编码具类肝素酶活性的多肽的多核苷酸及其在转导细胞中的表达的制作方法

专利名称：编码具类肝素酶活性的多肽的多核苷酸及其在转导细胞中的表达的制作方法
技术领域：
及背景本发明涉及编码具类肝素酶(heparanase)活性的多肽的多核苷酸(下文中称作hpa)，包括此多核苷酸的载体和表达类肝素酶的转导细胞。本发明还进一步涉及具类肝素酶活性的重组蛋白。
硫酸乙酰肝素蛋白多糖硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)是与脊椎动物和无脊椎动物组织中的许多细胞的细胞表面和胞外基质(ECM)有关的普遍存在的大分子(1-4)。基本的HSPG结构包括蛋白核心以及与之共价相连的几条线性硫酸乙酰肝素链。这些多糖链通常由重复的己糖醛和D-葡糖胺二糖单元组成，这些单元不同程度地被N-和O-连接的硫酸组分和N-连接的乙酰基团所取代(1-4)。对ECM分子参与细胞附着、生长和分化的研究显示，HSPG在胚形态发生、血管发生、轴突旁枝突起和组织修复中处于关键地位(1-5)。HSPG是血管的重要组分(3)。在大血管中，它们主要集中在血管内膜和内血管中膜，而在毛细血管中，它们主要在内皮下基底膜，支持内皮细胞繁殖和迁移并稳定毛细血管壁的结构。HSPG与ECM大分子如胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白等在质膜上的不同附着位点相互作用的能力暗示了此蛋白多糖在ECM组分的自组装和不溶性，以及细胞粘着和细胞运动中起着重要作用。硫酸乙酰肝素(HS)链的裂解可导致内皮下ECM的降解，从而在血源细胞的外渗中起决定性作用。HS分解代谢可在炎症、创伤修复、糖尿病和癌症转移中观察到，说明降解HS的酶在病理过程中起重要作用。类肝素酶活性曾在活化的免疫系统细胞和高度转移的癌细胞中描述过(6-8)，但由于缺乏探索疾病状况下类肝素酶潜在的病原作用的生物工具，因此阻碍了研究。
肿瘤细胞侵入和转移中类肝素酶的参与停留在不同器官毛细血管床内的循环肿瘤细胞必须侵入内皮细胞内层并降解其底层基底膜(BM)以便侵入血管外组织，从而发生转移(9，10)。转移的肿瘤细胞经常附着在邻近内皮细胞之间的胞间连接处或附近。转移细胞附着之后，胞间连接破裂，内皮细胞边界收缩，通过内皮缺口向暴露的底层基底膜迁移(9)。一旦定位在内皮细胞和BM之间，则侵入细胞必须降解BM的内皮下糖蛋白和蛋白多糖以便迁移出血管区室。若干细胞酶(例胶原酶IV，纤溶酶原激活物，组织蛋白酶B，弹性蛋白酶等)与BM的降解有关(10)。在这些酶中，有一种内切-β-D-葡糖苷酸酶(类肝素酶)，它在特殊链内位点裂解HS(6，8，11)。HS降解性类肝素酶的表达与小鼠淋巴瘤(11)、纤维肉瘤和黑素瘤(8)细胞的转移潜力相关。此外，在患有转移肿瘤的动物和黑素瘤患者的血清(8)和癌症患者的肿瘤活组织(12)中检测到类肝素酶水平升高。
本发明人以前研究过通过局部微环境对细胞增殖和肿瘤发展进行控制，主要着眼于细胞与培养的角膜和血管内皮细胞产生的细胞外基质(ECM)之间的相互作用。该培养ECM在其形态外观及分子组成方面与体内的内皮下层十分类似。它包括胶原(主要是III型和IV型，及少量I型和V型)，蛋白多糖(主要为硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素蛋白多糖，以及少量硫酸软骨素蛋白多糖)，层粘连蛋白，纤连蛋白，巢蛋白和弹性蛋白(13，14)。细胞降解培养ECM中的HS的能力可通过以下方法研究使细胞与新陈代谢地硫酸盐标记的ECM相互作用，对释放到培养基中的降解产物进行凝胶过滤(琼脂糖6B)分析(11)。完整的HSPG在柱的空体积之后洗脱(Kav＜0.2，Mr≈0.5×106)，而标记的HS侧链降解片段在更接近柱的Vt时洗脱(0.5＜Kav＜0.8，Mr＝5-7×103)(11)。
本发明者还研究了各种非抗凝剂类型的肝素对类肝素酶的抑制作用，这些肝素有可能用于防止血源细胞的外渗。包括16个或更多糖单位并在N和O位置都具硫酸基团的肝素可最成功抑制类肝素酶。O-脱硫作用消除了肝素对类肝素酶的抑制作用，而只要N-取代分子分子量大于等于4,000道尔顿，则O-硫酸化、N-乙酰化肝素保持高抑制活性(7)。对实验动物用类肝素酶抑制剂(例如，肝素的非抗凝剂类型)处理，则显著减少(＞90％)B16黑素瘤、Lewis肺癌和乳腺癌细胞诱导的肺部转移(7，8，16)。与抗凝血酶III具高和低亲合性的肝素级分表现出相似的高抗转移活性，这表明肝素的类肝素酶抑制活性而非其抗凝活性在多糖的抗转移特性中起作用(7)。
癌症患者尿中的类肝素酶活性为尝试进一步阐明类肝素酶在肿瘤发展中的作用及与人类癌症的相关性，对尿样进行类肝素酶活性检查(16a)。在一部分、而非所有癌症患者的尿样中检测到类肝素酶活性。在患有侵入性转移疾病的患者的尿液中检测到高水平的类肝素酶活性，而在健康供体的尿液中检测不到类肝素酶活性。
在20％的正常人和微球蛋白尿胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)患者中也发现有类肝素酶活性，这很可能是由于糖尿病性肾病——导致成人肾衰竭的最重要的疾病所致。
类肝素酶可能参与肿瘤血管发生成纤维细胞生长因子为结构相关的多肽家族，具有对肝素高亲和性的特征(17)。它们对血管内皮细胞高度促有丝分裂，且是最有效的新血管形成的诱导物之一(17，18)。已从体外生成的内皮下ECM(19)和角膜的基底膜(20)中提取出了碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，提示ECM可作为bFGF的储存器。免疫组化染色显示bFGF定位在多种组织和血管的基底膜中(21)。尽管bFGF在正常组织中普遍存在，但这些组织中的内皮细胞通常增殖很低，说明bFGF以某种方式与其作用位点隔离。对bFGF与ECM相互作用的研究表明bFGF与ECM中HSPG结合，且能通过HS降解酶以活化形式释放(15，20，22)。已证实血小板、肥大细胞、嗜中性粒细胞和淋巴瘤细胞表达的类肝素酶活性与从ECM和基底膜释放活性bFGF有关(23)，说明类肝素酶活性可能不仅参与细胞迁移和侵入，而且还可能诱发间接新血管反应。这些结果说明ECM HSPG是bFGF、可能还是其它肝素结合性生长促进因子的天然储存库(24，25)。因此，bFGF从其在基底膜和ECM内的储备中移位可能是正常和病理状况下诱导新血管形成的一种新机制。
近来的研究显示，肝素和HS参与bFGF与高亲和力细胞表面受体的结合及bFGF细胞信号传导(26，27)。此外，达到最佳效果所需的HS的大小与类肝素酶释放的HS片段的大小相似(28)。对血管内皮细胞生长因子(VEGF)也得到类似结果(29)，表明有一个涉及HS与肝素结合性生长因子的细胞相互作用的双重受体机制在起作用。因此推断ECM中内皮细胞生长因子的限制化避免了它们系统性地作用于血管内皮，从而维持极低速率的内皮细胞转换和血管生长。另一方面，bFGF作为与HS片段的复合体从ECM内的储备中释放出来可能会刺激例如创伤愈合、炎症和肿瘤发展等过程中的局部内皮细胞增殖和新血管生成(24，25)。
免疫系统细胞的类肝素酶的表达类肝素酶的活性与免疫系统内活化细胞脱离循环并引起炎症和自身免疫反应的能力有关。血小板、粒细胞、T和B淋巴细胞、巨噬细胞和肥大细胞与内皮下ECM的相互作用与通过特异性类肝素酶活性降解HS有关(6)。类肝素酶在各种活化信号(例如凝血酶，钙离子载体，免疫复合体，抗原，有丝分裂原，等)刺激下从细胞内区室(例如溶酶体，特殊颗粒，等)释放，说明其受调控地参与炎症和细胞免疫。
参考文献6中回顾了关于类肝素酶的观察结果，列举如下文第一，蛋白水解活性(纤溶酶原激活物)和类肝素酶协同参与炎性白细胞和恶性细胞对ECM HSPG的顺序降解。
第二，大部分血小板类肝素酶以潜伏形式存在，很可能是作为与硫酸软骨素的复合体存在。该潜伏酶被肿瘤细胞衍生因子活化，随后可在肿瘤转移过程中促进通过血管内皮的细胞侵入。
第三，强刺激剂(例如凝血酶)诱导血小板类肝素酶从α-颗粒中释放，但ECM上血小板活化不诱导释放。
第四，因阈值激活和细胞在ECM上孵育，优先并很容易地释放嗜中性粒细胞类肝素酶。
第五，嗜中性粒细胞与ECM的接触抑制了毒性酶(蛋白水解酶，溶菌酶)和氧自由基的释放，但不抑制能使血细胞渗出的酶(类肝素酶，明胶酶)的释放。当可溶因子而非可被吞噬的刺激剂刺激时，可观察到内皮下ECM的这种保护作用。
第六，细胞内类肝素酶在T细胞系暴露于特异抗原下几分钟内即被分泌。
第七，有丝分裂原(ConA，LPS)诱导体外维持的正常T和B淋巴细胞合成与分泌类肝素酶。T淋巴细胞类肝素酶也可通过体内抗原免疫接种而诱导。
第八，前B淋巴瘤和B淋巴瘤表达类肝素酶活性，但浆细胞瘤和静息状态的正常B淋巴细胞不表达。
第九，活化的巨噬细胞在与ECM孵育过程中表达类肝素酶活性，但仅极少或根本没有酶释放到培养基中。诱导人骨髓白血病细胞分化为成熟巨噬细胞时，得到相似结果。
第十，低剂量的类肝素酶抑制性非抗凝剂型肝素抑制T细胞介导的迟发型超敏反应和实验性自身免疫(30)。
第十一，血小板、嗜中性粒细胞和转移肿瘤细胞表达的类肝素酶活性从ECM和基底膜释放活化的bFGF。从ECM内的储备中释放bFGF可在如创伤愈合、炎症和肿瘤发展的过程中引发局部的新血管反应。
第十二，类肝素酶产生的ECM降解产物中具有能体内抑制T细胞介导的炎症的三硫酸化双糖(31)。此种抑制与双糖对活化的T细胞进行的生物活性TNFα体外生产的抑制作用相关(31)。
其它潜在的治疗应用哺乳动物的类肝素酶除了参与肿瘤细胞转移、炎症和自身免疫之外，还可用于调节肝素结合性生长因子的生物利用率(15)；针对肝素结合性生长因子(例如bFGF，VEGF)和细胞因子(IL-8)的细胞反应(31a，29)；与血浆脂蛋白的细胞相互作用(32)；对某些病毒和一些细菌及原生动物感染的细胞易感性(33，33a，33b)；和淀粉状蛋白斑的分解(34)。由此证明类肝素酶可能在诸如创伤愈合、血管发生、再狭窄、动脉粥样硬化、炎症、神经变性疾病和病毒感染之类状况中有用。哺乳动物类肝素酶能作为血精蛋白的潜在替代物用于中和血浆肝素。抗类肝素酶的抗体可应用于活组织检查样品、血浆样品和体液中的微转移、自身免疫损害和肾衰竭的免疫检测及诊断中。在基础研究中也有普遍用途。
编码类肝素酶的hpa基因的鉴别有助于在异源表达系统中制备重组酶。如能获得重组蛋白，将为解决蛋白结构功能关系铺平道路，并且为开发新抑制剂提供工具。
病毒感染细胞表面上硫酸乙酰肝素的存在是单纯疱疹病毒(33)和登革病毒(33a)与细胞结合并进一步感染细胞的主要条件。因此通过类肝素酶除去细胞表面硫酸乙酰肝素可消除病毒感染(33)。事实上，用细菌类肝素酶(降解硫酸乙酰肝素)或肝素酶(降解类肝素)处理细胞，能降低两种相关的动物疱疹病毒与细胞的结合，使细胞对病毒感染至少有部分抗性。有迹象表明细胞表面硫酸乙酰肝素也参与HIV感染(33b)。
神经变性疾病在Genstmann-Straussler综合症，Creutzfeldt-Jakob疾病和Scrape的朊病毒蛋白淀粉样蛋白斑中鉴别出了硫酸乙酰肝素蛋白多糖(34)。类肝素酶可分解这些被认为也在早老性痴呆发病机理中起作用的淀粉样蛋白斑。
再狭窄和动脉粥样硬化因内皮损伤和富含胆固醇的脂蛋白累积造成的动脉平滑肌细胞(SMC)增殖是动脉粥样硬化和再狭窄发病机理中的基本事件(35)。HS除了参与SMC增殖(即肝素结合性生长因子的低亲和性受体)外，还参与脂蛋白结合、滞留和摄取(36)。已证明HSPG和脂蛋白脂酶参与可使富含胆固醇的脂蛋白发生显著细胞和间质积累的新分解代谢途径(32)。后一种途径可能因促进富含apoB和apoE的脂蛋白(即LDL，VLDL，乳糜微粒)的积累而高度促进动脉粥样硬化，而与细胞固醇含量的反馈抑制无关。因而预计通过类肝素酶除去SMCHS可抑制SMC增殖和脂类积累，因此可以阻止再狭窄和动脉粥样硬化的发展。
因此，人们已普遍认识到，得到编码具类肝素酶活性的多肽的多核苷酸，包含此多核苷酸的载体，表达类肝素酶的转导细胞及具类肝素酶活性的重组蛋白，将是有必要的并且非常有益的。
发明概述本发明提供编码具类肝素酶活性的多肽的多核苷酸(即下文所指的hpa、hpa cDNA或hpa基因)，本发明还提供包含此多核苷酸的载体，表达类肝素酶的转导细胞和具类肝素酶活性的重组蛋白。
在此报导对编码类肝素酶的人hpa基因的克隆和通过转染宿主细胞表达重组类肝素酶。
对从人肝癌细胞分离的类肝素酶的纯化制品进行胰蛋白酶消化和微量测序。公开的YGPDVGQPR(SEQ ID NO8)序列用于筛选EST数据库中相应的DNA序列的同源物。鉴定到两个紧密相关的EST序列，其后发现二者相同。两种克隆都包括1020bp的插入片段，此插入片段包括973bp的开放阅读框及随后的27bp 3′非翻译区和多聚腺苷酸尾。未鉴定到翻译起始位点。
使用根据EST克隆序列和复合体的接头选择的引物，通过对来自胎盘Marathon RACE cDNA复合体的DNA进行PCR扩增实施对缺失的hpa 5′端的克隆。获得900bp PCR片段，该片段与鉴定出的EST 3′编码克隆部分重叠。连接的cDNA片段(hpa)为1721bp长(SEQ IDNO9)，其中包括编码543个氨基酸的多肽(SEQ ID NO10)的开放阅读框，计算分子量为61，192道尔顿。
运用Marathon RACE通过PCR扩增从人SK-hep1细胞系克隆延伸的5′序列。将SK-hep1 hpa cDNA的5′延伸序列与从人胎盘分离的hpa cDNA(SEQ ID NO9)序列装配起来。装配序列包括开放阅读框SEQ ID NO13和15，该阅读框编码如SEQ ID NO14和15所示的592个氨基酸的多肽，计算分子量为66，407道尔顿。
运用杆状病毒表达系统，通过在昆虫细胞中表达hpa的整个开放阅读框，检测hpa基因产品在体外实验中催化硫酸乙酰肝素降解的能力。含hpa基因的病毒感染的细胞的提取物和条件培养基，经实验证明其对可溶性的ECM衍生HSPG和完整ECM均有高水平硫酸乙酰肝素降解活性。肝素是类肝素酶的另一底物，它抑制上述降解活性。用不含hpa基因的相似构建体感染的细胞及未转染细胞都不具备此活性。在哺乳动物表达系统中证实从延伸的5′克隆表达的类肝素酶有对肝素的活性。
运用RT-PCR研究hpa RNA在不同组织和细胞系中的表达模式。发现hpa RNA仅在已知具类肝素酶活性的组织和细胞中表达。
运用一系列单染色体人/CHO和人/小鼠体细胞杂合体将人类肝素酶基因定位在人第4号染色体上。该新分离的类肝素酶序列可用于鉴定铺展染色体中具有人类肝素酶基因的染色体区。
根据本发明以下描述的优选实施方案中进一步描绘的特征，本发明提供包括编码具类肝素酶催化活性之多肽的多核苷酸序列的多核苷酸片段。
根据描述的优选实施方案中的进一步特征，该多核苷酸片段包括SEQ ID NO9的核苷酸63-1691或SEQ ID NO13的核苷酸139-1869，它们编码完整的人类肝素酶。
根据描述的优选实施方案中的进一步特征，本发明提供包括能与hpa cDNA杂交，尤其是与SEQ ID NO9的核苷酸1-721杂交的多核苷酸序列的多核苷酸片段。
根据描述的优选实施方案中的进一步特征，编码具类肝素酶活性的多肽的多核苷酸序列与SEQ ID NO9或13至少60％同源，优选至少70％同源，更优选至少80％同源，最优选至少90％同源。
根据描述的优选实施方案中的进一步特征，依照本发明的多核苷酸片段包括SEQ ID NO9或13的一部分(片段)。例如，这些片段可包括SEQ ID NO9的核苷酸63-721和/或SEQ ID NO9中编码具类肝素酶催化活性的多肽的区段。
根据描述的优选实施方案中的进一步特征，由该多核苷酸片段编码的多肽包括SEQ ID NO10或14中所示氨基酸序列或其功能性部分。
根据描述的优选实施方案中的进一步特征，该多核苷酸序列编码具类肝素酶活性的多肽，所述多肽与SEQ ID NO10或14至少60％同源，优选至少70％同源，更优选至少80％同源，最优选至少90％同源。
根据描述的优选实施方案中的进一步特征，该多核苷酸片段编码具类肝素酶活性的多肽，该多肽因此可能是SEQ ID NO10或14所示氨基酸序列的等位变体、种变体和/或诱导变体。任何此类变体也可被认作同系物。
根据描述的优选实施方案中的进一步特征，本发明提供一种单链多核苷酸片段，它包括与编码具如上述类肝素酶催化活性之多肽的多核苷酸链的至少一部分互补的多核苷酸序列。
根据描述的优选实施方案中的进一步特征，本发明提供包括编码具类肝素酶催化活性的多肽的多核苷酸序列的载体。
该载体可为任何适当形式，包括但不限于噬菌体、病毒、质粒、噬菌粒、粘粒、杆粒或甚至人工染色体。编码具类肝素酶催化活性的多肽的多核苷酸序列可包括以上描述的任何多核苷酸片段。
根据描述的优选实施方案中的进一步特征，本发明提供含有包括编码具类肝素酶催化活性之多肽的多核苷酸序列的外源多核苷酸片段的宿主细胞。
该外源多核苷酸片段可为以上描述的任何片段。宿主细胞可为任何形式，如原核细胞、真核细胞、细胞系或作为多细胞生物一部分的细胞(例如转基因生物的细胞)。
根据描述的优选实施方案中的进一步特征，本发明提供包含具类肝素酶催化活性的多肽的重组蛋白。
根据描述的优选实施方案中的进一步特征，本发明提供包含具类肝素酶催化活性的重组蛋白作为活性组分的药物组合物。
根据描述的优选实施方案中的进一步特征，本发明提供包括含有具类肝素酶催化活性的重组蛋白作为活性组分的医疗装置的医疗设备。
根据描述的优选实施方案中的进一步特征，本发明提供包括过表达类肝素酶催化活性的细胞的类肝素酶过量表达系统。
根据描述的优选实施方案中的进一步特征，本发明提供鉴定铺展的染色体中包含人类肝素酶基因的染色体区的方法，包括以下步骤(a)将铺展的染色体与编码类肝素酶的标记多核苷酸探针杂交；(b)洗涤铺展的染色体，从而除去过剩的未杂交探针；及(c)搜寻与所述杂交的标记多核苷酸探针相关的信号，其中探测到信号指示包含人类肝素酶基因的染色体区。
本发明能用于开发抑制肿瘤细胞转移、炎症和自身免疫的新药。对编码类肝素酶的hpa基因的鉴定使在异源表达系统中生产重组酶成为可能。
附图简述本发明仅通过举例的方式，参考附图在此描述，其中

图1显示hpa cDNA的核苷酸序列和推断的氨基酸序列。在EST(表达序列标志)和PCR扩增的cDNA(反转录RNA)之间，存在位于799位的单核苷酸差异(A改为T)，此差异及其导致的氨基酸替代(Tyr改为Phe)在各取代单元的上下标出。半胱氨酸残基和聚腺苷酸化共有序列下划线标出。星号表示终止密码子TGA。
图2表示以pFhpa2病毒感染的High Five细胞的溶解产物降解可溶的硫酸盐标记HSPG底物。pFhpa2病毒(●)或对照pF2病毒(□)感染的High Five细胞的溶解产物与硫酸盐标记的ECM衍生的可溶性HSPG(峰I)温育(18h，37℃)。将温育培养基随后加入到Sepharose6B上进行凝胶过滤。低分子量HS降解片段(峰II)仅在与pFhpa2感染的细胞温育时产生，而pF2感染的细胞的溶解产物不造成HSPG底物(◇)的降解。
图3a-b表示可溶性的硫酸盐标记HSPG底物被pFhpa2和pFhpa4感染细胞的培养基降解。将pFhpa2(3a)或pFhpa4(3b)病毒(●)或对照病毒(□)感染的High Five细胞的培养基与硫酸盐标记的ECM衍生的可溶HSPG(峰I，◇)温育(18h，37℃)。温育培养基随后加至Sepharose 6B上进行凝胶过滤。低分子量HS降解片段(峰II)仅在与含hpa基因的病毒温育时产生。对照病毒感染细胞的培养基不降解HSPG底物。
图4表示pFhpa2感染的细胞表达的类肝素酶活性的大小分级分离。将pFhpa2感染的High Five细胞的培养基加到50kDa的截留膜上。在高分子量(＞50kDa)部分(●)而非低分子量(＜50kDa＝(○)部分中发现有类肝素酶活性(峰I底物(◇)转换为峰II HS降解片段)。
图5a-b表示肝素对pFhpa2和pFhpa4感染的High Five细胞表达的类肝素酶活性的影响。将pFhpa2(5a)和pFhpa4(5b)感染的HighFive细胞的培养基与硫酸盐标记的ECM衍生的可溶HSPG(峰I，◇)在缺乏(●)或存在(△)10μg/ml肝素时温育(18h，37℃)。在肝素-类肝素酶活性的一种强有力抑制剂存在时完全不产生低分子量HS降解片段(6，7)。
图6a-b表示病毒感染的High Five和Sf21细胞对硫酸盐标记的完整ECM的降解。将High Five(6a)和Sf21(6b)细胞铺在硫酸盐标记的ECM之上，以pFhpa4(●)或对照pF1(□)病毒感染(48h，28℃)。将对照未感染Sf21细胞(R)同样铺在标记的ECM上。培养基的pH调至6.0-6.2，37℃温育24小时。通过在Sepharose 6B上凝胶过滤，分析释放到温育培养基中的硫酸盐标记物质。仅有含hpa的病毒感染的细胞可产生HS降解片段。
图7a-b表示病毒感染的细胞对硫酸盐标记的完整ECM的降解。将High Five(7a)和Sf21(7b)细胞铺在硫酸盐标记的ECM上，以pFhpa4(●)或对照pF1(□)病毒感染(48h，28℃)。对照未感染的Sf21细胞(R)也铺在标记的ECM上。培养基的pH调至6.0-6.2，28℃温育48小时。通过在Sepharose 6B上进行凝胶过滤，分析释放到温育培养基中的硫酸盐标记的降解片段。仅有含hpa的病毒感染的细胞产生HS降解片段。
图8a-b表示pFhpa4感染细胞的培养基对硫酸盐标记的完整ECM的降解。将pFhpa4(●)或对照pF1(□)病毒感染的High Five(8a)和Sf21(8b)细胞的培养基与完整的硫酸盐标记ECM温育(48h，30℃，pH6.0)。还将ECM与对照未感染Sf21细胞(R)的培养基温育。对释放到反应混合物中的硫酸盐标记物质进行凝胶过滤分析。仅在pFhpa4感染细胞的培养基中测得类肝素酶活性。
图9a-b表示肝素对pFhpa4感染细胞的培养基中的类肝素酶活性的影响。在缺乏(●)或存在(V)10μg/ml肝素时，将硫酸盐标记的ECM与pFhpa4感染的High Five(9a)和Sf21(9b)细胞的培养基温育(24h，37℃，pH6.0)。将释放到温育培养基中的硫酸盐标记物质在Sepharose 6B上凝胶过滤。肝素存在时，类肝素酶活性(峰II HS降解片段的产生)被完全抑制。
图10a-b表示在肝素-Sepharose上纯化重组类肝素酶。将pFhpa4病毒感染的Sf21细胞的培养基进行肝素-Sepharose层析。用NaCl梯度0.35-2M(◇)进行各级分的洗脱。图10a(●)表示洗脱级分中的类肝素酶活性。对级分15-28进行15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉，而后硝酸银染色。证明在级分19-24中的主蛋白带(MW～63,000)与类肝素酶活性之间有相关性。
图11a-b表示在Superdex 75凝胶过滤柱上纯化重组类肝素酶。将从肝素-Sepharose上洗脱的活性级分(图10a)集中，浓缩，并加到Superdex 75 FPLC柱上。收集各级分并检查各级分的等分样品的类肝素酶活性(C，图11a)，由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳而后硝酸银染色分析(图11b)。可见级分4-7中的主蛋白带(MW～63,000)的存在与类肝素酶活性间有相关性。
图12a-e表示对来自人胚组织(12a)、人胚外组织(12b)和不同起源的细胞系(12c-e)的总RNA进行RT-PCR，示hpa基因的表达。使用hpa特异性引物(I)、GAPDH持家基因的引物(II)和无逆转录酶的对照反应的RT-PCR产物，证明RNA样品(III)中无基因组DNA或其它污染。M-DNA分子量标准VI(Boehringer Mannheim)。12a泳道1-嗜中性细胞(成熟的)，泳道2-肌肉，泳道3-胸腺，泳道4-心脏，泳道5-肾上腺。12b泳道1-肾，泳道2-胎盘(8周)，泳道3-胎盘(11周)，泳道4-7-痣(完全水泡状脂块)，泳道8-细胞滋养层细胞(新分离)，泳道9-细胞滋养层细胞(体外1.5h)，泳道10-细胞滋养层细胞(体外6h)，泳道11-细胞滋养层细胞(体外18h)，泳道12-细胞滋养层细胞(体外48h)。12c泳道1-JAR膀胱细胞系，泳道2-NCITT睾丸肿瘤细胞系，泳道3-SW-480人肝癌细胞系，泳道4-HTR(SV40转化的细胞滋养层)，泳道5-HPTLP-I肝细胞癌细胞系，泳道6-EJ-28膀胱癌细胞系。12d泳道1-SK-hep-1人肝癌细胞系，泳道2-DAMI人巨核细胞系，泳道3-DAMI细胞系+PMA，泳道4-CHRF细胞系+PMA，泳道5-CHRF细胞系。12e泳道1-ABAE牛主动脉内皮细胞，泳道2-1063人卵巢细胞系，泳道3-人乳腺癌MDA435细胞系，泳道4-人乳腺癌MDA231细胞系。
图13表示人hpa的核苷酸序列与小鼠EST cDNA片段(SEQ ID NO12)的比较，小鼠EST cDNA片段与人hpa的3′末端(起始于SEQ IDNO9的核苷酸1066)80％同源。在排列的终止密码子下划线。
图14表示hpa基因的染色体定位。以hpa特异引物扩增后，将从体细胞杂合体衍生的DNA的PCR产物与仓鼠、小鼠和人基因组DNA的PCR产物通过0.7％琼脂糖凝胶分离。泳道1-BstEII消化的LambdaDNA，泳道2-无DNA对照，泳道3-29，PCR扩增产物。泳道3-5-人、小鼠和仓鼠各自的基因组DNA。泳道6-29，分别表示染色体1-22和X与Y的人单染色体体细胞杂合体。泳道30-BstEII消化的Lambda DNA。仅在泳道5和9观察到约2.8kb的扩增产物，分别代表人基因组DNA和衍生自携人染色体4的细胞杂合体的DNA。这些结果证明hpa基因位于人染色体4上。
优选实施方案的描述本发明涉及编码具类肝素酶活性的多肽的多核苷酸，在下文中可互换地称作hpa、hpa cDNA或hpa基因，还涉及包括该多核苷酸的载体，表达类肝素酶的转导细胞和具类肝素酶活性的重组蛋白。
在详细解释本发明的至少一个实施方案前，必须了解本发明的应用不限于下文说明书或附图所示的构建细节和各成分的排列。本发明能用于其它实施方案或以不同方式实施。而且，必须了解在此所用的术语和专门名词是为描述目的而不应认作限制。
本发明能用于开发各种疾病的治疗方法，开发这些疾病的诊断方法以及为基础研究特别是医学和生物学领域提供新工具。
特别地，本发明可用于开发抑制肿瘤细胞转移、炎症和自身免疫的新药物。对编码类肝素酶的hpa基因的鉴定使在异源表达系统中生产重组酶成为可能。
进一步地，本发明能用于调节肝素结合性生长因子的生物利用率，针对肝素结合性生长因子(例如bFGF，VEGF)和细胞因子(IL-8)的细胞反应，细胞与血浆脂蛋白的相互作用，对病毒、原生动物和一些细菌感染的细胞易感性，和神经变性斑的分解。因此重组类肝素酶是创伤愈合、血管发生、再狭窄、动脉粥样硬化、炎症、神经变性疾病(例如Genstmann-Straussler综合症，早老性痴呆症，Scrape)，和某些病毒、细菌和原生动物感染的潜在治疗物。重组类肝素酶可作为鱼精蛋白的潜在替代物用于中和血浆肝素。
如在此所用的，术语“调节”包括实质性地抑制、减缓或逆转一种疾病的进展，实质性地改善疾病或状况的临床症状，或实质性地阻止疾病或状况的临床症状的出现。因此“调节子”包括可调节疾病或状况的因子。对病毒、原生动物和细菌感染的调节包括实质性地中断、阻止或减少任何病毒、细菌或原生动物活性和/或病毒、细菌或原生动物生命周期的阶段，或者减少或阻止病毒、细菌或原生动物对目标，如人或低等动物的感染的任何作用。
如在此所用的，术语“创伤”包括对目标躯体的任何部分的任何伤害，包括但不仅限于急性疾病，如在紫外辐射如日灼下过度暴露造成的灼伤、化学灼伤、放射灼伤、热灼伤，因劳动和分娩而对身体组织如会阴造成的伤害，包括在医学方法如外阴切开术过程中持续的损伤，外伤诱导的损伤包括切除，在汽车和其它机械事故中持续的损伤，子弹、刀片及其它武器所致的损伤，和外科术后损伤，以及慢性疾病如褥疮，涉及糖尿病和循环不良的疾病，和所有类型的痤疮，等。
针对重组酶产生的抗类肝素酶抗体，可用于活组织检查标本、血浆样品和体液中微转移、自身免疫损害和肾衰竭的免疫检测和诊断中。这种抗体也可用作类肝素酶活性的中和剂。
在此报导对编码类肝素酶的人hpa基因的克隆和通过转染细胞表达重组类肝素酶。这是首次克隆的哺乳动物类肝素酶基因。
对从人肝癌细胞分离的类肝素酶的纯化制品进行胰酶消化和微量测序。
利用公开的YGPDVGQPR(SEQ ID NO8)序列筛选EST数据库，寻求相应的DNA序列的同源物。鉴定到两个紧密相关的EST序列并发现二者相同。
两克隆都包括1020bp的插入片段，此插入片段包括973bp的开放阅读框及随后的27bp的3′非翻译区和聚腺苷酸尾，但未鉴定到翻译起始位点。
通过对来自胎盘Marathon RACE cDNA复合体的DNA进行PCR扩增，使用根据EST克隆序列和复合体的接头选择的引物，克隆缺失的5′末端。
获得900bp的PCR片段，与鉴定到的3′编码EST克隆部分重叠。连接的cDNA片段(hpa)长1721bp(SEQ ID NO9)，包括编码具有如图1和SEQ ID NO11所示543个氨基酸、计算分子量为61192道尔顿的多肽(SEQ ID NO10)的开放阅读框。
观察到EST克隆和PCR扩增的cDNA之间在799位有一个单核苷酸差异(A→T)。此区别导致单个氨基酸取代(Tyr改为Phe)(图1)。此外，发表的EST序列包括一个未鉴定的核苷酸，对两个EST克隆的DNA测序将该未鉴定核苷酸分辨为两个核苷酸(分别为SEQ ID NO9中1630和1631位的G和C)。
体外实验中hpa基因产物催化硫酸乙酰肝素降解的能力通过运用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达完整的开放阅读框而检测。
已证明含hpa基因的病毒感染的细胞的提取物和条件培养基对可溶性的ECM衍生HSPG和完整ECM均有高水平的硫酸乙酰肝素降解活性，此活性被肝素抑制，而被不含hpa基因的类似构建体感染的细胞或非感染细胞则无此活性。
用RT-PCR检测hpa RNA在不同组织和细胞系中的表达模式。发现其仅在已知具类肝素酶活性的组织和细胞中表达。
使用Marathon RACE，通过PCR扩增，从人SK-hep1细胞系克隆延伸的5′序列。将SK-hep1 hpa cDNA的5′延伸序列与从人胎盘分离的hpa cDNA序列(SEQ ID NO9)装配起来。装配的序列包括一个开放阅读框，SEQ ID NO13和15，它编码如SEQ ID NO14和15所示的592个氨基酸的多肽，计算分子量为66407道尔顿。此开放阅读框显示指导催化活性的类肝素酶在哺乳动物细胞表达系统中的表达。Western印迹分析中用抗类肝素酶抗体可检测表达的类肝素酶。
运用一系列单染色体的人/CHO和人/小鼠体细胞杂合体将人类肝素酶基因定位在人染色体4上。因此新分离的类肝素酶序列能用于鉴定铺展的染色体中含人类肝素酶基因的染色体区域。
因此，本发明提供包含编码具类肝素酶催化活性之多肽的多核苷酸序列的多核苷酸片段(单链或双链DNA或RNA)术语“类肝素酶催化活性”或与其相当的术语“类肝素酶活性”都指对乙酰肝素或硫酸乙酰肝素蛋白多糖底物特异的哺乳动物内切糖苷酶水解活性，这种活性与通过β-消除的方法降解肝素或硫酸乙酰肝素的细菌酶(肝素酶I，II和III)的活性相反(37)。
在本发明优选的实施方案中，多核苷酸片段包括SEQ ID NO9的核苷酸63-1691，或SEQ ID NO13的核苷酸139-1869，它们编码完整的人类肝素酶。
但本发明的范围不仅限于人类肝素酶，因其是对编码任何哺乳动物类肝素酶的开放阅读框(ORF)的首次公开。运用hpa cDNA、其部分或根据其序列设计的合成寡核苷酸，本领域技术人员能够鉴定到包括来自其它哺乳动物物种的同源序列的基因组和/或cDNA克隆。
因此本发明进一步涉及包括能与hpa cDNA，尤其是与SEQ ID NO9的核苷酸1-721杂交(严格或允许杂交条件下的碱基配对，参见如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis.T.(1989)分子克隆，实验室指南，冷泉港实验室出版社，纽约)的多核苷酸序列的多核苷酸片段。
事实上，编码具类肝素酶活性的多肽的任何多核苷酸序列和与SEQID NO9或13至少60％同源、优选至少70％同源、更优选至少80％同源、最优选至少90％同源的任何多核苷酸序列均在本发明范围内。
根据本发明的多核苷酸片段可包括SEQ ID NO9或13的任何部分。例如，它可包括SEQ ID NO9的核苷酸63-721，这是一个新序列。它可包括编码具类肝素酶催化活性之多肽的SEQ ID NO9或13的任何区段。
当在此和以下的权利要求部分应用术语“编码具类肝素酶催化活性的多肽”时，指的是能够指导在例如ECM和细胞表面相关HS的降解中有催化活性[如其活性所需，也可以是在翻译后修饰(包括但不限于蛋白水解，例如除去信号肽和蛋白原或前蛋白原序列)、甲硫氨酸修饰、糖基化、烷基化(如甲基化)、酰化等后有此活性]的多肽的合成。
在本发明优选的实施方案中，此多核苷酸片段编码的多肽包括SEQID NO10或14中所示的氨基酸序列或其功能性部分，即具类肝素酶催化活性的部分。
编码具类肝素酶活性的多肽的任何多核苷酸片段都在本发明范围内。因此，该多肽可为SEQ ID NO10或14所示氨基酸序列或其功能性部分的等位变体、物种变体和/或诱导变体。
事实上，与SEQ ID NO10或14至少60％同源、优选至少70％同源、更优选至少80％同源、最优选至少90％同源的任何编码具类肝素酶活性的多肽的多核苷酸序列，均在本发明的范围内。
本发明还提供单链多核苷酸片段，此片段包括与编码具如上述类肝素酶活性之多肽的多核苷酸链的至少一部分互补的多核苷酸序列。术语“互补”在此用于指碱基配对的能力。
此单链多核苷酸片段可为DNA或RNA，甚至包括核苷酸类似物(例如硫代核苷酸)，它可为合成的寡核苷酸或由转导的宿主细胞制备，它可为仍能提供特异碱基配对的任何希望的长度(例如长8或10个核苷酸，优选更多核苷酸)，且它可包括不妨碍碱基配对的错配序列。
本发明进一步提供包括编码具类肝素酶催化活性之多肽的多核苷酸序列的载体。
载体可为任何类型。它可为感染细菌的噬菌体或感染真核细胞的病毒。它也可为质粒、噬菌粒、粘粒、杆粒或人工染色体。编码具类肝素酶催化活性的多肽的多核苷酸序列可包括上述的任何多核苷酸片段。
本发明进一步提供包括编码具类肝素酶催化活性之多肽的外源多核苷酸片段的宿主细胞。
外源多核苷酸片段可为以上描述的任何片段。宿主细胞可为任何类型。它可为原核细胞、真核细胞、细胞系或作为生物体一部分的细胞。外源多核苷酸片段可永久或瞬时存在于细胞中。换而言之，按稳定或瞬时转染、转化或转导获得的转导细胞均在本发明范围内。在此运用的术语“外源的”指多核苷酸片段是从外部引入细胞的。其中多核苷酸片段可以任何挎贝数单个存在，它可整合到一或多个染色体的任何部位或作为染色体外物质存在。
本发明进一步提供包括过量表达类肝素酶催化活性的细胞的类肝素酶过量表达系统。细胞可为被包括编码具类肝素酶活性之多肽的多核苷酸序列和指导类肝素酶过量表达的合适的启动子和增强子序列的任何适当载体瞬时或稳定转染或转化的宿主细胞。过量表达细胞也可以是在表达细胞的内源类肝素酶基因上游插入启动子和/或增强子序列(例如通过同源重组)而得到的细胞，此插入将指导从内源基因的过量表达。在以下说明书和权利要求中所用的术语“过量表达”指在其它条件相同下表达水平高于给定细胞通常具有的表达基础水平。
本发明进一步提供包括具类肝素酶催化活性的多肽的重组蛋白。
重组蛋白可通过任何常规的蛋白纯化方法纯化至几乎均质和/或与添加物混合。重组蛋白可运用以上描述的任何细胞制备。重组蛋白可以任何形式存在可为结晶形式、脱水干粉形式或存在于溶液中。重组蛋白可用于获得纯类肝素酶，纯类肝素酶又可用于产生单克隆或多克隆的抗类肝素酶抗体，并作为抗类肝素酶抑制剂或药物筛选试验或系统中的筛选活性组分。
本发明进一步提供包括具类肝素酶催化活性的重组蛋白作为活性组分的药物组合物。
局部给药的制剂可包括，但不限于洗液，药膏，凝胶剂，膏状物，栓剂，滴剂，液体，喷雾剂和粉末。常规的水性、粉状或油基药学载体、增稠剂及其它是必要的或所希望的。外被的保险套、斯坦特固定膜、活动的垫及其它医疗装置也有用。事实上，本发明的范围包括含有具类肝素酶催化活性的重组蛋白作为活性组分的任何医疗设备，如医疗装置。
口服的组合物包括粉末或颗粒，水或非水介质中的悬浮液或溶液，粉袋、胶囊或片剂。增稠剂、稀释液、调味品、分散辅助剂、乳化剂或粘合剂也可能合乎需要。
用于胃肠外给药的制剂可包括，但不限于无菌水溶液，其中还可包含缓冲液、稀释液和其它合适添加物。
所用剂量取决于待治疗疾病的严重性和反应性，但通常为每天1剂或更多，疗程为几天至几个月或者直到治疗有效或病状成功减低。本领域的普通技术人员能很容易确定最佳剂量、给药方法和重复率。
本发明还提供鉴定铺展的染色体上包含人类肝素酶基因的染色体区的方法。该方法包括以下方法步骤，其中第一步将铺展的染色体(细胞间期或中期)与编码类肝素酶的标记多核苷酸探针杂交。此标记优选荧光标记。第二步中，洗涤铺展的染色体，从而除去过剩的未杂交探针。最后查找与杂交的标记多核苷酸探针相关的信号，其中探测到的信号指示包含人类肝素酶基因的染色体区。本领域的普通技术人员会懂得如何在合适的标记反应中运用在此公开的序列以及如何运用标记的探针在原位杂交中探测包含人类肝素酶基因的染色体区。
现参照下述实施例，这些实施例及上述说明书均以非限制方式一起阐明本发明。
实施例以下方法和实验细节在随后的实施例中引用。
从人肝癌细胞系和人胎盘纯化类肝素酶并进行特性鉴定选择人肝癌细胞系(SK-hep-1)作为纯化人肿瘤衍生的类肝素酶的来源。基本上如授予Fuks的美国专利No.5,362,641中所描述的进行纯化，所述的专利全文收入参考文献。简要的，悬浮培养500升5×1011细胞，类肝素酶通过应用以下步骤提纯240,000倍(i)在pH6.0，NaCl梯度0.3-1.4M进行阳离子交换(CM-Sephadex)层析，(ii)在pH7.4，0.1％CHAPS存在时，NaCl梯度0.3-1.1M，进行阳离子交换(CM-Sephadex)层析；(iii)在pH7.4，0.1％CHAPS存在时，NaCl梯度0.35-1.1M，进行肝素-Sepharose层析；(iv)在pH6.0，包含0.1％CHAPS和1M NaCl的缓冲液中进行Con A-琼脂糖凝胶层析，用0.25M α-甲基甘露糖苷洗脱；和(v)在pH7.4，0.1％CHAPS存在时，用NaCl梯度0.25-1M进行HPLC阳离子交换(Mono-S)层析。
合并活性级分，TCA沉淀，对沉淀物进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和/或胰酶消化和反相HPLC。纯化蛋白的胰酶消化肽通过反向HPLC(C8柱)分离，对均质的峰进行氨基酸序列分析。
对纯化的酶进行反相HPLC，并用氨基酸顺序分析仪(AppliedBiosystems)进行N-末端氨基酸测序。
细胞如前述由牛眼建立牛角膜内皮细胞(BCEC)的培养物(19，38)。培养物原代维持在补充10％新生小牛血清和5％FCS的DMEM(1g葡萄糖/升)中。活跃细胞生长阶段，每隔一天加bFGF(1ng/ml)(13，14)。
铺有ECM的皿的制备将BCEC(2-50代)以2×105细胞/毫升的初始密度铺在4孔板中，在无硫酸盐的Fisher培养基加5％葡聚糖T-40中培养12天。在接种后第一天和第5天加入Na235SO4(25μCi/ml)，将培养物与标记物温育，不换培养基。用含0.5％Triton X-100和20mMNH4OH的PBS溶解(5分钟，室温)细胞层，随后PBS洗4次，暴露内皮下ECM。ECM保持完整，无细胞碎片，并牢固附着于组织培养皿的全部区域上(19，22)。
为制备可溶的硫酸盐标记的蛋白多糖(峰I物质)，用胰酶消化ECM(胰酶25μg/ml，6h，37℃)，消化液通过反透析浓缩，将浓缩物质加到Sepharose 6B凝胶过滤柱上。收集得到的高分子量物质(Kav＜0.2，峰I)。结果显示多于80％的标记物质由硫酸乙酰肝素蛋白多糖组成(11，39)。
类肝素酶活性将细胞(1×106/35mm培养皿)、细胞溶解产物或条件培养基在20mM磷酸盐缓冲液(pH6.2)存在时于35S标记的ECM上温育(18h，37℃)。也将细胞溶解产物和条件培养基与硫酸盐标记的峰I物质(10-20μl)温育。收集温育培养基，离心(18000×g，4℃，3分钟)，在Sepharose CL-6B柱(0.9×30cm)上凝胶过滤分析硫酸盐标记的物质。用PBS洗脱级分(0.2ml)，流速为5ml/h，用Bio-fluor液闪计数放射性。兰色葡聚糖表示已占体积(Vo)，酚红表示总内含体积(Vt)。后者与自由硫酸根共迁移(7，11，23)。HS侧链的裂解片段在0.5＜Kav＜0.8(峰II)从Sepharose 6B洗脱(7，11，23)。在Vo后洗脱(Kav＜0.2，峰I)由胰酶从ECM释放的近乎完整的HSPG，以及与PBS单独温育时较低程度释放的HSPG。加到柱上的标记物质的回收在不同实验中范围从85％-95％(11)。每个实验至少进行3次，洗脱位置(Kav值)变化不超过+/-15％。
hpa cDNA的克隆从I.M.A.G.E协会(2130 Memorial ParkwaySW，Hunstville，AL 35801)得到cDNA克隆257548和260138。cDNA最初克隆到质粒载体pT3T7D-Pac的EcoR I和Not I克隆位点。尽管这两个克隆被报导略有区别，但DNA序列分析测定证明它们彼此相同。Marathon RACE(cDNA末端的快速扩增)人胎盘(多聚腺苷酸)cDNA复合体由Tel Aviv大学Yossi Shiloh教授赠送。此复合体不含载体，包括反转录的cDNA片段，所述片段的两末端均连接了双链和部分单链的衔接子。所用特异复合体的结构在参考文献39a中描述。
根据Clontech实验室提供的方法，进行hp3 PCR片段的扩增。扩增所用的模板是来自以上复合体的样品。扩增所用的引物为第一步5′-引物AP15′-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3′，SEQ ID NO1；3′-引物HPL2295′-GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC-3′，SEQ ID NO2。
第二步嵌套5′-引物AP25′-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3′，SEQID NO3；嵌套3′-引物HPL1715′-GCATCTTAGCCG TCTTTC TTCG-3′，SEQ ID NO4。HPL229和HPL171是根据EST克隆的序列选择的。它们各自包括SEQ ID NO9的核苷酸933-956和876-897。
PCR程序为94℃4分钟，而后94℃40秒、62℃1分钟、72℃2.5分钟30个循环。用Expand High Fidelity(Boehringer Mannheim)进行扩增。将所得约900bp的hp3 PCR产物用Bfr I和PvuII消化。用EcoR I消化克隆257548(phpa1)，末端补平，然后Bfr I进一步消化。此后将hp3 PCR产物的PvuII-Bfr I片段克隆至phpa1克隆的平端-Bfr I端，得到完整cDNA克隆在pT3T7-pac中的载体，称为phpa2。
DNA测序序列测定用载体特异性和基因特异性引物，使用自动DNA测序仪(Applied Biosystems 373A型)进行。每个核苷酸读自至少两个独立的引物。
序列的计算机分析运用Blast网络服务器进行数据库检索分析序列相似性。对DNA和蛋白序列的序列分析和对比用Wisconsin大学Genetic Computer Group(GCG)开发的DNA序列分析软件包完成。
RT-PCR用TRI-Reagent(Molecular research center Inc.)根据生产制造商指导制备RNA。取1.25μg RNA进行逆转录反应，采用MuMLV反转录酶(Gibco BRL)和Oligo(dT)15引物，SEQ ID NO5，(Promega)。用Taq聚合酶(Promega)进行所得第一链cDNA的扩增。运用以下引物HPU-3555′-TTCGATCCCAAGAAGGAATCAAC-3′，SEQ ID NO6，SEQ ID NO9或11中的核苷酸372-394。HPL-2295’-GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC-3′，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9或11中的核苷酸933-956。PCR程序94℃4分钟，然后94℃40秒、62℃1分钟、72℃1分钟30个循环。
重组类肝素酶在昆虫细胞中的表达将细胞、High Five和Sf21昆虫细胞系在SF900II-SFM培养基(Gibco BRL)中作为单层培养物维持培养。
重组的杆状病毒用Bac to Bac系统(GibcoBRL)构建包含hpa基因的重组病毒。转移载体pFastBac用Sal I和Not I消化，并与XhoI和Not I消化的phpa2的1.7kb片段连接。所得质粒称为pFasthpa2。重复制备命名为pFasthpa4的相同质粒，二者独立地应用于进一步的实验中。根据生产制造商的说明，用pFasthpa2、pFasthpa4和pFastBac产生重组杆粒。后者作为阴性对照。转染重组杆粒DNA到Sf21昆虫细胞中。转染5天收获重组病毒并用其感染T-25瓶中的3×106个High Five昆虫细胞。感染后2-3天后收获细胞。将4×106个细胞离心，重悬于包含20mM磷酸柠檬酸盐缓冲液、50mMNaCl的反应缓冲液中。细胞经过三个冻融循环，溶解产物保存在-80℃。条件培养基保存在4℃。
重组类肝素酶的部分纯化通过肝素-Sepharose柱层析，随后通过Superdex 75柱凝胶过滤进行重组类肝素酶的部分纯化。对pFhpa4病毒感染的Sf21细胞的培养基(150ml)进行肝素-Sepharose层析。在含0.1％CHAPS和1mM DTT的10mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)存在时用0.35-2M NaCl梯度洗脱1ml级分。检测每级分25μl样品的类肝素酶活性。类肝素酶活性在0.65-1.1M NaCl范围洗脱(级分18-26，图10a)。对每级分中5μl进行15％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色。合并从肝素-Sepharose洗脱的活性级分(图10a)并在YM3截留膜上浓缩(X6)。将0.5ml的浓缩物质加到30ml Superdex 75 FPLC柱上，该柱用含0.8M NaCl、1mM DTT和0.1％CHAPS的10mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)平衡过。以流速0.75ml/分钟收集各级分(0.56ml)。从每级分中取等分检测类肝素酶活性，并进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色(图11b)。
实施例1
hpa基因的克隆将从人肝癌细胞(SK-hep1)分离的类肝素酶的纯化级分进行胰酶消化和微量测序。筛选EST(表达序列标记)数据库以寻找相应于所获肽的DNA序列的同源物。两个EST序列(登记号N41349和N45367)中包含编码肽YGPDVGQPR(SEQ ID NO8)的DNA序列。这两个序列衍生自从8-9周胎盘的cDNA文库(Soares)制备的克隆257548和260138(I.M.A.G.E.协会)。发现两个克隆是相同的，它们包括1020bp的一个插入片段，此插入片段包含973bp的开放阅读框(ORF)及随后的27bp 3′非翻译区和聚腺苷酸尾。在这些克隆的5′末端未鉴定到翻译起始位点(AUG)。
通过对胎盘Marathon RACE cDNA复合体的DNA进行PCR扩增，进行对缺失的5′末端的克隆。获得900bp的片段(命定为hp3)，它与已鉴定的3′编码EST克隆部分重叠。
连接的cDNA片段长1721bp(SEQ ID NO9)，它包括编码543个氨基酸、计算分子量为61 192道尔顿的多肽(SEQ ID NO10)的开放阅读框，如图1和SEQ ID NO11所示。克隆257548和260138中包括的部分cDNA插入片段的3′末端起始于SEQ ID NO9和图1的核苷酸G721。
如图1中进一步显示，在EST克隆和PCR扩增序列之间有单个序列差异，导致EST中的Tyr246替换为扩增的cDNA中的Phe246。从两个独立的扩增产物证实PCR扩增的cDNA片段的核苷酸序列。该新基因命名为hpa。
如上所述，EST克隆257548和260138中所含的部分cDNA插入片段的3′末端起始于hpa(SEQ ID NO9)的核苷酸721。运用计算机模拟分析hpa cDNA形成稳定二级结构、如包括在721位附近的核苷酸序列的茎和环结构的能力。研究发现，在核苷酸698-724(SEQ IDNO9)之间很可能形成稳定的茎环结构。此外，hpa基因的5′末端区具高GC含量的特点，GC含量高达70％，而在3′区，GC含量仅为约40％。这些发现可解释EST克隆的不成熟终止及因此引起的5′末端缺失。
为检测hpa基因产物在体外试验中催化硫酸乙酰肝素降解的能力，用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达完整的开放阅读框。包含hpa基因的病毒所感染的细胞的提取物表现有高水平的硫酸乙酰肝素降解活性，而在以不含hpa基因的类似构建体感染的细胞及未感染细胞的提取物中则不含此活性。这些结果在随后的实施例中进一步说明。
实施例2可溶的ECM衍生的HSPG的降解以包含pFasthpa质粒的重组杆状病毒或含无插入片段的质粒的对照病毒感染High Five细胞的单层培养物(72h，28℃)。收获细胞，在类肝素酶反应缓冲液中经过三个冻融循环使之裂解。随后将细胞裂解物与硫酸盐标记的ECM衍生HSPG(峰I)温育(18h，37℃)，再对反应混和物进行凝胶过滤分析(Sepharose 6B)。
如图2所示，底物本身包括在Vo之后洗脱的几乎所有高分子量(Mr)物质(峰I，级分5-20，Kav＜0.35)。当HSPG底物与以对照病毒感染的细胞的裂解物温育时，得到相似的洗脱图。与之形成对照，HSPG底物与以包含hpa的病毒感染的细胞的裂解物温育，导致高分子量底物完全转换为低分子量的标记降解片段(峰II，级分22-35，0.5＜Kav＜0.75)。
在峰II洗脱的片段显示是硫酸乙酰肝素的降解产物，因为它们(i)比用碱性氢硼化物或木瓜蛋白酶处理而从ECM释放的完整硫酸乙酰肝素侧链(Kav近似0.33)小5-6倍；且(ii)抗木瓜蛋白酶或软骨素酶ABC的进一步消化，且对亚硝酸脱氨基作用敏感(6，11)。
在Sf21细胞中获得相似的结果(未给出)。同样，在以含hpa的病毒(pFhpa)感染的细胞中探测到类肝素酶活性，而在以对照病毒(pF)感染的细胞中检测不到。此结果是从两个独立产生的重组病毒获得的。未感染的High Five细胞对照的裂解物无法降解HSPG底物。
在随后的实验中，将标记的HSPG底物与感染的High Five或Sf21细胞的条件培养基温育。
如图3a-b所示，由高Mr峰I底物向代表HS降解片段的低Mr峰II的转变所反映的类肝素酶活性，发现存在于pFhpa2或pFhpa4病毒而非对照pF1或pF2病毒感染的细胞的培养基中。在对照未感染的High Five或Sf21细胞的培养基中未探测到类肝素酶活性。
将以pFhpa4病毒感染的细胞的培养基通过50kDa截留膜，从而获得对重组类肝素酶的分子量的粗略估定。如在图4中说明，所有的酶活性保留在上层部分，而流过(＜50kDa)物质中无活性。此结果与hpa基因产物的预期分子量一致。
为进一步表征肝素对hpa产物的抑制作用，检查类肝素酶介导的HS降解的强抑制剂(40)。
如图5a-b所示，由峰I底物向峰IIHS降解片段的转变在肝素存在时被彻底消除。
综上所述，这些结果表明被包含新鉴定的人hpa基因的杆状病毒感染的昆虫细胞以活性形式表达类肝素酶。
实施例3完整ECM中HSPG的降解接着研究完整的感染昆虫细胞降解完整、天然产生的ECM中的HS的能力。为此目的，将High Five或Sf21细胞接种在代谢性地硫酸盐标记的ECM上，随后用pFhpa4或对照pF2病毒感染(48h，28℃)。而后将培养基pH调到6.2-6.4，细胞在标记ECM中进一步培养48h(28℃)或24h(37℃)。对释放到温育培养基中的硫酸盐标记物质进行Sepharose 6B上的凝胶过滤分析。
如图6a-b和7a-b所示，ECM与对照pF2病毒感染的细胞温育造成标记物质的恒定释放，此标记物几乎全部(＞90％)由在Vo之后或与之同洗脱的高Mr片段(峰I)组成。以前的研究显示，存在于ECM本身和/或由细胞表达的蛋白水解活性负责高Mr物质的释放(6)。此近乎完整的HSPG为类肝素酶进行的随后降解提供了可溶底物，类肝素酶被肝素抑制时相对大量的峰I物质积累也说明了这一点(6，7，12，图9)。另一方面，标记的ECM与pFhpa4病毒感染的细胞温育导致60％-70％的ECM相关放射性以低Mr的硫酸盐标记片段的形式(峰II，0.5＜Kav＜0.75)释放，而不论感染细胞与ECM是在28℃还是在37℃温育。对照完整未感染Sf21或High Five细胞无法降解ECM HS侧链。
在随后的实验中，如图8a-b所示，以pFhpa4或对照pF1病毒感染High Five细胞和Sf21细胞(96h，28℃)，将培养基与硫酸盐标记的ECM一起温育。仅在与pFhpa4感染细胞的条件培养基温育时，才从ECM释放低Mr HS降解片段。如图9所示，肝素存在时，这些片段不再产生。在对照未感染细胞的培养基中，未检测到类肝素酶活性。这些结果说明pFhpa4病毒感染的细胞所表达的类肝素酶，当其与天然产生的完整ECM的其它大分子成分(即纤连蛋白，层粘连层白，胶原蛋白)复合时，能以类似于报导的高度转移肿瘤细胞或免疫系统活化细胞中的方式降解HS(6，7)。
实施例4重组类肝素酶的纯化通过肝素-Sepharose层析从pFhpa4感染的Sf21细胞的培养基中部分纯化重组类肝素酶(图10a)，随后对合并活性级分通过FPLCSuperdex 75柱凝胶过滤(图11a)。观察到1个63kDa蛋白，如银染SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳所探测的，其量与有关柱级分中的类肝素酶活性相关(分别为图10b和11b)。此蛋白在对照pF1病毒感染细胞的培养基中未探测到，将其加到肝素-Sepharose上进行相似分级分离(未示)。
实施例5各种细胞类型、器官和组织中hpa基因的表达参考图12a-e，应用RT-PCR估计各种细胞类型和组织中hpa基因的表达。为此目的，反转录总RNA并扩增之。在人肾、胎盘(8和11周)和痣组织中，以及在新鲜分离的和短期(1.5-48h)培养的人胎盘细胞滋养层细胞中，清楚显示有预期的585bp长的cDNA(图12a)，以上细胞均已知表达高类肝素酶活性(41)。正常人嗜中性粒细胞也表达hpa转录物(图12b)。与之形成对照，在胚胎人肌肉组织、胸腺、心脏和肾上腺中，无可检测水平的hpa mRNA表达(图12b)。部分而非所有人膀胱癌细胞系(图12c)、SK肝癌(SK-hep-1)，卵巢癌(OV1063)、乳腺癌(435，231)、黑素瘤和巨核细胞(DAMI，CHRF)人细胞系(图12d-e)表达hpa基因。
以上描述的hpa转录本的表达模式经确定与各种组织和细胞类型中测定的类肝素酶活性水平有极好相关性(未示)。
实施例6hpa同源基因筛选EST数据库，寻找与hpa基因同源的序列。鉴定到三种小鼠EST(登记号Aa177901，源于小鼠脾，Aa067997源于小鼠皮肤，Aa47943源于小鼠胚)，将其装配为包含629bp的部分开放阅读框(缺失5′末端)和195bp的3′非翻译区的824bp cDNA片段(SEQ ID NO12)。如图13所示，编码区与hpa cDNA序列的3′末端80％相似。这些EST很可能是编码小鼠类肝素酶的小鼠hpa同源物的cDNA片段。
搜寻共有序列蛋白区，发现类肝素酶和几种前体蛋白如前胶原蛋白Alpha1前体，酪氨酸蛋白激酶RYK，Fibulin-1，胰岛素样生长因子结合蛋白和几种其它蛋白间在氨基末端有同源性。此氨基末端高度疏水并包含潜在的跨膜区。与已知信号肽序列的同源性说明它能作为信号肽为蛋白定位发挥功能。
实施例7从人SK-hep1细胞系分离hpa cDNA的延伸5′末端使用Marathon RACE(cDNA末端快速扩增)试剂盒(Clontech)，通过PCR扩增从人SK-hep1细胞系分离hpa cDNA的5′末端。按照生产制造商说明使用TRI-Reagent(Molecular research center Inc.)从SK-hep1细胞制备总RNA。使用mRNA分离试剂盒(Clonetech)分离PolyA+RNA。
按照生产制造商推荐构建Marathon RACE SK-hep1 cDNA复合体。使用衔接子特异引物AP15′-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3′(SEQ ID NO1)，和相应于SEQ ID NO9核苷酸119-99的hpa特异性反义引物hpl-6295′-CCCCAGGAGCAGCAGCATCAG-3′(SEQ IDNO17)，进行第一轮扩增。所得PCR产物进行第二循环扩增，使用衔接子特异性嵌套引物AP25′-ACTCACTATAGGGCTC GAGCGGC-3′，SEQ ID NO3，和相应于SEQ ID NO9核苷酸83-63的hpa特异性反义嵌套引物hpl-666 5′-AGGCTTCGAGCGCAGCAGCAT-3′，SEQ IDNO18。PCR过程如下热起始94℃1分钟，随后30个循环90℃30秒，68℃4分钟。从琼脂糖胶提取所获的300bp DNA片段，将其克隆到载体pGEM-T Easy(Promega)中。获得的重组质粒命名为pHPSK1。
确定pHPSK1插入片段的核苷酸序列，发现其包括胎盘hpa cDNA(SEQ ID NO9)5′末端的62个核苷酸和上游的额外178个核苷酸，即SEQ ID NO13和15的头178个核苷酸。
鉴定到SK-hep1 cDNA和胎盘cDNA之间有单个核苷酸差异。胎盘cDNA(SEQ ID NO9)第9位的“T”衍生物，在SK-hep1 cDNA(SEQID NO13)的相应第187位被“C”衍生物替换。
此差异可能是由于在胎盘cDNA克隆的5′末端有突变，通过对从胎盘分离的几个额外cDNA克隆(它们如SK-hep1 cDNA一样在SEQ IDNO9的第9位包括C)进行序列分析证实了这一点。
将SK-hep1 hpa cDNA的5′延伸序列与从人胎盘分离的hpa cDNA序列(SEQ ID NO9)装配起来。装配后序列包括编码如SEQ ID NO14和15中所示计算分子量为66407道尔顿的592个氨基酸的多肽的开放阅读框。该开放阅读框侧接有93bp的5′非翻译区(UTR)。
实施例8hpa基因的上游基因组区的分离使用Genome Walker试剂盒(Clontech)，按照生产制造商说明分离hpa基因的上游区。此试剂盒包括5种人基因组DNA样品，每个样品用不同限制性核酸内切酶消化产生平末端EcoRV，ScaI，DraI，PvuII和SspI。
将平末端DNA片端与部分单链的衔接子连接。使用衔接子特异性引物和基因特异性引物，对基因组DNA样品进行PCR扩增。使用ExpandHigh Fidelity(Boehringer Mannheim)扩增。
第一循环扩增使用ap1引物5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′，SEQ ID NO19，和相应于SEQ ID NO9核苷酸83-63的hpa特异性反义引物hpl-6665′-AGGCTTCG AGCGCAGCAGCAT-3′，SEQ IDNO18。PCR程序如下热起始94℃3分钟，然后36个循环，每循环为94℃40秒67℃4分钟。
将第一次扩增的PCR产物按1∶50稀释。将稀释样品的1μl用作第二次扩增的模板，其中使用嵌套的衔接子特异性引物ap25′-ACTATA GGGCACGCGTGGT-3′，SEQ ID NO20，和相应于SEQ ID NO9核苷酸62-42的hpa特异性反义引物hpl-690，5′-CTTGGGCTCACCTGGCTGCTC-3′，SEQ ID NO21。所得的扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析。从5个扩增反应获得5种不同的PCR产物。从凝胶中提取SspI消化DNA样品所得的约750bp的DNA片段。将纯化的片段连接到质粒载体pGEM-T Easy(Promega)上。所获的重组质粒命名为pGHP6905，确定hpa插入片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO16中给出了594个核苷酸的部分序列。SEQ ID NO16的最后一位核苷酸相应于SEQ ID NO13的核苷酸93。SEQ ID NO16中的DNA序列包括hpa cDNA的5′区和被预测为包括hpa基因启动子区的基因组上游区501个核苷酸。
实施例9
592个氨基酸的HPA多肽在人293细胞系中的表达通过将相当于SK-hep1 hpa cDNA 5′末端的110bp与胎盘cDNA相连，构建592个氨基酸的开放阅读框(SEQ ID NO13和15)。更具体而言，将胎盘hpa DNA的Marathon RACE-PCR扩增产物用Sac I消化，并将近似1kb片段连接到Sac I消化的pGHP6905质粒中。所得质粒用Ear I和Aat II消化，钝化Ear I粘性末端，分离出约280bp的Ear I/已钝化Aat II片段。使用Klenow片段补平EcoR I消化的pFasthpa，并进一步用Aat II消化，将所得pFasthpa与上述片段连接。所获质粒包括1827bp的插入片段，此插入片段包括1776bp的开放阅读框，31bp的3′UTR和21bp的5′UTR。此质粒命名为pFastLhpa。
构建哺乳动物表达载体以驱动592个氨基酸的类肝素酶多肽在人细胞中表达。用BssHII和Not I从pFastLhpa切下hpa cDNA。将所得1850bp的BssHI I-Not I片段连接到Mlu I和Not I消化的哺乳动物表达载体pSI(Promega)中。将所得重组质粒pSIhpaMet2转染到人293胚胎肾细胞系中。
592个氨基酸的类肝素酶的瞬时表达通过Western印迹分析检测，使用凝胶移位试验检查酶活性。这些操作在1998年5月1日提交的美国专利申请NO.09/071,739中有详细描述，此申请在此全文纳入参考文献。转染后3天收获细胞。将收获的细胞重悬于包括150mMNaCl，50mM Tris pH7.5，1％Triton X-100，1mM PMSF和蛋白酶抑制剂混和物(Boehringer Mannheim)的裂解缓冲液中。对40μg蛋白提取物样品进行SDS-PAGE分离。将蛋白转到PVDF Hybond-P膜(Amersham)上。将膜与亲合纯化的多克隆抗类肝素酶抗体温育(如美国专利申请号09/071,739中所述)。在转染细胞中观察到约50kDa的主带及约65kDa的次带。在pShpa转染的细胞的提取物中观察到相似的图(如美国专利申请号09/071,739中所述)。这两条带很可能代表转染细胞产生的重组类肝素酶蛋白的两种形式。65kDa蛋白很可能代表类肝素酶前体，而50kDa蛋白在此推测为已加工或成熟形式。
pShpaMet2转染细胞中表达的重组蛋白的催化活性通过凝胶移位试验检测。转染细胞和模拟转染细胞的提取物在含20mM磷酸柠檬酸盐缓冲液(pH5.4)，1mM CaCl2，1mM DTT和50mM NaCl的反应体系中于37℃与肝素(每反应6μg)温育过夜。然后将反应混合物在10％聚丙烯酰胺凝胶上分离。与转染细胞提取物温育的肝素分子与对照相比快速迁移，这清楚表明了重组类肝素酶的催化活性。快速迁移说明高分子量肝素分子的消失和低分子量降解产物的产生。
实施例10hpa基因的染色体定位利用从UK HGMP Resource Center(Cambridge，England)获得的单染色体人/CHO和人/小鼠体细胞杂合体板对hpa基因进行染色体作图。
对40ng每种体细胞杂合体DNA样品进行PCR扩增，使用相应于SEQ ID NO9核苷酸564-586的hpa引物hpa565 5′-AGCTCTGTAGATGTGCTATACAC-3′(SEQ ID NO22)，和相应于SEQ IDNO9核苷酸897-876的反义引物hpl 171 5′-GCATCTTAGCCGTCTTTCTTCG-3′(SEQ ID NO23)。
PCR程序如下94℃3分钟热起始，然后7个循环94℃45秒、66℃1分钟、68℃5分钟，随后30个循环94℃45秒、62℃1分钟、68℃5分钟、最后72℃10分钟延伸。
反应用Expand long PCR(Boehringer Mannheim)进行。所得扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析。如图14所述，从染色体4及对照人基因组DNA获一条约2.8kb的带。2.8kb的扩增产物被认为是基于对基因组hpa克隆的扩增(未示数据)。在小鼠和仓鼠的对照DNA样品和其它人染色体的体细胞杂合体中，都未获得扩增产物。
尽管结合具体实施方案描述了本发明，但对本领域技术人员而言，显然还有许多变换方式、修改和变动。所以，本发明包括落入所附权利要求精神和宽范围内的所有这些变换方式、修改和变动。
上文按数字引用的参考文献列表1. Wight.T.N.，Kinsella，M.G.，和Qawrnstromn.E.E.(1992)，蛋白多糖在细胞粘附，迁移和增殖中的作用。Curr.Opin.Cell Biol.4,793,8012. Jackson，R.L.，Busch，S.J和Cardin，A.L.(1991)，糖胺聚糖分子特性，蛋白相互作用及在生理过程中的作用。Physiol.Rev.，71，481-539.3. Wight，T.N.(1989)动脉蛋白多糖的细胞生物学，Arteriosclerosis，9，1-204. Kjellen，L.，和Lindahl，U.(1991)蛋白多糖结构和相互作用。生物化学年度综述(Annu.Rev.Biochem.)，60443-4755. Ruoslahti，E.，和Yamaguchi，Y.(1991)蛋白多糖作为生长因子活性的调节子。细胞(Cell)，64，867-8696. Vlodavsky，I.，Eldor，A.，Haimovitz-Friedman，A.，Matzner，Y.，Ishai-Michaeli，R.，Levi，E.，Basbkin，P.，Lider，O.，Naparstek，Y.，Cohen，I.R.，和Fuks，Z.(1992)类肝素酶通过血小板和免疫系统的循环细胞的表达在血细胞渗出和外渗中的可能参与Invasion & Metastasis，12112-1277. Vlodasky，I.，Mohsen，M.，Lider，O.，Ishai-Michaeli，R.，Ekre，H.-P.，Svahn，C.M.，Vigoda，M.，和Peretz，T.(1995).类肝素酶抑制型肝素对肿瘤转移的抑制。Invasion & Metastasis，14，290-302.8. Nakajima，M.，Irimura，T.，和Nicolson，G.L.(1988).类肝素酶和肿瘤转移，细胞与生物化学杂志(J.Cell.Biochem.)，36157-1679. Nicolson，G.L(1988).肿瘤转移的器官特异性在特异二级位点恶性细胞优先粘附，侵入和生长的作用，Cancer Met.Rev.7，143-188.10. 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序列表(1)一般信息(i)申请人 Iris Pecker，Israel Vlodavsky 和 ElenaFreinstein(ii)发明名称 编码具类肝素酶活性的多肽的多核苷酸及其在转导细胞中的表达(iii)序列数 23(iv)通信地址(A)地址Mark M.Friedman c/o Robert Sheinbein(B)街 2940 Birchtree Lane(C)城市Silver Spring(D)州 Maryland(E)国家美国(F)邮政编码20906(v) 机读形式(A)介质类型1.44M，3.5吋软盘(B)计算机Twinhead*Slimnote-890TX(C)操作系统MS DOS6.2版视窗3.11版(D)软件相应视窗2.0的Word，转化为ASCI文件(vi)当前申请信息(A)申请号(B)申请日(C)分类(vii)在先申请信息(A)申请号 08/922，170(B)申请日1997年9月2日(viii)律师/代理人信息(A)名字Friedmam，Mark M.
(B)登记号 33，883(C)参考/摘要号910/1(ix)电信信息(A)电话972-3-5625553(B)传真972-3-5625554(C)电报(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度 27(B)类型 核酸(C)链型 单链(D)拓朴结构线状(xi)序列描述SEQ ID NO1CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC 27(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度 24(B)类型 核酸(C)链型 单链(D)拓朴结构线状(xi)序列描述SEQ ID NO2GTAGTGATGC CATGTAACTG AATC 24(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度23(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构 线状(xi)序列描述SEQ ID NO3
ACTCACTATA GGGCTCGAGC GGC 23(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度22(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构 线状(xi)序列描述SEQ ID NO4GCATCTTAGC CGTCTTTCTT CG 22(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度15(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构 线状(xi)序列描述SEQ ID NO5TTTTTTTTTT TTTTT 15(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度23(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构 线状(xi)序列描述SEQ ID NO6TTCGATCCCA AGAAGGAATC AAC 23(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度24(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓朴结构 线状(xi)序列描述SEQ ID NO7GTAGTGATGC CATGTAACTG AATC 24(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度9(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓朴结构 线状(xi)序列描述SEQ ID NO8Tyr Gly Pro Asp Val Gly Gln Pro Arg5 9(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度1721(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓朴结构 线状(xi)序列描述SEQ ID NO9CTAGAGCTTT CGACTCTCCG CTGCGCGGCA GCTGGCGGGG GGAGCAGCCA GGTGAGCCCA 60AGATGCTGCT GCGCTCGAAG CCTGCGCTGC CGCCGCCGCT GATGCTGCTG CTCCTGGGGC 120CGCTGGGTCC CCTCTCCCCT GGCGCCCTGC CCCGACCTGC GCAAGCACAG GACGTCGTGG 180ACCTGGACTT CTTCACCCAG GAGCCGCTGC ACCTGGTGAG CCCCTCGTTC CTGTCCGTCA 240CCATTGACGC CAACCTGGCC ACGGACCCGC GGTTCCTCAT CCTCCTGGGT TCTCCAAAGC 300TTCGTACCTT GGCCAGAGGC TTGTCTCCTG CGTACCTGAG GTTTGGTGGC ACCAAGACAG 360ACTTCCTAAT TTTCGATCCC AAGAAGGAAT CAACCTTTGA AGAGAGAAGT TACTGGCAAT 420CTCAAGTCAA CCAGGATATT TGCAAATATG GATCCATCCC TCCTGATGTG GAGGAGAAGT 480TACGGTTGGA ATGGCCCTAC CAGGAGCAAT TGCTACTCCG AGAACACTAC CAGAAAAAGT 540TCAAGAACAG CACCTACTCA AGAAGCTCTG TAGATGTGCT ATACACTTTT GCAAACTGCT 600CAGGACTGGA CTTGATCTTT GGCCTAAATG CGTTATTAAG AACAGCAGAT 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(D)拓朴结构 线状(xi)序列描述SEQ ID NO12CTGGCAAGAA GGTCTGGTTG GGAGAGACGA GCTCAGCTTA CGGTGGCGGT GCACCCTTGC 60TGTCCAACAC CTTTGCAGCT GGCTTTATGT GGCTGGATAA ATTGGGCCTG TCAGCCCAGA 120TGGGCATAGA AGTCGTGATG AGGCAGGTGT TCTTCGGAGC AGGCAACTAC CACTTAGTGG 180ATGAAAACTT TGAGCCTTTA CCTGATTACT GGCTCTCTCT TCTGTTCAAG AAACTGGTAG 240GTCCCAGGGT GTTACTGTCA AGAGTGAAAG GCCCAGACAG GAGCAAACTC CGAGTGTATC 300TCCACTGCAC TAACGTCTAT CACCCACGAT ATCAGGAAGG AGATCTAACT CTGTATGTCC 360TGAACCTCCA TAATGTCACC AAGCACTTGA AGGTACCGCC TCCGTTGTTC AGGAAACCAG 420TGGATACGTA CCTTCTGAAG CCTTCGGGGC CGGATGGATT ACTTTCCAAA TCTGTCCAAC 480TGAACGGTCA AATTCTGAAG ATGGTGGATG AGCAGACCCT GCCAGCTTTG ACAGAAAAAC 540CTCTCCCCGC AGGAAGTGCA CTAAGCCTGC CTGCCTTTTC CTATGGTTTT TTTGTCATAA 600GAAATGCCAA AATCGCTGCT TGTATATGAA AATAAAAGGC ATACGGTACC CCTGAGACAA 660AAGCCGAGGG GGGTGTTATT CATAAAACAA AACCCTAGTT TAGGAGGCCA CCTCCTTGCC 720GAGTTCCAGA GCTTCGGGAG GGTGGGGTAC ACTTCAGTAT TACATTCAGT GTGGTGTTCT 780CTCTAAGAAG AATACTGCAG GTGGTGACAG TTAATAGCAC TGTG824(2)SEQ ID 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Gly Leu Pro Ala Phe Ser Tyr Ser Phe Phe Val Ile Arg Asn575 580 585Ala Lys Val Ala Ala Cys Ile590 592(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度1899(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓朴结构 线状(xi)序列描述SEQ ID NO15GGG3AAA GCG AGC AAG GAA GTA GGA GAG AGC CGG GCA GGC GGG GCG GGG 48TTG GAT TGG GAG CAG TGG GAG GGA TGC AGA AGA GGA GTG GGA GGG 93ATG GAG GGC GCA GTG GGA GGG GTG AGG AGG CGT AAC GGG GCG GAG 138Met Glu Gly Ala Val Gly Gly Val Arg Arg Arg Asn Gly Ala Glu5 10 15GAA AGG AGA AAA GGG CGC TGG GGC TCG GCG GGA GGA AGT GCT AGA 183Glu Arg Arg Lys Gly Arg Trp Gly Ser Ala Gly Gly Ser Ala Arg20 25 30GCT CTC GAC TCT CCG CTG CGC GGC AGC TGG CGG GGG GAG CAG CCA 228Ala Leu Asp Ser Pro Leu Arg Gly Ser Trp Arg Gly Glu Gln Pro35 40 45GGT GAG CCC AAG ATG CTG CTG CGC TCG AAG CCT GCG CTG CCG CCG 273Gly Glu Pro Lys Met Leu Leu Arg Ser Lys Pro Ala Leu Pro Pro50 55 60CCG CTG ATG CTG CTG CTC CTG GGG CCG CTG GGT CCC CTc TCC CCT 318Pro Leu Met Leu Leu Leu Leu Gly Pro Leu Gly Pro Leu Ser Pro65 70 75GGC GCC CTG CCC CGA CCT GCG CAA GCA CAG GAC GTc GTG GAC CTG 363Gly Ala Leu Pro Arg Pro Ala Gln Ala Gln Asp Val Val Asp Leu80 85 90GAC TTc TTC ACC CAG GAG CCG CTG CAC CTG GTG AGC CCC TCG TTC 408Asp Phe Phe Thr Gln Glu Pro Leu His Leu Val Ser Pro Ser Phe95 100 105CTG TCC GTC ACC ATT GAC GCC AAC CTG GCC ACG GAC CCG CGG TTC 453Leu Ser yal Thr Ile Asp Ala Asn Leu Ala Thr Asp Pro Arg Phe110 115 120CTC ATC CTC CTG GGT TCT CCA AAG CTT CGT ACC TTG GCC AGA GGC 498Leu Ile Leu Leu Gly Ser Pro Lys Leu Arg Thr Leu Ala Arg Gly125 130 135TTG TCT CCT GCG TAC CTG AGG TTT GGT GGC ACC AAG ACA GAC TTC 543Leu Ser Pro Ala Tyr Leu Arg Phe Gly Gly Thr Lys Thr Asp Phe140 145 150CTA ATT TTC GAT CCC AAG AAG GAA TCA ACC TTT GAA GAG AGA AGT 588Leu Ile Phe Asp Pro Lys Lys Glu Ser Thr Phe Glu Glu Arg Ser155 160 165TAC TGG CAA TCT CAA GTC AAC CAG GAT ATT TGC AAA TAT GGA TCC 633Tyr Trp Gln Ser Gln Val Asn Gln Asp Ile Cys Lys Tyr Gly Ser170 175 180ATC CCT CCT GAT GTG GAG GAG AAG TTA CGG TTG GAA TGG CCC TAC 678Ile Pro Pro Asp Val Glu Glu Lys Leu Arg Leu Glu Trp Pro Tyr185 190 195CAG GAG CAA TTG CTA CTC CGA GAA CAC TAC CAG AAA AAG TTC AAG 723Gln Glu Gln Leu Leu Leu Arg Glu His Tyr Gln Lys Lys Phe Lys200 205 210AAC AGC ACC TAC TCA AGA AGC TCT GTA GAT GTG CTA TAC ACT TTT 768Asn Ser Thr Tyr Ser Arg Ser Ser Val Asp Val Leu Tyr Thr Phe215 220 225GCA AAC TGC TCA GGA CTG GAC TTG ATC TTT GGC CTA AAT GCG TTA 813Ala Asn Cys Ser Gly Leu Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu230 235 240TTA AGA ACA GCA GAT TTG GAG TGG AAC AGT TCT AAT GCT CAG TTG 858Leu Arg Thr Ala Asp Leu Gln Trp Asn Ser Ser Asn Ala Gln Leu245 250 255CTC CTG GAC TAC TGC TCT TCC AAG GGG TAT AAC ATT TCT TGG GAA 903Leu Leu Asp Tyr Cys Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Ile Ser Trp Glu260 265 270CTA GGC AAT GAA CCT AAC AGT TTC CTT AAG AAG GCT GAT ATT TTC 948Leu Gly Asn Glu Pro Asn Ser Phe Leu Lys Lys Ala Asp Ile Phe275 280 285ATC AAT GGG TCG CAG TTA GGA GAA GAT TAT ATT CAA TTG CAT AAA 993Ile Asn Gly Ser Gln Leu Gly Glu Asp Tyr Ile Gln Leu His Lys290 295 300CTT CTA AGA AAG TCC ACC TTC AAA AAT GCA AAA GTC TAT GGT CCT 1038Leu Leu Arg Lys Ser Thr Phe Lys Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro305 310 315GAT GTT GGT CAG CCT CGA AGA AAG ACG GCT AAG ATG CTG AAG AGC 1083Asp Val Gly Gln Pro Arg Arg Lys Thr Ala Lys Met Leu Lys Ser320 325 330TTC CTG AAG GCT GGT GGA GAA GTG ATT GAT TCA GTT ACA TGG CAT 1128Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu Val Ile Asp Ser Val Thr Trp His335 340 345CAC TAC TAT TTG AAT GGA CGG ACT GCT ACC AGG GAA GAT TTT CTA 1173His Tyr Tyr Leu Asn Gly Arg Thr Ala Thr Arg Glu Asp Phe Leu350 355 360AAC CCT GAT GTA TTG GAC ATT TTT ATT TCA TCT GTG CAA AAA GTT 1218Asn Pro Asp Val Leu Asp Ile Phe Ile Ser Ser Val Gln Lys Val365 370 375TTC CAG GTG GTT GAG AGC ACC AGG CCT GGC AAG AAG GTC TGG TTA 1263Phe Gln Val Val Glu Ser Thr Arg Pro Gly Lys Lys Val Trp Leu380 385 390GGA GAA ACA AGC TCT GCA TAT GGA GGC GGA GCG CCC TTG CTA TCC 1308Gly Glu Thr Ser Ser Ala Tyr Gly Gly Gly Ala Pro Leu Leu Ser395 400 405GAC ACC TTT GCA GCT GGC TTT ATG TGG CTG GAT AAA TTG GGC CTG 1353Asp Thr Phe Ala Ala Gly Phe Met Trp Leu Asp Lys Leu Gly Leu410 415 420TCA GCC CGA ATG GGA ATA gAA GTG GTG ATG AGG CAA GTA TTC TTT 1398Ser Ala Arg Met Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gln Val Phe Phe425 430 435GGA GCA GGA AAC TAC CAT TTA GTG GAT GAA AAC TTC GAT CCT TTA 1443Gly Ala Gly Asn Tyr His Leu Val Asp Glu Asn Phe Asp Pro Leu440 445 450CCT GAT TAT TGG CTA TCT CTT CTG TTC AAG AAA TTG GTG GGC ACC 1488Pro Asp Tyr Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu Val Gly Thr455 460 465AAG GTG TTA ATG GCA AGC GTG CAA GGT TCA AAG AGA AGG AAG CTT 1533Lys Val Leu Met Ala Ser Val Gln Gly Ser Lys Arg Arg Lys Leu470 475 480CGA GTA TAC CTT CAT TGC ACA AAC ACT GAC AAT CCA AGG TAT AAA 1578Arg Val Tyr Leu His Cys Thr Asn Thr Asp Asn Pro Arg Tyr Lys485 490 495GAA GGA GAT TTA ACT CTG TAT GCC ATA AAC CTC CAT CAC GTC ACC 1623Glu Gly Asp Leu Thr Leu Tyr Ala Ile Asn Leu His Asn Val Thr500 505 510AAG TAC TTG CGG TTA CCC TAT CCT TTT TCT AAC AAG CAA GTG GAT 1668Lys Tyr Leu Arg Leu Pro Tyr Pro Phe Ser Asn Lys Gln Val Asp515 520 525AAA TAC CTT CTA AGA CCT TTG GGA CCT CAT GGA TTA CTT TCC AAA 1713Lys Tyr Leu Leu Arg Pro Leu Gly Pro His Gly Leu Leu Ser Lys530 535 540TCT GTC CAA CTC AAT GGT CTA ACT CTA AAG ATG GTG GAT GAT CAA 1758Ser Val Gln Leu Asn Gly Leu Thr Leu Lys Met Val Asp Asp Gln545 550 555ACC TTG CCA CCT TTA ATG GAA AAA CCT CTC CGG CCA GGA AGT TCA 1803Thr Leu Pro Pro Leu Met Glu Lys Pro Leu Arg Pro Gly ser Ser560 565 570CTG GGC TTG CCA GCT TTC TCA TAT AGT TTT TTT GTG ATA AGA AAT 1848Leu Gly Leu Pro Ala Phe Ser Tyr Ser Phe Phe Val Ile Arg Asn575 580 585GCC AAA GTT GCT GCT TGC ATC TGA AAA TAA AAT ATA CTA GTC CTG 1893Ala Lys Val Ala Ala Cys Ile590 592ACA CTG 1899(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)长度594(B)类型核酸(C)链型双链
(D)拓朴结构 线状(xi)序列描述SEQ ID NO16ATTACTATAG GGCACGCGTG GTCGACGGCC CGGGCTGGTA TTGTCTTAAT GAGAAGTTGA 60TAAAGAATTT TGGGTGGTTG ATCTCTTTCC AGCTGCAGTT TAGCGTATGC TGAGGCCAGA 120TTTTTTCAGG CAAAAGTAAA ATACCTGAGA AACTGCCTGG CCAGAGGACA ATCAGATTTT 180GGCTGGCTCA AGTGACAAGC AAGTGTTTAT AAGCTAGATG GGAGAGGAAG GGATGAATAC 240TCCATTGGAG GCTTTACTCG AGGGTCAGAG GGATACCCGG CGCCATCAGA ATGGGATCTG 300GGAGTCGGAA ACGCTGGGTT CCCACGAGAG CGCGCAGAAC ACGTGCGTCA GGAAGCCTGG 360TCCGGGATGC CCAGCGCTGC TCCCCGGGCG CTCCTCCCCG GGCGCTCCTC CCCAGGCCTC 420CCGGGCGCTT GGATCCCGGC CATCTCCGCA CCCTTCAAGT GGGTGTGGGT GATTTCGTAA 480GTGAACGTGA CCGCCACCGG GGGGAAAGCG AGCAAGGAAG TAGGAGAGAG CCGGGCAGGC 540GGGGCGGGGT TGGATTGGGA GCAGTGGGAG GGATGCAGAA GAGGAGTGGG AGGG 594(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)长度21(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构 线状(xi)序列描述SEQ ID NO17CCCCAGGAGC AGCAGCATCA G 21(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)长度21(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构 线状(xi)序列描述SEQ ID NO18AGGCTTCGAG CGCAGCAGCA T 21(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)长度22(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构 线状(xi)序列描述SEQ ID NO19GTAATACGAC TCACTATAGG GC 22(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)长度19(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构 线状(xi)序列描述SEQ ID NO20ACTATAGGGC ACGCGTGGT 19(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)长度21(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构 线状(xi)序列描述SEQ ID NO21CTTGGGCTCA CCTGGCTGCT C 21(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)长度23(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构 线状(xi)序列描述SEQ ID NO22AGCTCTGTAG ATGTGCTATA CAC 23(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)长度22
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构 线状(xi)序列描述SEQ ID NO23GCATCTTAGC CGTCTTTCTT CG 2权利要求
1.包含编码具类肝素酶催化活性之多肽的多核苷酸序列的多核苷酸片段。
2.权利要求1的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO9的核苷酸63-1691，或SEQ ID NO13的核苷酸139-1869。
3.权利要求1的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO9的核苷酸63-721。
4.权利要求1的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸如SEQ IDNO9或13中所示。
5.权利要求1的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO9或13的区段，该区段编码具所述类肝素酶催化活性的所述多肽。
6.权利要求1的多核苷酸片段，其中所述多肽包含如SEQ IDNO10或14中所示的氨基酸序列。
7.权利要求1的多核苷酸片段，其中所述多肽包含SEQ ID NO10或14的区段，该区段具有所述类肝素酶催化活性。
8.权利要求1的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸序列选自双链DNA、单链DNA或者RNA。
9.包含与编码具类肝素酶催化活性之多肽的多核苷酸链至少一部分互补的多核苷酸序列的单链多核苷酸片段。
10.权利要求9的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO9或13的至少一部分。
11.包含编码具类肝素酶催化活性之多肽的多核苷酸序列的载体。
12.权利要求11的载体，其中所述多核苷酸序列包含SEQ IDNO9的核苷酸63-1691，或SEQ ID NO13的核苷酸139-1869。
13.权利要求11的载体，其中所述多核苷酸序列包含SEQ IDNO9的核苷酸63-721。
14.权利要求11的载体，其中所述多核苷酸序列是SEQ ID NO9或13中所示序列。
15.权利要求11的载体，其中所述多核苷酸序列包含SEQ IDNO9或13的区段，该区段编码具所述类肝素酶催化活性的所述多肽。
16.权利要求11的载体，其中所述多肽包含如SEQ ID NO10或14中所示的氨基酸序列。
17.权利要求11的载体，其中所述多肽包含SEQ ID NO10或14的区段，该区段具有所述类肝素酶催化活性。
18.权利要求11的载体，其中所述多核苷酸序列选自双链DNA、单链DNA或者RNA。
19.一种包含外源多核苷酸片段的宿主细胞，其中所述外源多核苷酸片段包含编码具类肝素酶催化活性的多肽的多核苷酸序列。
20.权利要求19的宿主细胞，其中所述多核苷酸序列包含SEQID NO9的核苷酸63-1691，或SEQ ID NO13的核苷酸139-1869。
21.权利要求19的宿主细胞，其中所述多核苷酸序列包含SEQID NO9的核苷酸63-721。
22.权利要求19的宿主细胞，其中所述多核苷酸序列是SEQ IDNO9或13中所示序列。
23.权利要求19的宿主细胞，其中所述多核苷酸序列包含SEQID NO9或13的区段，该区段编码具所述类肝素酶催化活性的所述多肽。
24.权利要求19的宿主细胞，其中所述多肽包含如SEQ ID NO10或14中所示的氨基酸序列。
25.权利要求19的宿主细胞，其中所述多肽包含SEQ ID NO10或14的区段，该区段具有所述类肝素酶催化活性。
26.权利要求19的宿主细胞，其中所述多核苷酸序列选自双链DNA、单链DNA或者RNA。
27.一种表达重组类肝素酶的宿主细胞。
28.包含具类肝素酶催化活性的多肽的重组蛋白。
29.权利要求28的重组蛋白，其中所述多肽包含SEQ ID NO10或14的区段。
30.包含能与SEQ ID NO9的核苷酸1-721杂交的多核苷酸序列的多核苷酸片段。
31.如SEQ ID NO9或13中所示的多核苷酸序列。
32.与SEQ ID NO10或13同源的多核苷酸序列。
33.如SEQ ID NO10或14中所示的氨基酸序列。
34.与SEQ ID NO10或14同源的氨基酸序列。
35.一种包含具类肝素酶催化活性的重组蛋白作为活性组分的药物组合物。
36.一种包含过量表达类肝素酶催化活性的细胞的类肝素酶过量表达系统。
37.调节肝素结合性生长因子、对肝素结合性生长因子和细胞因子的细胞应答、与血浆脂蛋白的细胞相互作用、对病毒、原生动物和细菌感染的细胞易感性或者神经变性斑分解的调节子，其中包含具类肝素酶催化活性的重组蛋白作为活性组分。
38.包括含有具类肝素酶催化活性的重组蛋白作为活性组分的医疗装置的医疗设备。
39.权利要求11的载体，其中所述载体是杆状病毒载体。
40.权利要求19的宿主细胞，其中所述细胞是昆虫细胞。
41.权利要求27的宿主细胞，其中所述细胞是昆虫细胞。
42.鉴定铺展的染色体中含人类肝素酶基因的染色体区的方法，包括以下步骤(a)将铺展的染色体与编码类肝素酶的标记多核苷酸探针杂交；(b)洗涤铺展的染色体，从而除去过剩的未杂交探针；(c)搜寻与所述杂交的标记多核苷酸探针相关的信号，其中探测到的信号指示含人类肝素酶基因的染色体区。
全文摘要
编码具类肝素酶活性的多肽的多核苷酸,包括该多核苷酸的载体,表达类肝素酶的转导细胞和具类肝素酶活性的重组蛋白。
文档编号A61M15/00GK1272886SQ98809759
公开日2000年11月8日 申请日期1998年8月31日 优先权日1997年9月2日
发明者I·佩克, I·弗罗达夫斯基, E·菲斯坦因 申请人:洞察策略与营销有限公司, 哈达斯特医疗研究服务和开发有限公司