS-PAGE，目标蛋白经过直链淀粉(amylose)树脂吸附后，用10mM麦芽糖在1个柱体积下能够将目标蛋白洗脱。结果如图5所示，表明经过直链淀粉树脂一步纯化后目标蛋白可占95％以上。图5中，1为0.3mM IPTG诱导的E.coli TB1(pMAL-hepA)全细胞电泳，2为未诱导的E.coli TB1(pMAL-hepA)全细胞电泳，3为分子量marker，4为可溶目标蛋白MBP-HEPA，5为不可溶目标蛋白，6-8为经过直链淀粉树脂吸附后用麦芽糖洗脱收集的1，2，3管(每管1.5ml)，箭头所指为目标蛋白。
序列表<160>2<210>1<211>2271<212>DNA<213>人工序列<400>1atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat120ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt180atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc240accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac300aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa360gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg420aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg480ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa540gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt600aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa660ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa720gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt780ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc840ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg900
ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc1020tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa1080gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac1140aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttcggatccc agcaaaaaaa atccggtaac1200atcccttacc gggtaaatgt gcaggccgac agtgctaagc agaaggcgat tattgacaac1260aaatgggtgg cagtaggcat caataaacct tatgcattac aatatgacga taaactgcgc1320tttaatggaa aaccatccta tcgctttgag cttaaagccg aagacaattc gcttgaaggt1380tatgctgcag gagaaacaaa gggccgtaca gaattgtcgt acagctatgc aaccaccaat1440gattttaaga aatttccccc aagcgtatac caaaatgcgc aaaagctaaa aaccgtttat1500cattacggca aagggatttg tgaacagggg agctcccgca gctatacctt ttcagtgtac1560ataccctcct ccttccccga caatgcgact actatttttg cccaatggca tggtgcaccc1620agcagaacgc ttgtagctac accagaggga gaaattaaaa cactgagcat agaagagttt1680ttggccttat acgaccgcat gatcttcaaa aaaaatatcg cccatgataa agttgaaaaa1740aaagataagg acggaaaaat tacttatgta gccggaaagc caaatggctg gaaggtagaa1800caaggtggtt atcccacgct ggcctttggt ttttctaaag ggtattttta catcaaggca1860aactccgacc ggcagtggct taccgacaaa gccgaccgta acaatgccaa tcccgagaat1920agtgaagtaa tgaagcccta ttcctcggaa tacaaaactt caaccattgc ctataaaatg1980ccctttgccc agttccctaa agattgctgg attacttttg atgtcgccat agactggacg2040aaatatggaa aagaggccaa tacaattttg aaacccggta agctggatgt gatgatgact2100tataccaaga ataagaaacc acaaaaagcg catatcgtaa accagcagga aatcctgatc2160ggacgtaacg atgacgatgg ctattacttc aaatttggaa tttacagggt cggtaacagc2220acggtcccgg ttacttataa cctgagcggg tacagcgaaa ctgccagatg a 2271
<210>2<211>756<212>PRT<213>人工序列<400>2Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys1 5 10 15Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr20 25 30Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe35 40 45Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala50 55 60His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile65 70 75 80Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp85 90 95Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu100 105 110Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys115 120 125Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly130 135 140Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro
145 150 155 160Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys165 170 175Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly180 185 190Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp195 200 205Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala210 215 220Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys225 230 235 240Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser245 250 255Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro260 265 270Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp275 280 285Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala290 295 300Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala305 310 315 320Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln325 330 335Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala340 345 350
Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn355 360 365Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile370 375 380Glu Gly Arg Ile Ser Glu Phe Gly Ser Gln Gln Lys Lys Ser Gly Asn385 390 395 400Ile Pro Tyr Arg Val.Asn Val Gln Ala Asp Ser Ala Lys Gln Lys Ala405 410 415Ile Ile Asp Asn Lys Trp Val Ala Val Gly Ile Asn Lys Pro Tyr Ala420 425 430Leu Gln Tyr Asp Asp Lys Leu Arg Phe Asn Gly Lys Pro Ser Tyr Arg435 440 445Phe Glu Leu Lys Ala Glu Asp Asn Ser Leu Glu Gly Tyr Ala Ala Gly450 455 460Glu Thr Lys Gly Arg Thr Glu Leu Ser Tyr Ser Tyr Ala Thr Thr Asn465 470 475 480Asp Phe Lys Lys Phe Pro Pro Ser Val Tyr Gln Asn Ala Gln Lys Leu485 490 495Lys Thr Val Tyr His Tyr Gly Lys Gly Ile Cys Glu Gln Gly Ser Ser500 505 510Arg Ser Tyr Thr Phe Ser Val Tyr Ile Pro Ser Ser Phe Pro Asp Asn515 520 525Ala Thr Thr Ile Phe Ala Gln Trp His Gly Ala Pro Ser Arg Thr Leu530 535 540Val Ala Thr Pro Glu Gly Glu Ile Lys Thr Leu Ser Ile Glu Glu Phe545 550 555 560
Leu Ala Leu Tyr Asp Arg Met Ile Phe Lys Lys Asn Ile Ala His Asp565 570 575Lys Val Glu Lys Lys Asp Lys Asp Gly Lys Ile Thr Tyr Val Ala Gly580 585 590Lys Pro Asn Gly Trp Lys Val Glu Gln Gly Gly Tyr Pro Thr Leu Ala595 600 605Phe Gly Phe Ser Lys Gly Tyr Phe Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Asp Arg610 615 620Gln Trp Leu Thr Asp Lys Ala Asp Arg Asn Asn Ala Asn Pro Glu Asn625 630 635 640Ser Glu Val Met Lys Pro Tyr Ser Ser Glu Tyr Lys Thr Ser Thr Ile645 650 655Ala Tyr Lys Met Pro Phe Ala Gln Phe Pro Lys Asp Cys Trp Ile Thr660 665 670Phe Asp Val Ala Ile Asp Trp Thr Lys Tyr Gly Lys Glu Ala Asn Thr675 680 685Ile Leu Lys Pro Gly Lys Leu Asp Val Met Met Thr Tyr Thr Lys Asn690 695 700Lys Lys Pro Gln Lys Ala His Ile Val Asn Gln Gln Glu Ile Leu Ile705 710 715 720Gly Arg Asn Asp Asp Asp Gly Tyr Tyr Phe Lys Phe Gly Ile Tyr Arg725 730 735Val Gly Asn Ser Thr Val Pro Val Thr Tyr Asn Leu Ser Gly Tyr Ser740 745 750Glu Thr Ala Arg75权利要求
1.一种肝素酶I融合蛋白，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于所述肝素酶I融合蛋白是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸残基序列的蛋白质。
3.肝素酶I融合蛋白编码基因，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID No1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述肝素酶I融合蛋白编码基因是序列表中的SEQ ID №1。
5.含有权利要求3或4所述基因的表达载体、细胞系和工程菌。
6.根据权利要求5所述的表达载体和细胞系，其特征在于所述表达载体为pMAL-hepA。
7.根据权利要求5所述的表达载体和细胞系，其特征在于所述工程菌为含有所述肝素酶I融合蛋白编码基因的大肠杆菌。
8.一种表达肝素酶I融合蛋白的方法，是将含有肝素酶I融合蛋白编码基因的重组表达载体导入表达宿主菌，表达得到表达肝素酶I融合蛋白；所述肝素酶I融合蛋白编码基因，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述肝素酶I融合蛋白编码基因的重组表达载体为pMAL-hepA；所述宿主菌为大肠杆菌。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述肝素酶I融合蛋白的诱导表达条件为0.01-1mM IPTG、10-42摄氏度诱导16小时；所采用的培养基中的酵母提取物浓度为1g/L-20g/L；所述培养基中还加入1％-5％乙醇和/或0.05-2mg/L卡那霉素和/或0.01-2.0mg/L氯霉素；所述表达条件优选为工程菌在37摄氏度培养3小时后，加入0.3mM IPTG在15摄氏度诱导16小时；所采用的培养基优选为NaCl 10g/L，酵母膏为7.5g/L，蛋白胨10g/L，1％乙醇，0.6mg/L氯霉素。
全文摘要
本发明公开了一种肝素酶I融合蛋白及其编码基因与表达方法。本发明所提供的肝素酶I融合蛋白，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。本发明通过融合蛋白首次实现肝素酶I在大肠杆菌中90％以上以有活性、正确折叠的可溶蛋白形式存在；酶活可达270U/L发酵液(108 UL
文档编号C07K19/00GK1699424SQ200410038098
公开日2005年11月23日 申请日期2004年5月19日 优先权日2004年5月19日
发明者陈银, 邢新会, 娄恺 申请人:清华大学