具有木聚糖酶活性的多肽的制作方法
【专利摘要】本发明涉及对具有木聚糖酶活性的多肽进行修饰以提高麸皮溶解性和/或木聚糖酶活性。所述修饰包括在第10位的至少一个氨基酸修饰，并且可能还包含在第11、12、13、34、54、77、81、99、104、113、114、118、122、141、154、159、162、164、166或175位的至少一个或多个氨基酸的修饰，其中所述位置是根据枯草芽孢杆菌木聚糖酶(SEQ ID NO：1)的位置而确定的。所述多肽与SEQ ID NO：1具有至少88％的同一性或者与选自SEQ ID NO：2-22的序列有至少75％的同一性。
【专利说明】具有木聚糖酶活性的多肽
[0001] 本申请是申请日为2009年12月23日、发明名称为"具有木聚糖酶活性的多肽"的 中国发明专利申请No. 200980155229. X的分案申请。 发明领域
[0002] 本发明涉及具木聚糖酶活性的多肽及其使用。本发明还涉及修饰具木聚糖酶活性 的多肽以影响（优选提高）木聚糖酶活性和/或麸皮溶解性的方法。
[0003] 发明背景
[0004] 多年来，内切-￠-1, 4-木聚糖酶（EC 3. 2. 1.8)(在此称为木聚糖酶）已被用于来 自植物细胞壁物质的复合碳水化合物的修饰。在本领域内众所周知不同木聚糖酶（来源于 不同微生物或植物）的功能性有巨大差异。基于结构和遗传信息，木聚糖酶已被划归不同 的糖苷水解酶家族（GH) (Henrissat, 1991 ;Coutinho and Henrissat, 1999)。直至最近，所 有已知并定性的木聚糖酶均属于家族GHlO或GH11。最近的工作已鉴定了许多其它类型的 属于家族 GH5，GH7，GH8 和 GH43 的木聚糖酶（Coutinho and Henrissat，1999;Collins et al.，2005)。至今GHll家族仍不同于所有其它的GH，它是唯一的只由木聚糖特异性木聚糖 酶组成的家族。GHll木聚糖酶的结构可描述为果冻卷（P-Jelly roll)结构（见本文 所述图1)。
[0005] US 6, 682, 923涉及木聚糖酶活性蛋白及核酸。
[0006] 已用定性清楚的纯底物进行了表征木聚糖酶功能性的全面研究（Kormelink et al.，1992)。这些研究显示不同的木聚糖酶对于阿拉伯糖基木聚糖（AX)之木糖主干的取代 具有不同的特殊要求。某些木聚糖酶需要三个非取代的木糖残基以水解木糖主干；其它的 仅需要一个或两个。据认为造成特异性方面的这些差异的原因是由于催化结构域内的三维 结构，其继而又取决于木聚糖酶的一级结构，即氨基酸序列。不过，这些氨基酸序列上的差 异向木聚糖酶功能性上差异的转化至今尚未在木聚糖酶作用于复杂环境诸如植物材料中 的情况下得到证明。
[0007] 在小麦（小麦面粉）中发现的木聚糖酶底物传统上被分成两部分：水不可提 取的AX (WU-AX)和水可提取的AX (WE-AX)。WU-AX: WE-AX的比例在小麦面粉中是大约 70:30。关于为何有两种不同的AX组分存在众多的解释。较早的文献（D'Appolonia and MacArthur (1976)以及 Montgomery and Smith (1955))描述了 WE-AX 和 WU-AX 之间在取代 程度上相当大的差异。在WE-AX中发现最高程度的取代。这被用于解释为何某些AX是可提 取的。相较于较低取代程度（它会引起聚合物之间的氢键形成及随之而来的沉淀）而言， 高度取代使得聚合物可溶。
[0008] 不同木聚糖酶功能性之间的差异被认为归因于木聚糖酶特异性上的差异以及它 们由此对WU-AX或WE-AX底物的偏爱。
[0009] 不过，更新近的文献未发现在WE-AX和WU-AX之间取代程度有同样巨大的差异。因 此，除了木聚糖酶底物特异性之外的其它参数可能是具有重要意义的。这些参数可能是相 对于WU-AX而言木聚糖酶更偏爱WE-AX，这是由经典的底物特异性之外的其它方式确定的。 此参数在文献中被描述为底物选择性。
[0010] 在某些应用中（例如面包房）希望从WU-AX组分产生高分子量（HMW)可溶性聚 合物。这样的聚合物与面包制备中的体积增大相关（Rouau, 1993 ;Rouau et al.，1994and Courtin et al. , 1999).
[0011] 在其它应用中期望修饰WU-AX和WE-AX二者，使WU-AX溶解，降低分子量，减少 它们的水状胶质效果，产生阿拉伯糖基木聚糖寡糖，从而可以进一步降解其它细胞壁组分 (诸如在饼干生产、面粉分离、饲料施用、生物乙醇产生、益生元等等方面）。
[0012] 各种应用中所用木聚糖酶的所有上述特性针对的是木聚糖酶的性能并且对于获 得所需的功能性而言是非常重要的。不过，选择具有正确特性的木聚糖酶用于某些应用中 或改造已知的木聚糖酶以达到此目的，经常导致了较低效率的木聚糖酶分子，例如具有低 催化活性的分子（即由分子单位/mg木聚糖酶蛋白表征的比活性）。由于这些分子是待用 于商业用途的，因此具有尽可能高的催化活性是非常重要的。由于农业副产物诸如谷类麸 皮使用的增加或者在纤维素生物乙醇生产中的使用，此特性的改善对于未来实现这些酶的 商业应用而言将是越来越重要的。
[0013] 发明简述
[0014] 本发明基于以下令人惊讶的发现，即通过相较于SEQ ID No. 1中所示之枯草芽孢 杆菌木聚糖酶多肽序列而言在第110位修饰具木聚糖酶活性的多肽有可能增加该酶的麸 皮溶解性和/或木聚糖酶活性。
[0015] 由此，本发明的
【发明者】已证明可能产生具有增加的木聚糖酶活性和/或麸皮溶解 性的木聚糖酶多肽。这将例如使得涉及纤维素生物乙醇生产的谷类加工过程中半纤维素组 分的水解成为可能，或者使得诸如动物饲料、淀粉液化，食物烘焙、面粉分离（湿磨法）、益 生元产生以及纸和纸浆生产等许多应用中所需要的木聚糖酶的量减少。
[0016] 第一方面，本发明涉及具有木聚糖酶活性并且包含与SEQ ID No. 1具至少88%同 一性或与选自SEQ ID No. 2-22之氨基酸序列具至少75 %同一性的氨基酸序列的多肽，并且 该多肽在第110位具有氨基酸修饰，其中所说的第110位通过序列比对确定为相应于SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌木聚糖酶序列第110位的位置。
[0017] 第二方面，本发明涉及具有木聚糖酶活性并且包含与SEQ ID No. 1具至少88%同 一性之氨基酸序列的多肽，并且该多肽在第110位具有氨基酸修饰，其中所说的第110位通 过序列比对确定为相应于SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌木聚糖酶序列第110位的位 置。
[0018] 第三方面，本发明涉及具有木聚糖酶活性并且包含与SEQ ID No. 2具至少75%同 一性之氨基酸序列的多肽，并且该多肽在第110位具有氨基酸修饰，其中所说的第110位通 过序列比对确定为相应于SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌木聚糖酶序列第110位的位 置。
[0019] 在进一步的方面，本发明涉及具有木聚糖酶活性并且包含与SEQ ID No. 3具至少 75%同一性之氨基酸序列的多肽，并且该多肽在第110位具有氨基酸修饰，其中所说的第 110位通过序列比对确定为相应于SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌木聚糖酶序列第110 位的位置。
[0020] 在进一步的方面，本发明涉及鉴定本发明多肽的方法，所说方法包括：
[0021] (i)制备与SEQ ID No. 1具至少88%同一性或与选自SEQ ID No. 2-22之氨基酸 序列具至少75%同一性的多肽，并且该多肽在第110位具有氨基酸修饰，其中所说的第110 位通过序列比对确定为相应于SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌木聚糖酶序列第110位的 位置；
[0022] (ii)将所说多肽的麸皮溶解和/或木聚糖酶活性与选自SEQ ID NOs: 1-22之中的 与其具有最高同一性百分比的氨基酸序列的麸皮溶解和/或木聚糖酶活性进行比较；然后
[0023] (iii)如果相较于SEQ ID NOs: 1-22之中的、与其具有最高同一性百分比的氨基酸 序列而言具有改善的麸皮溶解和/或改善的木聚糖酶活性则选择该多肽。
[0024] 在进一步的方面，本发明涉及制备本发明多肽的方法，所说方法包括表达编码所 说多肽的核苷酸序列；并在表达后任选地分离和/或纯化该多肽。
[0025] 在某些实施方案中，通过修饰多肽氨基酸序列第110位或在编码多肽氨基酸序列 之核苷酸序列中编码第110位氨基酸残基之密码子来制备所述多肽，其中第110位参照SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌木聚糖酶序列确定。
[0026] 在进一步的方面，本发明涉及编码本发明多肽之核苷酸序列。
[0027] 在进一步的方面，本发明涉及包含编码本发明多肽之核苷酸序列的载体。
[0028] 在进一步的方面，本发明涉及已被编码本发明多肽之核苷酸序列转化或已被包含 编码本发明多肽之核苷酸序列的载体转化的细胞。
[0029] 在进一步的方面，本发明涉及已被编码本发明多肽之核苷酸序列转化或已被包含 编码本发明多肽之核苷酸序列的载体转化的宿主生物体。
[0030] 在进一步的方面，本发明涉及包含本发明多肽的组合物。
[0031] 在进一步的方面，本发明涉及包含依照本发明方法鉴定之多肽的组合物。
[0032] 在进一步的方面，本发明涉及包含依照本发明制备之多肽的组合物。
[0033] 在进一步的方面，本发明涉及包含编码本发明多肽之核苷酸序列的组合物。
[0034] 在进一步的方面，本发明涉及包含含有编码本发明多肽之核苷酸序列的载体的组 合物。
[0035] 在进一步的方面，本发明涉及包含已被编码本发明多肽之核苷酸序列转化之细胞 的组合物。
[0036] 在进一步的方面，本发明涉及包含含有编码本发明多肽之核苷酸序列的载体的组 合物。
[0037] 在进一步的方面，本发明涉及包含已被编码本发明多肽之核苷酸序列转化或已被 含有编码本发明多肽之核苷酸序列的载体转化之生物体并混合非毒性组分的组合物。
[0038] 在进一步的方面，本发明涉及包含本发明所述多肽或依照本发明鉴定之多肽或依 照本发明制备之多肽或符合本发明之核苷酸序列或符合本发明之载体或符合本发明之细 胞或符合本发明之生物体混合非毒性组分或符合本发明之组合物的面团。
[0039] 在进一步的方面，本发明涉及包含本发明所述多肽或依照本发明鉴定之多肽或依 照本发明制备之多肽或符合本发明之核苷酸序列或符合本发明之载体或符合本发明之细 胞或符合本发明之生物体混合非毒性组分或符合本发明之组合物或符合本发明之混合物 的食物烘焙产品。
[0040] 在进一步的方面，本发明涉及包含本发明所述多肽或依照本发明鉴定之多肽或依 照本发明制备之多肽或符合本发明之核苷酸序列或符合本发明之载体或符合本发明之细 胞或符合本发明之生物体混合非毒性组分或符合本发明之组合物的动物饲料。
[0041] 在进一步的方面，本发明涉及包含木聚糖酶的洗涤组合物。在某些实施方案中， 所述的洗涤组合物是衣物洗涤组合物，而在其它的实施方案中所述洗涤组合物是盘碟洗涤 齐U。在某些进一步的实施方案中，所述的盘碟洗涤剂是自动盘碟洗涤剂。在某些另外的实 施方案中，含木聚糖酶的洗涤组合物进一步包含一种或更多种另外的酶。在某些实施方案 中，所述的另外的酶选自半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷 脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化 酶、脂氧合酶、木质酶、支链淀粉酶、縣酸酶、戊聚糖酶、malanases、0 -葡聚糖酶、阿拉伯糖 苷酶、透明质酸酶、硫酸软骨素酶、漆酶和淀粉酶或它们的混合物。在某些实施方案中，使用 酶的组合（即"鸡尾酒"）。
[0042] 在进一步的方面，本发明涉及降解或修饰植物细胞壁的方法，该方法包括令所说 的植物细胞壁接触本发明所述多肽或依照本发明鉴定的多肽或依照本发明制备的多肽或 本发明所述核苷酸序列或本发明所述载体或本发明所述细胞或本发明所述生物体混合非 毒性组分或本发明所述组合物。
[0043] 在进一步的方面，本发明涉及加工植物材料的方法，该方法包括使所述的植物材 料接触本发明之任一项所述多肽或依照本发明鉴定的多肽或依照本发明制备的多肽或本 发明所述核苷酸序列或本发明所述载体或本发明所述细胞或本发明所述生物体混合非毒 性组分或本发明所述组合物。
[0044] 在进一步的方面，本发明涉及在修饰植物材料的方法中使用本发明所述多肽或依 照本发明鉴定的多肽或依照本发明制备的多肽或本发明所述核苷酸序列或本发明所述载 体或本发明所述细胞或本发明所述生物体混合非毒性组分或本发明所述组合物。
[0045] 在进一步的方面，本发明涉及本发明所述多肽或依照本发明鉴定的多肽或依照本 发明制备的多肽或本发明所述核苷酸序列或本发明所述载体或本发明所述细胞或本发明 所述生物体混合非毒性组分或本发明所述组合物在以下任一方面或多方面的用途：食物烘 焙、谷类加工、淀粉液化、从纤维素材料生产生物乙醇、动物饲料、木材加工、提高木浆漂白。
[0046] 在进一步的方面，本发明涉及实质上如上文所述与实施例和附图有关的多肽或其 片段。
[0047] 在进一步的方面，本发明涉及实质上如上文所述与实施例和附图有关的方法。 [0048] 在进一步的方面，本发明涉及实质上如上文所述与实施例和附图有关的组合物。 [0049] 在进一步的方面，本发明涉及实质上如上文所述与实施例和附图有关的用途。
[0050] 图例说明
[0051] 在此参看以下附图。
[0052] 图1显示了叠加的枯草芽孢杆菌XynA变体木聚糖酶（TllOA)(黑色）、里氏木霉 (Trichoderma reesei)Xyn2 变体木聚糖酶（T120A)(深灰）和嗜热丝抱菌（Thermomyces lanugin〇Sus)XynA变体木聚糖酶（T120A)(浅灰）。突变的残基TllO和T120分别被突出 显不。
[0053] 图2显示了利用AlignX程序（vectorNTI组的一部分）以适合多重比对的默认值 (缺口开放罚分：IOog缺口延伸罚分0.05)进行的SEQID NO: 1-22的多重序列比对。序列 左边的数字代表SEQ ID NOs。
[0054] 发明详述
[0055] 已报道木聚糖酶来自近100种不同的生物体，包括植物、真菌和细菌。这些木聚糖 酶被划归到超过40个糖基水解酶家族中的数个内。糖基水解酶包括木聚糖酶，甘露聚糖 酶，淀粉酶，￠-葡聚糖酶，纤维素酶及其它糖酶，基于诸如氨基酸序列、三维结构和催化 位点的几何学等特性进行分类（Gilkes，et al.，1991，Microbiol. Reviews 55:303-315)。
[0056] -方面，本发明涉及具木聚糖酶活性并且相对于SEQ ID N0:l_22的任一氨基酸序 列而言包含至少三个（诸如5、6、7、8、9或10个）氨基酸取代的多肽，该多肽在第110位具 有氨基酸修饰，其中所说的第110位通过序列比对确定为相应于SEQ ID No. 1所示之枯草 芽孢杆菌木聚糖酶序列第110位的位置。
[0057] -方面，本发明涉及具有木聚糖酶活性并且包含氨基酸序列的多肽，所说氨基酸 序列与SEQ ID No. 1具至少88%同一性或与选自SEQ ID No. 2-22之氨基酸序列具至少 75%同一性，并且该多肽在第110位具有氨基酸修饰，其中所说的第110位通过序列比对确 定为相应于SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌木聚糖酶序列第110位的位置。
[0058] 本发明所述多肽内的特定氨基酸位置是利用标准序列比对工具通过将所说多肽 的氨基酸序列与SEQ ID No. 1进行比对而确定的，譬如用Smith-Waterman运算法则或用 CLUSTALW2运算法则比对两个序列，其中当比对得分最高时认为所述序列是对准的。比对得 分可依照 Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. (1983) Rapid similarity searches of nucleic acid and protein data banks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:726-730 中所述的方法进行 计算。在ClustalW2(l. 82)运算法则中优选使用默认参数：蛋白质缺口开放罚分=10. 0 ; 蛋白质缺口延伸罚分=〇. 2 ;蛋白质矩阵=Gonnet ;蛋白质/DNA端隙=-1 ;蛋白质/DNA GAPDIST = 4.
[0059] 优选用AlignX程序（vectorNTI组中的一部分）以适于多重比对的默认参数（缺 口开放罚分：IOog缺口延伸罚分0.05)通过将多肽的氨基酸序列与SEQ ID No. 1进行比对 来确定本发明所述多肽内特定氨基酸的位置。对于本发明所述的某些实施方案而言，可如 本文图2所述进行序列比对。
[0060] 在进一步的方面，本发明涉及具有木聚糖酶活性并且包含与SEQ ID No. 1具至少 88%同一性之氨基酸序列的多肽，并且该多肽在第110位具有氨基酸修饰，其中所说的第 110位通过序列比对确定为相应于SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌木聚糖酶序列第110 位的位置。
[0061] 在进一步的方面，本发明涉及具有木聚糖酶活性并且与SEQ ID No. 2具至少75% 同一性的多肽，并且该多肽在第110位具有氨基酸修饰，其中所说的第110位通过序列比对 确定为相应于SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌木聚糖酶序列第110位的位置。
[0062] 在进一步的方面，本发明涉及具有木聚糖酶活性并且与SEQ ID No. 3具至少75% 同一性的多肽，并且该多肽在第110位具有氨基酸修饰，其中所说的第110位通过序列比对 确定为相应于SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌木聚糖酶序列第110位的位置。
[0063] 在进一步的方面，本发明涉及具有木聚糖酶活性并且与SEQ ID No. 4具至少75% 同一性的多肽，并且该多肽在第110位具有氨基酸修饰，其中所说的第110位通过序列比对 确定为相应于SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌木聚糖酶序列第110位的位置。
[0064] 在进一步的方面，本发明涉及具有木聚糖酶活性并且包含与SEQ ID No. 1具至少 75%同一性之氨基酸序列的多肽，并且该多肽在第110位具有替换为选自下述的任一种不 同氨基酸残基的氨基酸取代：谷氨酸、色氨酸、丙氨酸和半胱氨酸，其中所说的第110位通 过序列比对确定为相应于SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌木聚糖酶序列第110位的位 置。
[0065] 除非另外声明，否则术语关于氨基酸的"序列同一性"用于此处时指按照 (nMf-ndif) ? IOOAw计算的序列同一性，其中ndif是比对时两个序列中不相同的残基总 数目，而其中的nMf是其中一个序列的残基数目。因此，氨基酸序列ASTDYWQNWT与序列 八5丁6￥^^_!'具有80%的序列同一性（11 (1" = 2和1^=10)。
[0066] 在某些实施方案中用常规方法确定序列同一性，例如Smith and Waterman, 1981，Adv. Appl. Math. 2:482,通过 Pearson&Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 的搜索相似性方法，用 Thompson et al.，1994, Nucleic Acids Res 22:467380的CLUSTAL W运算法则，通过计算机化运行这些运算法则（Wisconsin Genetics 软件包中的 GAP, BESTFIT, FASTA,和 TFASTA，Genetics Computer Group)。此外还可 使用其软件可获自美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information www. ncbi. nlm. nih. gov/)的 BLAST 运算法则（Altschul et al.，1990, Mol. Biol. 215:403-10)。在利用任何上述运算法则时，对于"窗口"长度、缺口罚分等使用默认 参数。
[0067] 术语"修饰"用于此处意指对选自SEQ ID NO: 1-22的多肽之任一氨基酸或氨基酸 序列的任何化学修饰，以及编码所述多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是一个或多个 氨基酸的取代、删除和/或插入以及一个或多个氨基酸侧链的置换。在某些实施方案中，具 木聚糖酶活性的所述多肽相对于SEQ ID No. 1-22只具有氨基酸取代。
[0068] 应当理解，在给定多肽中的"修饰"是相对于选自SEQ ID NO: 1-22之中的、与此给 定多肽具最高百分比序列同一性的多肽而言的。
[0069] 此说明书中所用有关氨基酸取代的术语如下。第一个字母代表特定序列某一位置 上天然存在的氨基酸。后面的数字代表相对于SEQ ID No. 1的位置。第二个字母代表取代 该天然氨基酸的不同氨基酸。譬如D11F/R122D/T110A，其中SEQ ID N0:1的第11位天冬氨 酸被苯丙氨酸取代，SEQ ID NO: 1的第122位精氨酸被天冬氨酸取代，第110位苏氨酸被丙 氨酸取代，全部三个突变均在具木聚糖酶活性的同一多肽内。
[0070] 除了本发明所述具木聚糖酶活性之多肽内的氨基酸修饰之外，所述多肽可能还进 一步具有性质轻微的氨基酸取代，即不显著影响蛋白质折叠和/或活性的保守氨基酸取代 或插入；小的删除，通常1至约30个氨基酸；小的氨基-或羧基-末端延伸，诸如氨基末端 甲硫氨酸残基；长达约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能而方便纯 化的小的延伸，诸如多聚组氨酸束、抗原性表位或结合结构域。
[0071] 保守取代的例子是碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸和组氨酸）、酸性氨基酸（谷氨酸 和天冬氨酸）、极性氨基酸（谷氨酰胺和天冬酰胺）、疏水氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸和缬氨 酸）、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）以及小氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、 苏氨酸和甲硫氨酸）组内的取代。通常不改变比活性的氨基酸取代是本领域所已知的并可 参阅例如 H. Neurath and R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York。 最普遍发生的交换是丙氨酸对丝氨酸、缬氨酸对异亮氨酸、天冬氨酸对谷氨酸、苏氨酸对丝 氨酸、丙氨酸对甘氨酸、丙氨酸对苏氨酸、丝氨酸对天冬酰胺、丙氨酸对缬氨酸、丝氨酸对甘 氨酸、酪氨酸对苯丙氨酸、丙氨酸对脯氨酸、赖氨酸对精氨酸、天冬氨酸对天冬酰胺、亮氨酸 对异亮氨酸、亮氨酸对缬氨酸、丙氨酸对谷氨酸以及天冬氨酸对甘氨酸。
[0072] 除了 20种标准氨基酸之外，非标准氨基酸（诸如4-羟脯氨酸、6-/V-甲基赖氨酸、 2_氨基异丁酸、异缬氨酸和a _甲基丝氨酸）可能取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数目 的非保守氨基酸、不是由遗传密码编码的氨基酸以及非天然氨基酸可能取代氨基酸残基。" 非天然氨基酸"在蛋白质合成后被修饰以及/或者在它们的侧链具有不同于标准氨基酸侧 链的化学结构。非天然氨基酸可化学合成，并优选的可商品化获得，且包括哌啶酸、噻唑烷 羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸和3, 3-二甲基脯氨酸。
[0073] 术语"宿主生物体"用于此处时包括可以接受包含编码本发明所述多肽之多核苷 酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。
[0074] 就本发明目的而言，木聚糖酶意指具木聚糖酶活性的蛋白质或多肽。
[0075] 短语"具木聚糖酶活性的多肽"用于此处指在诸如本文所述之木聚糖酶测定中具 活性的任何蛋白质或多肽。
[0076] 木聚糖酶活性可以任何测定法来检测，其中使用的底物包括木聚糖内的 1，4-P-D-木糖苷内键。测定中所用的pH和温度是适合所述木聚糖酶的。譬如合适的pH 值是 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 或 11。譬如合适的温度是 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 或 80°C。 有不同类型的底物可用于测定木聚糖酶活性，例如Xylazyme片剂（交联的染色木聚糖底 物，Megazyme, Bray, Ireland) 〇 [0077] 优选的，用以下测定法检测木聚糖酶活性。
[0078] 木聚糖酶测定法（内-3 -1, 4-木聚糖酶活件）
[0079] 在此测定法中将样品稀释于柠檬酸（0. 1M)-磷酸氢二钠（0. 2M)缓冲液pH 5. 0中 以达到大约OD59tl = 0. 7。将三个不同稀释度的样品在40°C预保温5分钟。在时间达到5分 钟时，将1片Xylazyme片剂（交联的染色的木聚糖底物，Megazyme, Bray, Ireland)加入反 应体积为Iml的酶溶液中。在时间达到15分钟时通过加入IOml的2% TRIS/NaOH, pH 12 终止反应。用1000 缓冲液替代酶溶液制备空白。将反应混合物离心（150〇 X g，10分 钟，20°C )并在590nm检测上清液的0D。一个木聚糖酶单位（XU)定义为将OD59tl每分钟升 高0.025的木聚糖酶活性。
[0080] 以上测定法中所用的底物（提取自小麦的交联并染色的阿拉伯糖基木聚糖）非常 近似商业应用中的相应底物。
[0081] 可基于来自NC-IUBMB的酶命名法手册（1992)将酶进一步的分类，也可参阅 ENZYME的互联网网址：http://www. expasy. ch/enzyme/。ENZYME是与酶命名法有关的信息 库。它主要基于国际生物化学和分子生物学协会（IUB-MB)命名委员会的推荐，并且描述了 对其已提供EC(Enzyme Commission)编号的每一类型的已定性酶（Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res 28:304-305)。此 IUB-MB 酶命名法是是以它们的底物 特异性为基础的，有时候也以它们的分子机制为基础；这样的分类不反应这些酶的结构特 性。
[0082] 在本发明的一方面，木聚糖酶是归类为EC 3. 2. 1. 8的酶。正式名称是 内-1，4-0-木聚糖酶.系统名称是1，4-0-〇-木聚糖酶（17]^]1171311〇117(11'〇1386)。 可能使用其它的名称，诸如内-(1-4)-0-木聚糖酶；（1-4)-0-木聚糖4-木聚糖水解 酶（xylanohydrolase);内-1，4-木聚糖酶；木聚糖酶；@ -1，4-木聚糖酶；内-1，4-木 聚糖酶；内-3-1，4-木聚糖酶；内_1，4邻-D-木聚糖酶；1，4-3-木聚糖酶（xylan xylanohydrolase) ; 0 -木聚糖酶；0 _1，4-木聚糖酶（xylan xylanohydrolase); 内-1，4-0-木聚糖酶；3-D-木聚糖酶。催化的反应是木聚糖内1，4-P-D-木糖苷键的内 水解。
[0083] 在几年前已提出在基于氨基酸序列相似性的家族内对某些糖苷水解酶进 行另外的分类，诸如内切葡聚糖酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶 和a-半乳糖苷酶。它们目前属于90个不同的家族：参阅CAZy(ModO)互联网址 (Coutinho，P.M. SHenrissat, B. (1999)碳水化合物活性酶服务器（Carbohydrate-Active Enzymes server)在:http://afmb. cnrs-mrs. fr/-cazy/CAZY/index, html(相应文 献:Coutinho, P. M. &Henrissat, B. (1999)Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach。 在 ''Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering"，HJ. Gilbert,G.Davies, B. Henrissat and B.Svensson 编辑,The Royal Society of Chemistry, Cambridge,pp.3-12 ；Coutinho, P. M.&Henrissat,B. (1999)The modular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach 中。 在 ''Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation^. , K. Ohmiya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita and T. Kimura eds. , Uni Publishers Co. , Tokyo, pp. 15-23 中）。
[0084] 本发明的一方面，本发明的木聚糖酶是糖苷水解酶（GH)家族11的木聚糖酶。术 语"糖苷水解酶（GH)家族11的"意指所述木聚糖酶是或者可归类于GH家族11。
[0085] 应当理解蛋白质相似性搜索（类似例如http: //toolkit, tuebingen. mpg.de/ prot_blast上的ProteinBlast)可能不必确定未知序列实际上是否落在GHll木聚糖酶家 族成员的范畴内。用blast搜索找到的蛋白质序列可能具有相对高的同一性/同源性但仍 然不是真实的木聚糖酶，而且更进一步的，不是属于GHll的木聚糖酶。或者，蛋白质序列可 能具有相对低的一级氨基酸序列同一性但仍是GHll木聚糖酶家族的成员。为了确定未知 蛋白质序列实际上是否是GHll家族内的木聚糖酶蛋白质，要进行评估，不只对序列的相似 性，而且还对3D-结构的相似性评估，因为GH-家族内的分类取决于3D折叠。可预测未知 蛋白质序列之 3D 折叠的软件是 HHpred(http: //toolkit, tuebingen. mpg. de/hhpred)。此 软件用于蛋白质结构预测的能力依赖于用已知结构作为模板鉴定同源序列。此软件运行良 好，因为结构趋异比一级序列要慢得多。同一家族的蛋白质可能具有非常相似的结构，即便 是当它们的序列趋异到无法认出的时候。
[0086] 在实践中，可将未知序列以FASTA格式粘贴到软件(http://toolkit, tuebingen. mpg.de/hhpred)中。做完此步后，提交搜索。搜索输出信息将显示具有已知3D结构的序列 清单。为了证实未知序列真的是GHll木聚糖酶，应在具有大于90的可能性的同源物清单 内找到GHll木聚糖酶。并非所有被鉴定为同源物的蛋白质都会被定性为GHll木聚糖酶， 而是某些会。后者的蛋白质是具有已知结构以及鉴定其为木聚糖酶之生化特性的蛋白质。 前者则没有在生化上被定性为GHii木聚糖酶。有多篇文献描述了此流程，诸如Sdding J. (2005)Protein homology detection by HMM-HMM comparison. Bioinformatics 21，951-960(doi:10. 1093/bioinformatics/btil25)和S6dillg J，Biegert A，and Lupas AN. (2005)The HHpred interactive server for protein homology detection and structure prediction. Nucleic Acids Research 33, W244-W248(Web Server issue) (doi:10. 1093/nar/gki40) 〇
[0087] 依照Cazy(ModO)位点，家族11糖苷水解酶可定性如下：
[0088] 已知活性：木聚糖酶（EC 3. 2. 1. 8)
[0089] 机制：保留
[0090] 催化亲核物质/碱基：谷氨酸（实验性的）
[0091] 催化质子供体：谷氨酸（实验性的）
[0092] 3D结构状态：折叠：3 -果冻卷（3 - jelly roll)
[0093] 家族：GH-C
[0094] 用于此处时，〃家族C〃指享有共同的三维折叠和相同的催化机制的家族类型（参 阅，例如 Henrissat, B. and Bairoch, A.，（1996) Biochem. J.，316, 695-696)。
[0095] 用于此处时，〃家族 11〃 指 Henrissat and Bairoch(1993)Biochem J.，293, 781-788 所确立的一个酶家族（还可参阅 Henrissat and Davies (1997) Current Opinion in Structural Biol. 1997，&:637_644)。家族11成员的共同特征包括高度遗传同 源性，大约20kDa的大小以及双重取代催化机制（参阅Tenkanen et al.，1992 ;Wakarchuk et al.，1994)。家族11木聚糖酶的结构包括由￠-链组成的两个大的￠-片层和a-螺 旋。
[0096] 家族11木聚糖酶包括但不局限于以下：黑曲霉（Aspergillus niger) XynA> 白曲霉(Aspergillus kawachiir)XynC> Aspergillus tubigensis XynA,环 状芽抱杆菌（Bacillus circulans)XynA、Bacilluspunzilus XynA,枯草芽抱杆菌 XynA, Neocalliniastix patriciarum XynA,变铅青链霉菌（Streptomyces Iividans) XynB,变铅青链霉菌（Streptomyces lividans) XynC, Streptomyces therinovioIaceus XynII,赫色嗜热单抱菌（Thermomonospora fusca)XynA,哈茨木霉（Trichoderma harzianum)Xyn, Tyichoderma reesei XynI,里氏木霉（Trichoderma reesei)XynII,绿色 木霉（Trichodermaviride)Xyn0
[0097] 用于此处时，"野生型"指天然的或自然存在的序列或蛋白质。
[0098] 在另一具体实施方案中，本发明的木聚糖酶来源于细菌木聚糖酶，例如来自 ⑴厚壁菌门；（ii)芽孢杆菌纲；（iii)芽孢杆菌目；（iv)类芽孢杆菌科；或（V)类芽孢 杆菌属的细菌；例如来自（vi)类芽孢杆菌（Paenibacillus pabuli),多粘类芽孢杆菌 (Paenibacillus polymyxa)或类芽抱杆菌种（Paenibacillus sp.)的细菌；例如来自 (vii)类芽孢杆菌或多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa)的菌株。
[0099] 表述〃衍生自细菌木聚糖酶的木聚糖酶〃用于此处时包括分离自所述细菌的任何 野生型木聚糖酶，及其保持木聚糖酶活性的变体或片段。
[0100] 在进一步的具体实施方案中，本发明的木聚糖酶衍生自真菌木聚糖酶。
[0101] 上述〃衍生自〃的定义（在细菌木聚糖酶的上下文中）也可类推适用于真菌木聚 糖酶.
[0102] 举例而言，家族11糖苷水解酶的真菌木聚糖酶是可衍生自以下真菌属的那些类 型：曲霉属（Aspergillus),短梗霉属（Aureobasidium),裸胞壳属（Emericella),镰孢菌 (Fusarium),顶囊壳属（Gaeumannomyces),腐殖霉属（Humicola),香燕属（Lentinula), 稻癌菌属（Magnaporthe) ,Neocallimastix,拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis) ,Orpinomyces, 拟青霉属（Paecilomyces),青霉属（Penicillium),毕赤酵母属（Pichia),裂裙菌属 (Schizophyllum),踩节菌属（Talaromyces),嗜热真菌属（Thermomyces),木霉菌属 (Trichoderma)〇
[0103] 真菌木聚糖酶包括酵母和丝状真菌木聚糖酶。在某些实施方案中，木聚糖酶是衍 生自⑴子囊菌门；（ii)盘菌纲；（iii)散囊菌目；（iv)散囊菌亚目；(V)发菌科的真菌，例 如丝抱发菌（mitosporic Trichocomaceae);或来自（vi)曲霉属（Aspergillus)的真菌； 例如来自（vii)黑曲霉（Aspergillus niger)的菌株。应当理解前述物种的定义包括完美 的和不完美的状态，以及其它的分类学对等物例如变形物，不管它们已知的物种名称为何。 本领域技术人员应容易认知合适的对等物的身份。
[0104] 上述细菌和真菌菌株是公众在许多培养物收藏中心可方便获得的，诸如美国典型 培养物保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC),德国微生物菌种保藏中 心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ),荷兰微 生物菌种保藏中心（Centraalbureau Voor Schi_elcultures，CBS)和农业研究服务专 利培养物保藏中心北方区研究中心（Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, NRRL)〇
[0105] 涉及分类学的问题可查阅分类学数据库诸如可从以下网址获得的NCBI分类学浏 览器：http://www. ncbi. nlm. nih. gov/分类学/分类学home, html/。不过，优选参考以 下手册！Dictionary of the Fungi, 9th edition, edited by Kirk, P. M. , P. F. Cannon, J. C.David&J. A. Stalpers，CAB Publishing, 2001;和 Bergey，s Manual of Systematic Bacteriology, Second edition(2005)〇
[0106] 本发明涉及在某些氨基酸位置的修饰。这些位置是参考SEQ ID No. I所示的枯草 芽孢杆菌氨基酸序列而列出的。在本发明中，具木聚糖酶活性的多肽至少在相较于SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌序列的第110位具有修饰。可能通过将其它家族11木聚糖酶与 SEQ ID No. 1进行比对并确定哪一个氨基酸对准SEQ ID No. 1的特定氨基酸来找到在其它 家族11木聚糖酶中的同等位置（例如，参阅实施例5)。以某一序列作为第一参照的所述比 对和用法对于本领域普通技术人员而言仅仅是例行公事而已。
[0107] 一方面，本发明所述的木聚糖酶变体具有提高的麸皮溶解活性，该活性在"麸皮溶 解测定法"中高于使用相应野生型木聚糖酶或包含选自SEQ ID No. 2-22中之氨基酸序列的 任一木聚糖酶所获得的活性。
[0108] 一方面，本发明所述木聚糖酶具有由于第110位的修饰而造成的提高的麸皮溶解 活性。
[0109] 适当的，可用本文所提供的麸皮溶解测定法检测木聚糖酶麸皮溶解活性。由此，可 提供具增加的木聚糖酶活性和/或增加的麸皮溶解活性的多肽。对WU-AX特异性的需求越 来越重要，因为许多应用是使用浓度提高的谷类麸皮。由于健康和营养的问题，面包制造 业在许多产品中提高了麸皮浓度，由于在例如生物乙醇生产中使用谷类，饲料工业掺入了 数量越来越多的麸皮物质（纤维，具有可溶物的干酒糟（Distilers Dried Grains with Solubles，DDGS))。因此提供特异性增加且由此溶解此麸皮物质的效率增高的新木聚糖酶 是有利的。
[0110] 麸皮溶解测定法
[0111] 优选的，用以下测定法检测麸皮溶解度。
[0112] 在（0. IM)-磷酸氢二钠（0. 2M)缓冲液，pH 5. 0中制备小麦麸皮悬浮液至浓度 1. 33%麸皮（w/w)。从此悬浮液中，边搅拌边将750 ii 1的等分试样转移入Eppendorph管 中。将每个底物管在40°C预热5分钟。至此，加入250 ill酶溶液，使底物终浓度达到1 %。 从每一种木聚糖酶制备三个稀释度的稀释液（一式两份），对于每个测定时间点（〇, 30, 60 和240分钟）具有逐步增加的酶浓度（0. 33、I. 0和3. 0 ii g木聚糖酶/克麸皮）。使用木聚 糖酶热变性溶液作为空白。在给定的时间通过将管子转移至设置为95°C的孵育器上终止反 应。热变性样品保存于4°C直至所有的酶反应终止。当所有的酶反应终止时，将Eppendorph 管离心以获取清澈的上清液。酶溶解麸皮的能力表现为用PAHBAH测定的还原端基的增加 (Lever, 1972)〇
[0113] 由于附带的活性例如淀粉酶活性可能干扰以上测定法，所以麸皮溶解测定法应只 用纯化后的木聚糖酶样品进行（见实施例2)。
[0114] 一方面,本发明所述木聚糖酶与任一野生型木聚糖酶或含有选自SEQ ID No. 2-22 之氨基酸序列的任一木聚糖酶相比对木聚糖酶抑制剂的敏感性降低。
[0115] 在进一步的方面，由于在第110位的修饰联合以下任一个或多个氨基酸位置处的 一个或多个修饰，所述本发明木聚糖酶活性的多肽对木聚糖酶抑制剂的敏感性下降：11，12 ，13, 34, 54, 77, 81，99, 104, 113, 114, 118, 122, 141，154, 159, 162, 164, 166 和 175。
[0116] 所述抑制剂可以是在植物组织中自然发现的抑制剂。
[0117] 用于此处时，术语"木聚糖酶抑制剂"指其作用为控制植物细胞壁中所存在的复杂 碳水化合物例如阿拉伯糖基木聚糖解聚的化合物，通常是蛋白质。这些木聚糖酶抑制剂能 降低自然存在的木聚糖酶以及真菌或细菌来源木聚糖酶的活性。已报道在谷类种子中有木 聚糖酶抑制剂的存在（参阅例如 McLauchlan et al 1999a ;Rouau and Suget 1998)。
[0118] McLauchlan等（1999a)公开了来自小麦且结合并抑制两种家族-11木聚糖酶 的蛋白质的分离和定性。同样地，WO 98/49278证实了小麦面粉提取物对均归类于家族 11木聚糖酶的一组微生物木聚糖酶活性的影响。Debyser等（1999)也公开了来自黑曲 霉（Aspergillus niger)和枯草芽孢杆菌的内木聚糖酶，它们都是被小麦木聚糖酶抑制剂 TAXI所抑制的家族11木聚糖酶成员。McLauchlan等（1999b)讲述了来自商品化面粉诸如 小麦、大麦、黑麦和玉米的提取物能抑制家族10和11木聚糖酶。
[0119] 所述木聚糖酶抑制剂可以是任何合适的木聚糖酶抑制剂。举例而言，所述木 聚糖酶抑制剂可能是W0-A-98/49278中所述的抑制剂和/ *Rouau，X.andSurget，A. (1998)，McLauchlan, R.，et al. (1999)所述的木聚糖酶抑制剂和/或英国专利申请号 9828599. 2(于1998年12月23日递交）、英国专利申请号9907805. 7(于1999年4月6日 递交）和英国专利申请号9908645.6(于1999年4月15日递交）中所述的木聚糖酶抑制 剂。
[0120] 在现有技术中所描述的抑制剂也可用于测定法中以确定本发明变体多肽对木聚 糖酶抑制剂的敏感性。它们也可如下文所述用于调节木聚糖酶的功能性。
[0121] 木聚糖酶抑制剂测定法
[0122] 优选的，用以下测定法检测木聚糖酶抑制活性。
[0123] 将100 抑制剂制品（包含多个浓度的木聚糖酶抑制剂（对于定量，参阅下文的 木聚糖酶抑制剂定量））、250 ill木聚糖酶溶液（含12XU木聚糖酶/ml)和650 ill缓冲液 (〇? IM 柠檬酸-0? 2M 磷酸氢二钠缓冲液，1% BSA(Sigma-Aldrich，USA), pH 5. 0)混合。混合 物在40. (TC恒温5分钟。在时间为5分钟时加入一片Xylazyme片剂。在时间为15分钟 时通过加入IOml 2%TRIS/Na0H，pH 12终止反应。将反应混合物离心（1500x g，10分钟， 20°C)并在590nm检测上清液。木聚糖酶抑制计算为与空白相比较而言的残留活性百分数。
[0124] 所用的内源内_ P -1，4-木聚糖酶抑制剂可获自小麦面粉。该抑制剂是二肽，分子 量约为40kDa(根据SDS-PAGE或质谱检测）且等电点约为8至9. 5。迄今为止的序列分析 显示所述抑制剂具有SEQ ID No. 24所示序列或与其高度同源。
[0125] 对给定抑制剂制品中的抑制剂浓度进行定量的方法可参阅实施例3。
[0126] 以同样方式制备空白，但以水替代抑制剂溶液。
[0127] 本发明还涉及编码本发明所述多肽的核苷酸序列，其包含与一个或多个控制序列 可操作性连接的核苷酸序列，所述控制序列在与该控制序列相容的条件下指导编码序列在 合适的宿主细胞内的表达。可以多种方式处理编码本发明多肽的多核苷酸以提供所述多肽 的表达。在其插入载体之前处理多核苷酸的序列可能是值得做的或必需的，这取决于表达 载体。利用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域众所周知的。
[0128] 控制序列可能是适当的启动子序列，被宿主细胞识别用于表达编码本发明多肽之 多核苷酸的核苷酸序列。启动子序列包含介导多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在 选定宿主细胞内显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并 且可能获自与宿主细胞同源或异源之编码细胞外或细胞内多肽的基因。
[0129] 指导本发明核酸构建体转录，尤其是在细菌宿主细胞内转录的合适启动 子是获自以下来源的启动子：大肠杆菌Iac操纵子、天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因（dagA),枯草芽孢杆菌果聚糖鹿糖酶基因（sacB),地衣 芽孢杆菌（Bacillus licheniformis) a -淀粉酶基因（amyL)，脂肪嗜热芽孢杆菌 (Bacillus stearothermophilus)麦芽淀粉酶基因{amyM),解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens) a-淀粉酶基因{amyQ),地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis) 青霉素酶基因（penP)，枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因，和原核￠-内酰胺酶基因 (Villa-Kamaroff et al. , 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:3727-3731)，以及 tac 启动子（DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21-25)。更多的启动子参阅"Useful proteins from recombinant bacteria〃in Scientific American, 1980, 242:74-94 ；以及 Sambrook et al. , 1989,见上文。
[0130] 指导本发明核酸构建体在丝状真菌宿主细胞内转录的合适启动子的例子是获 自以下来源基因的启动子：米曲霉（Aspergi I Ius oryzae) TAKA淀粉酶，米黑根毛霉 (Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉（Aspergillus niger)中性a-淀粉酶， 黑曲霉（Aspergillus niger)酸稳定a-淀粉酶，黑曲霉（Aspergillus niger)或泡盛曲 霉（Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶{glaA),米黑根毛霉（Rhizomucor miehei)脂肪 酶，米曲霉（Aspergillus oryzae)喊性蛋白酶，米曲霉（Aspergillus oryzae)憐酸丙 糖异构酶，构巢曲霉（Aspergillus nidulans)乙醜胺酶，鎌抱霉（Fusarium venenatum) 淀粉葡糖苷酶（W000/56900),鎌抱霉（Fusarium venenatum) Daria (W0 00/56900)，鎌抱 霉（Fusarium venenatum) Quinn (W0 00/56900)，尖抱鎌刀菌（Fusarium oxysporum)膜蛋 白酶样蛋白酶（W0 96/00787)，瑞氏木霉（Thchoderma reesei)0-葡萄糖苷酶，里氏木 霉（Trichoderma reesei)纤维二糖水解酶 I，里氏木霉（Trichoderma reesei)纤维二 糖水解酶II，里氏木霉（Trichoderma reesei)内切葡聚糖酶I，里氏木霉（Trichoderma reesei)内切葡聚糖酶II，里氏木霉（Trichoderma reesei)内切葡聚糖酶III，里氏木霉 (Trichoderma reesei)内切葡聚糖酶IV，里氏木霉（Trichoderma reesei)内切葡聚糖酶 V，里氏木霉（Trichoderma reesei)木聚糖酶I，里氏木霉（Trichoderma reesei)木聚糖 酶II，里氏木霉（Trichoderma reesei) ￠-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子（来自黑曲霉 (Aspergillus niger)中性a-淀粉酶和米曲霉（Aspergillus oryzae)磷酸丙糖异构酶基 因的启动子的杂合体）；以及它们的突变的、截短的和混合的启动子。
[0131] 在酵母宿主中，有用的启动子获自以下酶的基因：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶（EN0-1),酿酒酵母半乳糖激酶（GAL1),酿酒酵母乙醇脱氢 酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ADHl, ADH2/GAP),酿酒酵母磷酸丙糖异构酶（triose phosphate isomerase, TPI),酿酒酵母金属硫蛋白（CUPl),和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激 酶（Phosphoglycerate kinase)。其它适于酵母宿主细胞的有用启动子参阅Romanos et al.， 1992,Yeast 8:423-488。
[0132] 调控序列也可以是合适的转录终止子序列，被宿主细胞识别来终止转录的序列。 终止子序列与编码所述多肽之核苷酸序列的3'末端可操作性的连接。在选定宿主细胞内 起作用的任何终止子均可用于本发明中。
[0133] 适于丝状真菌宿主细胞的终止子可获自以下酶的有关基因：米曲霉（Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶，黑曲霉（Aspergillus niger)葡糖淀粉酶，构巢曲霉（Aspergillus nidulans)邻氨基苯甲酸合酶（anthranilate synthase),黑曲霉（Aspergillus niger) a-葡萄糖苷酶，和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶。适合酵母 宿主细胞的终止子可获自酿酒酵母烯醇化酶，酿酒酵母细胞色素C(CYCl)，和酿酒酵母 甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因。其它适于酵母宿主细胞的有用终止子参阅Romanos et al.，1992,见上文。
[0134] 调控序列也可能是合适的前导序列，即对于宿主细胞的翻译而言非常重要的mRNA 非翻译区。前导序列与编码所述多肽之核苷酸序列的5'末端可操作性连接。在选定宿主 细胞内起作用的任何前导序列均可用于本发明中。
[0135] 适于丝状真菌宿主细胞的前导序列可获自米曲霉（Aspergillus oryzae)TAKA淀 粉酶和构巢曲霉（Aspergillus nidulans)磷酸丙糖异构酶的基因。
[0136] 适于酵母宿主细胞的前导序列可获自酿酒酵母烯醇化酶（EN0-1)，酿酒酵母3-磷 酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase),酿酒酵母a-因子和酿酒酵母乙醇脱氢酶/ 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ADH2/GAP)的基因。
[0137] 调控序列还可以是聚腺苷酸化序列，即是与核苷酸序列的3'末端可操作性连接 并且在转录时被宿主细胞识别为添加聚腺苷酸残基至被转录mRNA的信号的序列。在选定 宿主细胞内起作用的任何聚腺苷酸化序列均可用于本发明中。
[0138] 适于丝状真菌宿主细胞的聚腺苷酸化序列可获自米曲霉（Aspergillus oryzae) TAKA淀粉酶，黑曲霉（Aspergillus niger)葡糖淀粉酶，构巢曲霉（Aspergillus nidulans)邻氨基苯甲酸合酶（anthranilate synthase),尖抱鎌刀菌（Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶，和黑曲霉属（Aspergillus niger) a-葡萄糖苷酶的有关 基因。
[0139] 用于酵母宿主细胞的聚腺苷酸化序列参阅Guo and Sherman, 1995，Molecular Cellular Biology 15:5983-5990。
[0140] 调控序列也可以是编码与多肽的氨基末端连接之氨基酸序列并指导所编码多肽 进入细胞分泌途径的信号肽编码区。核苷酸序列的编码序列的5'末端可能固有的包含在 翻译读码框架内与编码所述分泌多肽之编码区部分天然连接的信号肽编码区。或者，编码 序列的5'末端可能包含对于编码序列而言是外来的信号肽编码区。在编码序列天然不包 含信号肽编码区的情况下可能需要外源的信号肽编码区。或者，外源的信号肽编码区可能 简单地替代天然信号肽编码区以便促进所述多肽的分泌。无论如何，指导被表达多肽进入 选定宿主细胞之分泌途径即分泌入培养基中的任何信号肽编码区均可能用于本发明中。
[0141] 适于细菌宿主细胞的有效信号肽编码区是获自以下有关基因的信号肽编码 区：芽孢杆菌（Bacillus)NCIB 11837麦芽糖源淀粉酶，脂肪嗜热芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus) a-淀粉酶，地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)枯草杆菌 蛋白酶（subtilisin),地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis) 内酰胺酶，脂肪嗜 热芽抱杆菌（Bacillus stearothermophilus)中性蛋白酶（nprT，nprS，nprM),和枯草芽 抱杆菌 prsA。更多的信号肤参阅 Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57:109-137。
[0142] 适于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码区是获自以下有关基因的信号肽编码 区：米曲霉（Aspergillus oryzae)TAKA 淀粉酶，黑曲霉（Aspergillus niger)中性淀粉 酶，黑曲霉（Aspergillus niger)葡糖淀粉酶，米黑根毛霉（Rhizomucor miehei)天冬氨 酸蛋白酶，特异腐质霉（Humicola insolens)纤维素酶，特异腐质霉（Humicola insolens) 内切葡聚糖酶V，和腐柔毛腐质霉（Humicola lanuginosa)脂肪酶.
[0143] 适于酵母宿主细胞的有用信号肽获自酿酒酵母a-因子和酿酒酵母转化酶的基 因。其它有效的信号肽编码区参阅Romanos et a/.，1992,见上文。
[0144] 调控序列还可以是编码定位于多肽氨基末端的氨基酸序列的前肽编码区。所产 生的多肽被认为是前酶或多肽原（或在某些情况下是酶原）。多肽原通常是无活性的，但 可通过从多肽原催化性或自身催化性切割前肽而转变为成熟的活性多肽。前肽编码区可 能获自以下编码下述的基因：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶（aprE)，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶 (nprf),酿酒酵母a-因子，米黑根毛霉（Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶，和嗜热 毁丝霉（Myceliophthora thermophila)漆酶（W095/33836)。
[0145] 当信号肽和前肽区均存在于多肽的氨基末端时，前肽区定位在紧邻多肽的氨基末 端，而信号肽区则定位于紧邻前肽区的氨基末端。
[0146] 还可适当的添加允许所述多肽表达相对于宿主细胞的生长进行调节的调节序列。 调节系统有例如使得基因表达响应化学或物理刺激物（包括调节化合物的存在）而开启或 关闭的调节系统。在原核体系内的调节系统包括lac，tec，和tip操纵子系统。在酵母内， 可用ADH2系统或GALl系统。在丝状真菌内，TAKA a-淀粉酶启动子，黑曲霉（Aspergillus niger)葡糖淀粉酶启动子和米曲霉（Aspergillus oryzae)葡糖淀粉酶启动子可用作调控 序列。其它的调控序列的例子有允许进行基因扩增的那些调控序列。在真核体系内，这些 包括在氨甲喋呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因，由于重金属而被扩增的金属硫蛋白 基因。在这些案例中，编码多肽的核苷酸序列将可操作性的与所述调控序列连接。
[0147] 本发明还涉及包含编码本发明多肽之多核苷酸、启动子以及转录和翻译终止信号 的重组表达载体。本文所述的各种核酸和调控序列可结合在一起以产生重组表达载体，它 可能包含一个或更多个方便的限制性位点以便在所述位点对编码所述多肽的核苷酸序列 进行插入或取代。或者，编码本发明所述多肽的核苷酸序列可通过将核苷酸序列或包含该 序列的核酸构建体插入适于表达的合适载体进行表达。在构建表达载体时，编码序列位于 所述载体内以便编码序列与用于表达的适当调控序列可操作性的连接。
[0148] 重组表达载体可能是可方便进行重组DNA操作并可使核苷酸序列表达的任何载 体（例如，质粒或病毒）。载体的选择通常取决于载体与该载体待引入之宿主细胞的相容 性。所述载体可能是线性的或闭环的质粒。
[0149] 载体可能是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，它的复制不依赖于 染色体的复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。该载体可能包含保证 自我复制的任何工具。或者，所述载体可能是当引入宿主细胞时被整合入基因组中并与其 所整合入的染色体一起复制的载体。此外，可使用单个载体或质粒或者一起包含待引入宿 主细胞基因组之总DNA的两个或更多个载体或质粒，或者转座子。
[0150] 本发明的载体优选包含一个或更多个可选择标记，它们可允许方便地选择被转 化、被转染、被转导等等的细胞。可选择标记是其产物提供了杀菌剂或病毒抗性、抵抗重金 属、给营养缺陷型提供原养型等等的基因。
[0151] 细菌可选择标记的例子有来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis)的dal基因，或赋予抗生素抗性诸如氨节青霉素、卡那霉素、氯霉素或四 环素抗性的标记。适于酵母宿主细胞的标记物有ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRPl和 URA3。适用于丝状真菌宿主细胞的可选择标记包括但不局限于amdS (乙酰胺酶），argB (鸟 氨酸氨基甲酰转移酶），bar (草胺膦乙酰转移酶），hph(潮霉素磷酸转移酶），niaD(硝 酸还原酶），PyrG (乳清酸核苷-5' -磷酸脱羧酶），sC (硫酸腺苷转移酶（sulfate adenyltransferase))和 trpC(邻氨基苯甲酸合酶（anthranilate synthase))及其它们的 对等物。在某些实施方案中，构巢曲霉（Aspergillus nidulans)或米曲霉（Aspergillus oryzae)的 amdS 和 pyrG 基因以及吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus)的 bar 基因 被用于曲霉（Aspergillus)细胞中。
[0152] 本发明的载体优选包含允许载体整合入宿主细胞基因组或在细胞内不依赖于基 因组而自主复制的元件。对于整合进入宿主细胞基因组的方面，所述载体可依靠编码多肽 的多核苷酸序列或适于通过同源或非同源重组整合入基因组的载体的任何其它元件。或 者，载体可包含用于指导在染色体的准确位置通过同源重组整合入宿主细胞基因组的附加 的核苷酸序列。为了提高在准确位置处整合的可能性，整合元件应优选包含足够数目的核 酸，譬如100至10, OOO个碱基对，优选400至10, OOO个碱基对，更优选800至10, OOO个碱 基对，它们与相应的靶序列具有高度的同一性以提高同源重组的概率。整合元件可能是与 宿主细胞基因组内靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可能是非编码的或编码的核苷 酸序列。另一方面，载体可能通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组内。对于自主复制 而言，载体可能进一步包含能使载体在所述宿主细胞内自主复制的复制起点。复制起点可 能是在细胞内发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语"复制起点"或"质粒复 制子"在此定义为能使质粒或载体在体内进行复制的核苷酸序列。
[0153] 细菌复制起点的例子有允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322, pUC19, pACYC177， 和PACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌（Bacillus)中进行复制的 pUB110，pE194，pTA1060,和 pAMP i 的复制起点。
[0154] 适于用在酵母宿主细胞内的复制起点有例如2 ii复制起点、ARS1、ARS4、ARSl和 CEN3的组合以及ARS4和CEN6的组合。
[0155] 可用于丝状真菌细胞内的复制起点有例如AMAl和ANSI (Gems et a/.，1991，Gene 98:61-67 ;Cullen et al.， 1987,Nucleic Acids Research 15:9163-9175 ;W0 00/24883)。 AMl基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建可依照WO 00/24883中所公开的方法 完成。
[0156] 可将一拷贝以上的本发明之多核苷酸插入宿主细胞中以提高基因产物的产量。可 通过将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组中或者通过将可扩增的可选择标 记基因与所述多核苷酸包含在一起来达到多核苷酸拷贝数目的增加，在后一情形下，包含 扩增拷贝的选择标记基因以及由此而来的附加拷贝的多核苷酸的细胞可通过在适当的可 选择制剂存在的条件下人工培养所述细胞进行选择。
[0157] 用于连接上述元件以构建本发明之重组表达载体的程序是本领域技术人员众所 周知的（参阅，例如Sambrook et al.，1989，见上文）。
[0158] 本发明还涉及重组宿主细胞，其中包含编码本发明多肽的多核苷酸，它被方便的 用于所述多肽的重组生产中。将包含编码本发明多肽之多核苷酸的载体引入宿主细胞中使 得载体作为染色体整合体的一部分存在或如早先所述作为自我复制的染色体外载体存在。 术语"宿主细胞"涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞 后代。宿主细胞的选择很大程度上取决于编码所述多肽的基因及其来源。
[0159] 宿主细胞可以是单细胞微生物，例如原核生物，或者非单细胞微生物，例如 真核生物。有用的单细胞微生物是细菌细胞，诸如革兰氏阳性细菌，包括但不局限 于芽孢杆菌细胞，例如嗜碱性芽孢杆菌（BaciIlus alkalophiIus)，解淀粉芽孢杆 菌（Bacillus amyloliquefaciens),短芽抱杆菌（Bacillus brevis),环状芽抱杆菌 (Bacillus circulans),克劳氏芽抱杆菌（Bacillus clausii),凝结芽抱杆菌（Bacillus coagulans),灿烂芽抱杆菌（Bacillus lautus),迟缓芽抱杆菌（Bacillus lentus), 地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis),巨大芽抱杆菌（Bacillus megaterium), 脂肪嗜热芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus),枯草芽孢杆菌，和苏云金杆 菌（Bacillus thuringiensis);或链霉菌细胞，例如变铅青链霉菌（Streptomyces Iividans)和鼠灰链霉菌（Streptomyces murinus)，或革兰氏阴性细菌诸如大肠杆菌和 假单胞菌（Pseudomonas sp)。在一个方面中，细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌（Bacillus lentus)，地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)，脂肪嗜热芽抱杆菌（Bacillus stearothermophilus)或枯草芽孢杆菌细胞。在另一方面中，芽孢杆菌细胞是嗜碱性的芽 孢杆菌。将载体引入细菌宿主细胞可能通过例如原生质体转化（参阅，例如Chang and Cohen，1979，Molecular General Genetics 168:111-115)，使用感受态细胞（参阅，例 如 Young and Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81:823-829，或 Dubnau and Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology56:209_221)电穿孔（参阅，例 如 Shigekawa and Dower，1988，Biotechniques 6:742-751)，或接合（参阅，例如 Koehler and Thome，1987, Journal of Bacteriology 169:5771-5278)来实现。
[0160] 宿主细胞还可以是真核生物，诸如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
[0161] 在一方面中，宿主细胞是真菌细胞。〃真菌〃用于此处时包括子囊菌门 (Ascomycota)，担子菌门（Basidiomycota)，壶菌门（Chytridiomycota)和接合菌门 (Zygomycota)(如文献所述：Hawksworth et al.，In，Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition，1995,CAB International, University Press, Cambridge, UK) 以及卵菌门（Oomycota)(如文献中所印证的：Hawksworth et al.，1995，见上文，第171 页）和所有的有丝分裂抱子真菌（mitosporic fungi) (Hawksworth et al.，1995，见上 文）。在另一方面中，真菌宿主细胞是酵母细胞。"酵母"用于此处时包括产子囊孢子酵母 (内抱霉目（Endomycetales))，产担抱子酵母（basidiosporogenous yeast)和属于半知菌 (Fungi Imperfecti)(芽孢纲（Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能有变 化，所以针对本发明的目的而言，酵母应如以下文献中所述定义：Biology and Activities of Yeast (Skinner, F. A. , Passmore, S. M. , and Davenport, R. R. , eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980)〇
[0162] 在更进一步的方面，酵母宿主细胞是假丝酵母（Candida)，汉逊酵母属 (Hansenula)，克鲁维酵母菌属（Kluyveromyces)，毕赤酵母属（Pichia)，酵母属 (Saccharomyces)，裂殖酵母属（Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属（Yarrowia)细胞。
[0163] 在某一特定方面，酵母宿主细胞是卡氏酵母（Saccharomyces carlsbergensis)，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，糖化酵母（Saccharomyces diastaticus)，Saccharomyces douglasii，克鲁弗酵母（Saccharomyces kluyveri),诺地 酵母（Saccharomyces norbensis)或卵形酵母（Saccharomyces oviformis)细胞。在另一 方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces Iactis)细胞。在另一方面，酵母 宿主细胞是解脂耶氏酵母（Yarrowia Iipolytica)细胞。
[0164] 在另一方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。〃丝状真菌〃包括分支真菌门 (Eumycota)和卵菌门（Oomycota)的所有丝状形式（参阅Hawksworth et al.，1995，见 上文）。丝状真菌通常特征为由几丁质，纤维素（cellulose)，葡聚糖（glucan)，壳聚 糖（chitosan)，甘露聚糖（mannan)和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。无性繁殖的生长 是通过菌丝延长，而碳分解代谢专性好氧的。相反，酵母诸如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的无性繁殖生长是通过单细胞菌体的出芽，而碳分解代谢可能是发酵性的。
[0165] 另一方面，丝状真菌宿主细胞是支顶孢属（Acremonium)，曲霉属（Aspergillus)， 短梗霉属（Aureobasidium)，烟管菌属（Bjerkandera)，拟錯菌属（Ceriporiopsis)，鬼伞 属（Coprinus)，云芝属（Coriolus)，隐球菌属（Cryptococcus)，Filibasidium，嫌抱菌属 (Fusarium)，腐殖霉属（Humicola)，稻痕菌属（Magnaporthe)，毛霉属（Mucor)，毁丝霉属 (Myceliophthora)，Neocallimastix，脉抱菌属（Neurospora)，拟青霉属（Paecilomyces)， 青霉属（PeniciIlium)，平革菌属（Phanerochaete)，射脉菌属（Phlebia)，Piromyces， 侧鸾（Pleurotus)，裂糟菌属（Schizophyllum)，踝节菌属（Talaromyces)，嗜热子囊 菌属（Thermoascus)，梭抱壳霉属（Thielavia)，弯颈霉属（Tolypocladium)，栓菌属 (Trametes)或木霉菌属（Trichoderma)细胞。
[0166] 另一方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉（Aspergillus awamori)，烟曲霉 (Aspergillus fumigatus)，臭曲霉（Aspergillus foetidus)，日本曲霉（Aspergillus japonicus)，构巢曲霉（Aspergillus nidulans)，黑曲霉（Aspergillus niger)或米曲霉 (Aspergillus oryzae)细胞。另一方面，丝状真菌宿主细胞是 Fusarium bactridioides， 禾谷嫌刀菌（Fusarium cerealis)，克地嫌刀菌（Fusarium crookwellense)，大刀嫌刀菌 (Fusarium cuImorum),禾谷嫌刀菌（Fusarium graminearum)，Fusarium graminum，异抱 嫌抱（Fusarium heterosporum)，Fusarium negundi，尖抱嫌刀菌（Fusarium oxysporum)， 多枝镰孢（Fusarium reticulatum)，粉红镰刀菌（Fusarium roseum)，接骨木镰刀菌 (Fusarium sambucinum)，肤色嫌抱（Fusarium sarcochroum)，拟枝抱嫌刀菌（Fusarium sporotrichioides)，硫色嫌刀菌(Fusarium sulphureum)，Fusarium torulosum,类 (拟）丝抱嫌刀菌（Fusarium trichothecioides)或 Fusarium venenatum 细胞。另一 方面，丝状真菌宿主细胞是黑管菌（Bjerkandera adusta)，干拟錯菌（Ceriporiopsis aneirina)，干拟錯菌（Ceriporiopsis aneirina)，Ceriporiopsis caregiea，浅黄拟 錯孔菌(Ceriporiopsis gilvescens), Ceriporiopsis pannocinta，Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa，虫拟錯菌（Ceriporiopsis subvermispora),灰盖 鬼伞（Coprinus cinereus)，毛云芝菌（Coriolus hirsutus)，特异腐质霉（Humicola insolens)，腐柔毛腐质霉（Humicola lanuginosa)，米黑毛霉（Mucor miehei)，嗜热 毁丝霉（Myceliophthora thermophila)，粗糖脉抱菌（Neurospora crassa)，产紫青霉 (Penicillium purpurogenum)，黄抱原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium),身寸脉 侧菌（Phlebia radiata)，杏鲍燕（Pleurotus eryngii)，太瑞斯梭抱壳霉（Thielavia terrestris)，长绒毛栓菌（Trametes villosa)，云芝（Trametes versicolor)，哈茨木霉 (Trichoderma harzianum)，康氏木霉（Trichoderma koningii)，长梗木霉（Trichoderma Iongibrachiatum)，里氏木霉（Trichoderma reesei)或绿色木霉（Trichoderma viride) 细胞。真菌细胞可以通过本身已知的方式通过包括原生质体形成、原生质体转化和细胞 壁再生的过程被转化。适合曲霉属（Aspergillus)和木霉菌属（Trichoderma)宿主细 胞的转化步骤参阅 EP 238023 和 Yelton et al.，1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA81:1470-1474。适合转化嫌抱菌（Fusarium)的方法参阅 Malardier et al.，1989, Gene 78:147-156 和 WO 96/00787。酵母的转化可用以下文献 所述步骤进行：Becker and Guarente，In Abelson, J. N. and Simon, M. I. , editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194,pp 182-187,Academic Press,Inc. , New York ；lto et al.，1983,Journal of Bacteriology 153:163 ；and Hinnen et a/.，1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75 ；1920〇
[0167] 本发明还涉及产生本发明多肽的方法，包括：(a)在有益于所述多肽生产的条件 下培养细胞，该细胞在其野生型形式下能产生所述多肽；然后（b)回收所述多肽。优选的， 所述细胞属于曲霉属（Aspergillus),更优选是烟曲霉（Aspergillus fumigatus)。
[0168] 本发明还涉及生产本发明多肽的方法，包括：(a)在有助于所述多肽生产的条件 下培养宿主细胞；和（b)回收所述多肽。
[0169] 在本发明的生产方法中，用本领域众所周知的方法将所述细胞培养于适于所述多 肽产生的营养培养基上。例如，在实验室或工业发酵罐中以合适的培养基并且在允许所述 多肽表达和/或分离的条件下通过摇瓶培养和小规模或大规模发酵（包括连续的、分批的、 分批投料或固态发酵）培养细胞。用本领域已知的步骤在包含碳和氮源以及无机盐的合适 营养培养基上进行培养。合适的培养基可购自供应商或依照已发表的组成配制（例如，在 美国典型培养物保藏（American Type Culture Collection)的目录上）。若所述多肽被分 泌入营养培养基中，则可直接从培养基中回收该多肽。若所述多肽不分泌到培养基中，则可 从细胞裂解物中回收它。
[0170] 可用本领域已知特异于所述多肽的方法检测该多肽。这些检测方法可包括使用特 异抗体、形成酶产物或酶底物的消失。
[0171] 例如，可如本文所述用酶检测法测定所述多肽的活性。
[0172] 产生的多肽可用本领域已知的方法回收。例如，可通过常规方法从营养培养基中 回收所述多肽，这些方法包括但不局限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、挥发或沉淀。本发明 的多肽可通过本领域已知的多种方法进行纯化，包括但不局限于层析（例如离子交换、亲 和、疏水、层析聚焦和分子排阻）、电泳流程（例如制备型等电聚焦）、差异溶解度（例如硫 酸铵沉淀）、SDS-PAGE 或提取（参阅，例如 Protein Purification, J. -C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989)来获得充分纯的多肤。
[0173] 一方面，在第110位的氨基酸修饰是氨基酸取代。
[0174] 一方面，在第110位的氨基酸修饰是氨基酸删除。
[0175] 一方面，在第110位的氨基酸修饰是氨基酸插入。
[0176] 在某些实施方案中，测定相对于SEQ ID No. 1的序列同一性，其中SEQ ID No. 1所 述氨基酸序列进一步包含信号肽序列，诸如其天然信号肽序列。
[0177] 在某些实施方案中，本发明所述多肽与SEQ ID No. 1具有至少90、92或95%的同 一性。
[0178] 在某些实施方案中，本发明多肽与选自SEQ ID No. 2-22之中的具有最高同一性百 分比的序列具有至少76, 78, 80, 85, 90, 95, 98或95%的同一性。
[0179] 在某些实施方案中，本发明所述多肽与SEQ ID No. 2具有至少 76, 78, 8〇, 85, 9〇, ％，98 或 的同一性。
[0180] 在某些实施方案中，本发明所述多肽与SEQ ID No. 3具有至少 76, 78, 8〇, 85, 9〇, 95, 98 或 95% 的同一性。
[0181] 在某些实施方案中，本发明所述多肽具有￠-果冻卷折叠。
[0182] 在本发明所述的某些实施方案中，第110位的氨基酸修饰是氨基酸取代。
[0183] 在本发明所述的某些实施方案中，第110位的氨基酸修饰是取代为选自以下的任 一不同氨基酸残基：丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰 胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨 酸，色氨酸，酪氨酸和缬氨酸。
[0184] 在本发明所述的某些实施方案中，第110位的氨基酸修饰是取代为选自以下的任 一不同氨基酸残基：丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸， 组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，色氨酸， 酪氨酸和缬氨酸。
[0185] 在本发明所述的某些实施方案中，第110位的氨基酸修饰是取代为选自以下的任 一不同氨基酸残基：谷氨酸，色氨酸，丙氨酸和半胱氨酸。
[0186] 在本发明所述的某些实施方案中，第110位的氨基酸修饰是取代为丙氨酸。
[0187] 在某些实施方案中，本发明所述多肽具有总数少于250个氨基酸，诸如少于240， 诸如少于230,诸如少于220,诸如少于210,诸如少于200个氨基酸，诸如在160至240个 范围内，诸如在160至220个氨基酸范围内。
[0188] 在某些实施方案中，本发明所述多肽包含在以下任何一个或多个位置处的一个或 多个修饰：11，12, 13, 34, 54, 77, 81，99, 104, 113, 114, 118, 122, 141，154, 159, 162, 164, 166 和175,所述位置被确定为SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌氨基酸序列的相应位置。
[0189] 在某些实施方案中，本发明所述多肽包含选自以下的一个或更多个氨基酸取代： HF, 12F, 54Q, 54W, 122D, 113A, 13Y, 113D, 175L, 122F, 34K, 99Y, 104W, 141Q, 154R, 159D, 175K ，811, 166F, 162E, 162D, 164F, 114D, 114Y, 114F, 118V, 175K, 77L, 77M, 77S, 77V,和 77Y,所述 位置被确定为SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌氨基酸序列的相应位置。
[0190] 在某些实施方案中，本发明所述多肽包含选自以下的一个或更多个氨基酸取 代：D11F，G12F，N54Q，R122D，Y113A，G13Y，Y113D，N141Q，Q175L，R122F，G34K，K99Y，T104 ff, K154R, N159D, Q175K, V81I, Y166F, S162E, S162D, W164F, N114D, N114Y, N114F, I118V, I77L，I77M，I77S，I77V和I77Y，所述位置被确定为SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌氨基 酸序列的相应位置。
[0191] 在某些实施方案中，本发明所述多肽包含在以下任何一个或多个氨基酸位置处的 一个或多个修饰：13, 99, 104, 113, 122, 154, 159和175,所述位置被确定为SEQ ID No. 1所 示之枯草芽孢杆菌氨基酸序列的相应位置。
[0192] 在某些实施方案中，本发明所述多肽包含在以下氨基酸位置处的取代： 13, 99, 104, 113, 122, 154, 159和175,所述位置被确定为SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌 氨基酸序列的相应位置。
[0193] 在某些实施方案中，本发明所述多肽进一步包含在以下任何一个或多个氨基酸位 置处的一个或多个修饰：114和166,所述位置被确定为SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌 氨基酸序列的相应位置。
[0194] 在某些实施方案中，本发明所述多肽进一步包含在以下任何一个或多个氨基酸位 置处的一个或多个取代：114和166,所述位置被确定为SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌 氨基酸序列的相应位置。
[0195] 在某些实施方案中，本发明所述多肽包含在以下氨基酸位置中至少4个位置处的 取代：13, 99, 104, 113, 114, 122, 154, 159, 166 和 175,所述位置被确定为 SEQ ID No. 1 所示 之枯草芽孢杆菌氨基酸序列的相应位置。
[0196] 在某些实施方案中，本发明所述多肽包含在以下氨基酸位置处的取代： 13, 99, 104, 113, 114, 122, 154, 159和175,所述位置被确定为SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢 杆菌氨基酸序列的相应位置。
[0197] 在某些实施方案中，本发明所述多肽包含在以下氨基酸位置处的取代： 13, 99, 104, 113, 122, 154, 159, 166和175,所述位置被确定为SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢 杆菌氨基酸序列的相应位置。
[0198] 在某些实施方案中，本发明所述多肽包含在以下氨基酸位置处的取代： 13, 99, 104, 113, 122, 154, 159和175,所述位置被确定为SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌 氨基酸序列的相应位置。
[0199] 在某些实施方案中，本发明所述多肽包含选自以下的一个或更多个氨基酸取代： 13Y, 99Y, 104W, 110A, 113D, 114D, 114F, 122F, 154R, 159D, 166F, 175K 和 175L,所述位置被确 定为SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌氨基酸序列的相应位置。
[0200] 在某些实施方案中，本发明所述多肽相比于选自SEQ ID No. 1-22之中的与其具有 最高同一性的序列而言具有至少5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。
[0201] 在某些实施方案中，本发明所述多肽具有至少9或10个氨基酸取代。
[0202] 在某些实施方案中，本发明所述多肽包含选自以下的一个或更多个氨基酸取代：
[0203] a. DlIF, R122D 和 Tl 10A ;
[0204] b. Dl IF, R122D, Tl 10A 和 Yl 13A ;
[0205] c. G13Y, Tl 10A, Yl 13D, R122D 和 Q175L ;
[0206] d. G13Y, Tl 10A, Yl 13D, R122F 和 Q175L ;
[0207] e. G13Y, G34K, Tl 10A, Yl 13D, R122D 和 Q175L ;
[0208] f. G13Y, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, NI 14D, R122F, K154R, N159D 和 Q175K ;
[0209] g. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D, Q175 和 V81I ;
[0210] h. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D, Y166F 和 Q175L ;
[0211] i. G13Y, T110A, Y113D, R122D, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0212] j. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0213] L G13Y, T110A, Y113D, R122D, S162E 和 Q175L ;
[0214] I. G13Y, T110A, Y113D, R122D, S162D 和 Q175L ;
[0215] m. G13Y, Tl 10A, Yl 13D, R122D, W164F 和 Q175L ;
[0216] n. G13Y, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, NI 14D, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0217] 〇? G13Y, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, NI 14Y, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0218] p. G13Y, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, NI 14F, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0219] q. G13Y, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, I118V, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0220] r. G13Y, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, NI 14Y, R122F, K154R, N159D 和 Q175K ;
[0221] s. G13Y, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, NI 14D, R122F, K154R, N159D 和 Q175K ;
[0222] t. G13Y, I77L, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0223] u. G13Y, I77M, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0224] V. G13Y, I77S, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0225] w. G13Y, I77V, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0226] x. G13Y，I77Y，K99Y，T104W，Tl 10A，Yl 13D，R122F，K154R，N159D 和 Q175L
[0227] y. G13Y, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, N141Q, K154R, N159D, Q175L ；
[0228] z. G13Y, N54Q, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, N141Q, K154R, N159D, Q175 ；
[0229] aa. G13Y, N54W, K99Y, T104W, T110A, Y113D, R122F, 141Q, K154R, N159D, 175L ；
[0230] bb. G13Y, N54Q, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114F, R122F, K154R, N159D, Q175L ；
[0231] cc. G13Y, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, NI 14F, R122F, 141Q, K154R, N159D, Q175L ;和
[0232] dd. G13Y, 54Q, K99Y, T104W, T110A, Y113D, N114F, R122F, 141Q, K154R, N159D, Q175 L ；
[0233] 所述位置被确定为SEQ ID No. I所示之枯草芽孢杆菌氨基酸序列的相应位置。
[0234] 在某些实施方案中，本发明所述多肽包含选自以下的一个或更多个氨基酸取代：
[0235] a. G13Y，K99Y，T104W，Tl 10A，Yl 13D，NI 14D，R122F，K154R，N159D 和 Q175K ;
[0236] b. G13Y, K99Y, T104W, Tl10A, Yl13D, R122F, K154R, N159D, Y166F 和 Q175L ;
[0237] c. G13Y, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0238] d. G13Y, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, NI 14D, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0239] e. G13Y, K99Y, T104W, Tl 10A, Yl 13D, NI 14F, R122F, K154R, N159D 和 Q175L ;
[0240] 所述位置被确定为SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌氨基酸序列的相应位置。
[0241] 在某些实施方案中，本发明所述多肽具有麸皮溶解活性。
[0242] 在某些实施方案中，本发明所述多肽是分离的形式。
[0243] 术语"分离的"用于此处意指所述多肽至少大体上没有至少一种在自然界与所述 序列天然相伴的其它组分。
[0244] 在本发明所述的某些实施方案中，第110位的氨基酸修饰不是T110D。
[0245] 在某些实施方案中，具有木聚糖酶活性的多肽在第110位没有天冬氨酸。
[0246] 在某些实施方案中，本发明所述多肽在木聚糖酶活性检测中相较于SEQ ID No. 1 所示之枯草芽孢杆菌氨基酸序列而言具有改善的木聚糖酶活性。
[0247] 在某些实施方案中，本发明所述多肽由于第110位的修饰而具有改善的木聚糖酶 活性。
[0248] 在某些实施方案中，本发明所述多肽在麸皮溶解活性检测中相较于SEQ ID No. 1 所示之枯草芽孢杆菌氨基酸序列而言具有改善的麸皮溶解活性。
[0249] 在某些实施方案中，本发明所述多肽由于第110位的修饰而具有改善的麸皮溶解 活性。
[0250] 在某些实施方案中，本发明所述多肽对木聚糖酶抑制剂的敏感性降低。
[0251] 在某些实施方案中，本发明所述多肽具有包含在选自以下列表位置处之修饰的氨 基酸序列：
[0252] a) 13/110/113/122/154/159/175 ；
[0253] b)13/99/104/110/113/122/154/159/166/175 ；
[0254] c)13/99/104/110/113/114/122/154/159/175 ；
[0255] d)13/110/113/122/175 ；
[0256] e)13/99/104/110/113/122/154/159/175 ；
[0257] f)13/99/104/110/113/122/154/159/175 ；
[0258] g)13/99/104/110/113/114/122/154/159/175 ；
[0259] h)13/99/104/110/113/114/122/154/159/175 ；
[0260] i)13/99/104/110/113/114/122/154/159/175 ；
[0261] j)13/99/104/110/113/114/122/154/159/175 ；
[0262] k)13/77/99/104/110/113/122/154/159/175 ；
[0263] I)13/81/99/104/110/113/122/154/159/175 ；
[0264] m) 13/110/113/122/164/175 ；
[0265] n)13/110/113/122/162/175 ；
[0266] o)13/110/113/122/175 ；
[0267] p)11/122/110/113 ；
[0268] q)13/77/99/104/110/113/122/154/159/175 ；
[0269] r) 11/122/110 ；
[0270] s) 13/34/110/113/122/175 ；
[0271] t) 13/77/99/104/110/113/122/154/159/175 ；
[0272] u)13/77/99/104/110/113/122/154/159/175 ；
[0273] v)13/99/104/110/113/118/122/154/159/175 ；
[0274] w)13/110/113/122/162/175 ；
[0275] x)13/77/99/104/110/113/122/154/159/175 ；
[0276] y)13/99/104/110/113/122/141/154/159/175 ；
[0277] z)13/54/99/104/110/113/122/141/154/159/175 ；
[0278] aa)13/54/99/104/110/113/122/141/154/159/175 ；
[0279] bb)13/54/99/104/110/113/114/122/154/159/175 ；
[0280] cc) 13/99/104/110/113/114/122/141/154/159/175 ;和
[0281] dd)13/54/99/104/110/113/114/122/141/154/159/175 ；
[0282] 所述位置被确定为SEQ ID No. I所示之枯草芽孢杆菌氨基酸序列的相应位置。
[0283] 在某些实施方案中，本发明所述多肽具有包含选自以下列表之氨基酸取代的氨基 酸序列：
[0284] a)13Y/110A/113D/122D/154R/159D/175L ；
[0285] b)13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/166F/175L ；
[0286] c)13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/175L ；
[0287] d)13Y/110A/113D/122F/175L ；
[0288] e)13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
[0289] f)13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175K ；
[0290] g)13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/175K ；
[0291] h)13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/175L ；
[0292] i)13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/175L ；
[0293] j)13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/175K ；
[0294] k)13Y/77L/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
[0295] I)13Y/81I/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
[0296] m)13Y/110A/113D/122D/164F/175L ；
[0297] n)13Y/110A/113D/122D/162D/175L ；
[0298] o)13Y/110A/113D/122D/175L ;
[0299] p)11F/122D/110A/113A ;
[0300] q)13Y/77Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
[0301] r)11F/122D/110A ；
[0302] s)13Y/34K/110A/113D/122D/175L ;
[0303] t)13Y/77V/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
[0304] u)13Y/77M/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
[0305] v)13Y/99Y/104W/110A/113D/118V/122F/154R/159D/175L ；
[0306] w)13Y/110A/113D/122D/162E/175L ;
[0307] x)13Y/77S/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
[0308] y)13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L ；
[0309] z)13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L ；
[0310] aa)13Y/54W/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L ；
[0311] bb)13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/175L ；
[0312] cc)13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/159D/175L ;和
[0313] dd)13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/159D/175L ；
[0314] 所述位置被确定为SEQ ID No. I所示之枯草芽孢杆菌氨基酸序列的相应位置。
[0315] 在某些实施方案中，本发明所述多肽具有包含选自以下列表之氨基酸取代的SEQ ID No. 1之氨基酸序列：
[0316] a)G13Y/T110A/Y113D/R122D/K154R/N159D/Q175L ；
[0317] b)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Y166F/Q175L ；
[0318] c)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0319] d)G13Y/T110A/Y113D/R122F/Q175L ;
[0320] e)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0321] f)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175K ；
[0322] g)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q175K ；
[0323] h)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0324] i)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0325] j)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q175K ；
[0326] k)G13Y/I77L/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0327] l)G13Y/V81I/K99Y/T104ff/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0328] m)G13Y/T110A/Y113D/R122D/W164F/Q175L ；
[0329] n)G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162D/Q175L ；
[0330] o)G13Y/T110A/Y113D/R122D/Q175L ;
[0331] p)Dl1F/R122D/T110A/Y113A ;
[0332] q)G13Y/I77Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0333] r)Dl1F/R122D/T110A ;
[0334] s)G13Y/G34K/T110A/Y113D/R122D/Q175L ；
[0335] t)G13Y/I77V/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0336] u)G13Y/I77M/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0337] v)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/1118V/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0338] w)G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162E/Q175L ；and
[0339] x)G13Y/I77S/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L
[0340] y)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L ；
[0341] z)G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L ；
[0342] aa)G13Y/N54W/K99Y/T104W/T11OA/Y113D/R122F/141Q/K154R/N159D/175L ；
[0343] bb)G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0344] cc)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/K154R/N159D/Q175L ;和
[0345] dd)G13Y/54Q/K99Y/T104ff/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/K154R/N159D/ Q175L。
[0346] 在某些实施方案中，本发明所述多肽具有包含选自以下列表之氨基酸取代的氨基 酸序列：
[0347] a)13Y/110A/113D/122D/154R/159D/175L ；
[0348] b)13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/166F/175L ；
[0349] c)13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/175L ；
[0350] d)13Y/110A/113D/122F/175L ；
[0351] e)13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
[0352] f)13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175K ；
[0353] g)13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/175K ；
[0354] h)13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/175L ；
[0355] i)13Y/99Y/104W/110A/113D/114D/122F/154R/159D/175L ；
[0356] j)13Y/99Y/104W/110A/113D/114Y/122F/154R/159D/175K ；
[0357] k)13Y/77L/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
[0358] I)13Y/81I/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
[0359] m)13Y/110A/113D/122D/164F/175L ；
[0360] n)13Y/110A/113D/122D/162D/175L ;
[0361] o)13Y/110A/113D/122D/175L ；
[0362] p)11F/122D/110A/113A ;
[0363] q)13Y/77Y/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
[0364] r)11F/122D/110A ；
[0365] s)13Y/34K/110A/113D/122D/175L ;
[0366] t)13Y/77V/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ;
[0367] u)13Y/77M/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ；
[0368] v)13Y/99Y/104W/110A/113D/118V/122F/154R/159D/175L ；
[0369] w)13Y/110A/113D/122D/162E/175L ;
[0370] x)13Y/77S/99Y/104W/110A/113D/122F/154R/159D/175L ;
[0371] y)13Y/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L ；
[0372] z)13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L ；
[0373] aa)13Y/54W/99Y/104W/110A/113D/122F/141Q/154R/159D/175L ；
[0374] bb)13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/154R/159D/175L ；
[0375] cc)13Y/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/159D/175L ;和
[0376] dd)13Y/54Q/99Y/104W/110A/113D/114F/122F/141Q/154R/159D/175L,
[0377] 所述位置被确定为SEQ ID No. I所示之枯草芽孢杆菌氨基酸序列的相应位置。
[0378] 在某些实施方案中，本发明所述多肽具有SEQ ID No. 1的氨基酸序列，其中具有选 自以下列表的氨基酸取代：
[0379] a)G13Y/T110A/Y113D/R122D/K154R/N159D/Q175L ；
[0380] b)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Y166F/Q175L ；
[0381] c)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0382] d)G13Y/T110A/Y113D/R122F/Q175L ;
[0383] e)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0384] f)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175K ；
[0385] g)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q175K ；
[0386] h)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0387] i)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0388] j)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114Y/R122F/K154R/N159D/Q175K ；
[0389] k)G13Y/I77L/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0390] l)G13Y/V81I/K99Y/T104ff/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0391] m)G13Y/T110A/Y113D/R122D/W164F/Q175L ；
[0392] n)G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162D/Q175L ；
[0393] o)G13Y/T110A/Y113D/R122D/Q175L ;
[0394] p)Dl1F/R122D/T110A/Y113A ;
[0395] q)G13Y/I77Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0396] r)Dl1F/R122D/T110A ;
[0397] s)G13Y/G34K/T110A/Y113D/R122D/Q175L ；
[0398] t)G13Y/I77V/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0399] u)G13Y/I77M/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0400] v)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/1118V/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0401] w)G13Y/T110A/Y113D/R122D/S162E/Q175L ;和
[0402] x)G13Y/I77S/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/K154R/N159D/Q175L
[0403] y)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L ；
[0404] z)G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/R122F/N141Q/K154R/N159D/Q175L ；
[0405] aa)G13Y/N54W/K99Y/T104W/T11OA/Y113D/R122F/141Q/K154R/N159D/175L ；
[0406] bb)G13Y/N54Q/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/K154R/N159D/Q175L ；
[0407] cc)G13Y/K99Y/T104W/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/K154R/N159D/Q175L ;和
[0408] dd)G13Y/54Q/K99Y/T104ff/T110A/Y113D/N114F/R122F/141Q/K154R/N159D/ Q175L。
[0409] 在某些实施方案中，本发明所述多肽不是SEQ ID No. 25。
[0410] 在某些实施方案中，本发明所述多肽不具有选自以下列表的序列：
[0411] 国际专利申请 W00238746 的 SEQ ID No. 57 ;
[0412] 国际专利申请 TO0238746 的 SEQ ID No. 62 ;
[0413] 国际专利申请 TO0238746 的 SEQ ID No. 59 ;
[0414] 国际专利申请 TO0238746 的 SEQ ID No. 53 ;
[0415] 国际专利申请 TO0238746 的 SEQ ID No. 65 ;
[0416] 国际专利申请 TO0238746 的 SEQ ID No. 56 ;
[0417] 国际专利申请 TO0238746 的 SEQ ID No. 64:
[0418] 国际专利申请 TO0238746 的 SEQ ID No. 52 ;
[0419] 国际专利申请 W00238746 的 SEQ ID No. 63 ;
[0420] 国际专利申请 TO0238746 的 SEQ ID No. 61 ;
[0421] 国际专利申请 W00238746 的 SEQ ID No. 60 ;
[0422] 国际专利申请 TO0238746 的 SEQ ID No. 58 ;
[0423] 国际专利申请 TO0238746 的 SEQ ID No. 55 ;
[0424] 国际专利申请 TO0238746 的 SEQ ID No. 12 ;
[0425] 国际专利申请 TO0238746 的 SEQ ID No. 11 ;
[0426] 国际专利申请 TO0068396 的 SEQ ID No. 21 ;和
[0427] 国际专利申请 W00068396SEQ ID No. 22。
[0428] 在本发明的某些实施方案中，所述氨基酸序列被用于大规模的应用中。
[0429] 优选所述氨基酸序列在宿主生物体培养后以每升总细胞培养物体积中含Ig至约 l〇〇g的量产生。
[0430] 本发明还涉及包含如本文所述之氨基酸序列和/或编码木聚糖酶之核苷酸序列 的组合物。
[0431] 本发明的组合物可改善供消费含所述组合物的产品的气味，滋味、温和性，一致 性，质地、形状、口感，硬度，粘度，胶裂，结构和/或感官特性以及营养。此外，本发明 的组合物还可与供消费之产品的其它组分联合使用以达到所说的改善。
[0432] 尽管优选本发明组合物用于改进含所述组合物供消费的产品的气味，滋味、温和 性，一致性，质地、形状、口感，硬度，粘度，胶裂，结构，表面光滑性和/或感官特性以 及营养，本发明还覆盖了将本发明组合物用作含其它组分之药用组合物的组分以向消费者 提供医学或生理学益处。
[0433] 因此，本发明的组合物可与其它组分联合使用。
[0434] 其它组分的例子包括以下一种或多种：增稠剂，胶凝剂，乳化剂，粘合剂，结晶 改良剂，甜味剂（包括人造增甜剂），流变改性剂，稳定剂，抗氧化剂，染料，酶，载体， 媒介物，赋形剂，稀释剂，润滑剂，增香剂，着色剂，悬浮剂，崩解剂，造粒粘合剂等。 这些其它组分可以是天然的。这些其它组分可以通过使用化学的和/或酶促的技术制备。
[0435] 术语"增稠剂或胶凝剂"用于此处时指通过减慢或阻碍颗粒移动来防止分开的产 品，所述颗粒是不混溶液体小滴、气体或不溶固体。增稠发生在当单独的水合分子引起粘性 增加，减慢分离的情况下。胶凝发生在当水合分子连接形成三维网络而捕获颗粒，从而使它 们固定。
[0436] 术语"稳定剂"用于此处时定义为保持产品（例如食品）不随时间改变的一种成 分或几种成分的联合。
[0437] 术语"乳化剂"用于此处时指防止乳剂分离的成分（例如一种食品成分）。乳剂 是两种不混溶的物质，一种以小滴形式存在，包含于另一种内。乳剂可以是水包油组成，其 中小滴或被分散相是油而连续相是水；或者是油包水组成，其中水变成了被分散相而连续 相是油。泡沫（液体包气体）以及悬浮液（液体包固体）也可通过使用乳化剂来稳定。气 化可发生在三相系统中，其中空气被液态油包围然后经由用乳化剂稳定的凝聚油脂结晶来 加以稳定。乳化剂具有对水有亲和力的极性基团（亲水的）和被油类所吸引的非极性基团 (亲脂的）。它们被吸收在两种物质的接触面，形成了两表面间的薄膜，起到稳定乳剂的作 用。乳化剂的亲水/亲脂特性受分子结构的影响。这些特性通过亲水的/亲脂的平衡（HLB) 值进行鉴定。低HLB值指示较大的亲脂倾向，可用于稳定油包水的乳剂。高HLB值指向亲 水的乳化剂，通常用于水包油的乳剂。这些数值来自简单的体系。因为食物常常包含影响 乳化特性的其它成分，所以HLB值可能不总是乳化剂选择的可靠指南。
[0438] 用于此处时"粘合剂"指通过物理或化学反应将产物粘合在一起的成分（例如食 物成分）。例如在"elation"过程中，水被吸收，达到了粘合的效果。不过，粘合剂可吸收其 它液体，诸如油，将它们保持在产品内。在本发明的上下文中粘合剂通常用于固体或低湿度 产品中，例如烘焙产品：糕饼、甜圈、面包及其它。
[0439] 术语"结晶改良剂"用于此处指影响油脂或水结晶的成分（例如食物成分）。由 于两个原因，冰晶的稳定是很重要的。第一个原因从分离的立场看直接涉及产物的稳定性。 产品经受越多的冻/融循环，产生的冰晶就越大。这些巨大的晶体可以破坏产品的结构，它 或者是天然存在的，如同在细胞壁的情形中，或者是由于"elation"而造成的。因为水不再 保持在原位，所以产品在融化后可能展现出脱水收缩或滴水。
[0440] 其次，在产品以冷冻状态消费的情况下，这些巨大的晶体导致了令人不快的有砂 石乐的口感。
[0441] 〃载体〃或〃媒介物〃意指适于化合物施用的材料，包括本领域已知的任何所述材 料，例如任何液体、凝胶、溶齐IJ、液体稀释齐IJ、增溶剂等等，它是非毒性的并且不以有害形式 与组合物的任何组分相互作用。
[0442] 在营养上可接受的载体的例子包括例如水、盐溶液、醇、硅氧烷，蜡，凡士林油， 植物油、聚乙二醇，丙二醇，脂质体，糖，明胶，乳糖，直链淀粉，硬脂酸镁，滑石，表 面活性剂，娃酸，粘性石錯，芳香油，脂肪酸单甘油酯和二甘油酯，petroethral脂肪酸 酯，羟甲基-纤维素，聚乙烯吡咯烷酮等等。
[0443] 赋形剂的例子包括以下一种或多种：微晶纤维素和其它纤维素、乳糖，柠檬酸钠， 碳酸钙，磷酸氢钙，甘氨酸，淀粉，乳糖和高分子量聚乙二醇。
[0444] 崩解剂的例子包括以下一种或多种：淀粉（优选玉米、马铃薯或木薯淀粉），淀粉 羟乙酸钠，交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐。
[0445] 造粒粘合剂的例子包括以下一种或多种：聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基甲基纤维素 (HPMC)，羟丙基纤维素（HPC)，蔗糖，麦芽糖，明胶和阿拉伯树胶。
[0446] 润滑剂的例子包括以下一种或多种：硬脂酸镁，硬脂酸，甘油二十二烷酸酯和滑 石.
[0447] 稀释剂的例子包括以下一种或多种：水、乙醇、丙二醇和丙三醇以及它们的组合。
[0448] 其它组分可同时（例如，当它们混合在一起或甚至当它们经由不同途径递送时） 或顺序（例如，它们可通过不同途径递送）使用。
[0449] 用于此处时术语"适于动物或人消耗的组分"意指作为补充物被加入或者可以加 入本发明组合物中的化合物，它可能是营养上有益的、纤维替代品或者通常对消费者具有 有益的影响。所述成分可用于需要凝胶化，质地化（texturising),稳定，悬浮，形成薄 膜和结构化，保持湿润，而不添加不必要的粘性的各种产品中。优选的，所述成分能改善活 培养物的保质期和稳定性。
[0450] 举例说来，所述组分可以是益生元诸如藻酸盐，黄原胶，果胶，槐树豆 胶（LBG),菊粉，瓜尔胶，低聚半乳糖（galacto_oligosaccharide，GOS)，左旋寡糖 类（fruct〇-〇ligosaccharide,FOS),低聚乳果糖（Iactosucrose),大豆寡糖，帕 拉金糖（palatinose),低聚异麦芽糖（isomalto-oligosaccharides),低聚葡糖 (gluco-oligosaccharide)和低聚木糖（xylo-oligosaccharides) 〇
[0451] 本发明的组合物还可用作食物，或用于食物制备中。在此，术语"食物"是在广义 上使用的，涵盖了人的食物以及动物的食物（即饲料）。在一个优选的方面，所述食物是供 人消费的。
[0452] 所述食物可以是溶液形式或作为固体-取决于用途和/或应用方式和/或施用方 式。
[0453] 当用作或用于食物诸如功能性食物制备中时-本发明的组合物可与以下一种或 多种成分联合使用：营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形 齐U、营养上可接受的佐剂、营养活性成分。
[0454] 本发明的组合物可用作食物成分。
[0455] 用于此处时术语"食物成分"包括作为或能够作为营养补充物和/或纤维补充物 加入功能性食物或食品中的配方。术语食物成分用于此处时还指可低水平用于需要凝胶 化，纤维卷曲化，稳定，悬浮，形成薄膜和结构化，保持湿润和改善口感而不增加粘性的 多种产品中的配方。
[0456] 所述食物可以是溶液形式或作为固体-取决于用途和/或应用方式和/或施用方 式。
[0457] 本发明的组合物可以是-或者可以被加入_食物补充物。
[0458] 本发明的组合物可以是-或者可以被加入_功能性食物。
[0459] 用于此处时"功能性食物"意指不仅能提供营养效果和/或味觉的满足，还能给消 费者传递更多有益效果的食物。
[0460] 因此，功能性食物是具有掺入其中赋予食物以特殊功能性的组分或成分（诸如本 文所述的那些）的普通食物-所述功能性是除了纯粹的营养作用之外的例如医学或生理学 益处。
[0461] 尽管功能性食物没有法律定义，对此领域有兴趣的大部分人员都同意它们是由于 具有特殊健康作用而上市的食物。
[0462] 某些功能性食物是保健食品。在此，术语"保健食品"意指不仅能提供营养效果和 /或味觉的满足，还能给消费者传递治疗（或其它有益）效果的食物。保健食品跨越了食物 和药品之间的传统分界线。
[0463] 调查显示消费者最着重于涉及心脏疾病的功能性食物要求。预防癌症是营养品令 大量消费者感兴趣的另一方面，但有趣的是在此领域消费者感到他们可发挥的控制作用最 小。事实上，根据世界卫生组织（World Health Organization)的报告，至少35%的癌症病 例是饮食相关的。此外涉及骨质疏松症，肠道健康和肥胖现象的需求也是关键的因素，它 们可能刺激功能性食物的购买并驱使市场发展。
[0464] 本发明的组合物可用于制备食品，诸如以下一种或多种：果酱、橘子酱、果冻、乳制 品（诸如牛奶或奶酪）、肉制品、家禽制品、鱼产品和烘焙产品。
[0465] 举例而言，本发明的组合物可用作以下制品的成分：软饮料、水果汁或包含乳清蛋 白的饮料、健康茶饮、可可饮料、牛奶饮料和乳酸菌饮料、酸奶和酸奶饮品、奶酪、冰激凌、水 冰和甜品、糖果、饼干蛋糕和蛋糕混合料、小吃、早餐谷物、速食面和杯面、速食汤和杯汤、平 衡食物和饮料、增甜剂、质地改善的快餐棒、纤维棒、烘焙稳定的水果馅、喜欢的糖汁（care glaze)、巧克力烘焙馅料、奶酪蛋糕味馅料、水果味蛋糕馅料、蛋糕和甜甜圈糖衣、热稳定烘 焙馅料、方便烘焙馅料奶油、饼干馅料、现成的烘焙馅料、减少热量型馅料、成人营养饮料、 酸化豆浆/果汁饮料、无菌的/蒸馏的巧克力饮料、酒吧混合饮料、饮料粉、钙加强型豆浆/ 纯净水和巧克力奶、钙加强型咖啡饮料。
[0466] 本发明所述组合物可进一步用作食品中的成分，例如美国干酪沙司、适于搓碎和 切碎奶酪的抗结剂、碎屑浇汁、奶油干酪、干混和搅拌浇头脱脂酸奶油，冷冻的/融化的 牛奶鲜奶油、冷冻的/融化的稳定鲜镶边、低脂和清淡的天然切达干酪、低脂的瑞士风味酸 奶、充气冷冻甜品和新奇棒、硬填料冰激凌、标签友好的、改良的经济和特许的硬填料冰激 凌、低脂冰激凌：冷冻奶油状、烤肉调味酱、干酪浇头调味料、村舍奶酪汁、干混和Alfredo 沙司、混和奶酪沙司、干混和番茄沙司及其它。
[0467] 对于某些方面，优选所述食品是饮料。
[0468] 对于某些方面，优选所述食品是烘焙产品-诸如面包、丹麦酥皮饼、饼干或曲奇 饼。
[0469] 本发明还提供了制备食物或食物成分的方法，所述方法包含根据本发明方法生产 的木聚糖酶或携带另外的食物成分的本发明所述组合物。用于制备食物或食物成分的方法 也是本发明的又一方面。
[0470] 在广义上，本发明之具木聚糖酶活性的多肽可用于溶解和/或降解包含阿拉伯糖 基木聚糖的不溶植物细胞壁物质，改变例如降低含植物细胞壁物质之溶液或体系中由于半 纤维素或阿拉伯糖基木聚糖存在造成的粘性。通常所说的植物细胞壁物质会包含一种或多 种木聚糖酶抑制剂。
[0471] 明确的说，本发明之具木聚糖酶活性的多肽可用于加工植物材料来用作食品，诸 如动物饲料、用于淀粉生产、用于食物烘焙、用于以纤维素材料生产生物乙醇以及用于加工 木楽以造纸。
[0472] 本发明之具木聚糖酶活性的多肽可用于加工植物材料诸如用于包括动物饲料在 内的食品中的谷类。用于此处时，术语"谷类"意指用于食品的任何种类谷物和/或产生此 谷物的任何草，诸如但不局限于以下任一种：小麦、去壳小麦、大麦、玉米、高粱、黑麦、燕麦、 黑小麦和稻或它们的组合。在某一优选的实施方案中，所述谷类是小麦。
[0473] 通过使木聚糖接触本发明之具木聚糖酶活性的多肽来改良食物和/或饲料补充 物中的木聚糖。
[0474] 用于此处时，术语"接触"包括但不局限于用本发明之具木聚糖酶活性的多肽喷 洒、涂覆、灌注或分层覆盖所述食物和/或饲料补充物。
[0475] 在某一实施方案中，可通过将具木聚糖酶活性的多肽直接与食物和/或饲料补充 物混合来制备本发明之食物和/或饲料补充物。举例而言，可用具木聚糖酶活性的多肽接 触（例如通过喷洒）到以谷类为基础的食物和/或饲料补充物诸如去壳小麦、玉米或豆粉 上。
[0476] 还可能将具木聚糖酶活性的多肽掺入第二种（以及不同的）食物和/或饲料或饮 用水中，然后将其加入本发明的食物和/或饲料补充物中。因此，不是必须将本发明所述之 具木聚糖酶活性的多肽掺入以谷类为基础的食物和/或饲料补充物本身中，尽管这样的掺 入形成了本发明一个特别优选的方面。
[0477] 在本发明的某一实施方案中，可将食物和/或饲料补充物与其它的食物和/或饲 料组分联合生产以谷类为基础的食物和/或饲料。所述的其它食物和/或饲料组分可包括 一种或多种其它（优选热稳定的）酶补充物、维生素食物和/或饲料补充物、矿物食物和/ 或饲料补充物和氨基酸食物和/或饲料补充物。然后可将由此产生的可能包含数种不同类 型化合物的（组合）食物和/或饲料补充物以适当的量与其它食物和/或饲料组分诸如谷 类和蛋白质补充物混和从而构成人的食物和/或动物的饲料。
[0478] 在某一优选的实施方案中，可通过将具适当活性的不同酶混和产生酶混合物来制 备本发明的食物和/或饲料补充物。举例而言，可使由例如去壳小麦或玉米形成的以谷类 为基础的食物和/或饲料补充物同时或顺序接触（例如通过喷洒）木聚糖酶和具适当活 性的其它酶。这些酶可包括但不局限于以下任何一种或多种：淀粉酶、葡糖淀粉酶、甘露聚 糖酶、半乳糖苷酶、植酸酶、脂肪酶、磷脂酶、半乳糖脂酶、葡聚糖酶、阿拉伯糖呋喃糖苷酶、 ferulyol酯酶、果胶酶、蛋白酶、葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶和木聚糖酶。例如具所需活性的 酶可与本发明之木聚糖酶混和，混和或者在这些酶接触以谷类为基础的食物和/或饲料补 充物之前进行，或者所述的酶可同时或顺序接触这种以谷类为基础的补充物。然后将食物 和/或饲料补充物与以谷类为基础的食物和/或饲料混和来制备最终的食物和/或饲料。 还可能将食物和/或饲料补充物配制成各个酶活性的溶液，然后在将食物和/或饲料补充 物加工成丸粒或糊状物之前将此溶液与食物和/或饲料物质混和。
[0479] 本发明提供了本发明之具木聚糖酶活性的多肽在食品制备工艺中的用途。本发明 所述之典型的烘焙产品包括面包-诸如烤过的食物、卷状食物、小圆面包、比萨饼底等-椒 盐卷饼、玉米粉圆饼、蛋糕、饼干、曲奇饼、薄脆饼干等。食品诸如烘焙产品的制备是本领域 众所周知的。例如生面团制造参阅实施例4。利用本发明之具木聚糖酶活性的多肽来改变 烘焙食物的性能参阅实施例4。
[0480] 本发明之具木聚糖酶活性的多肽还可用于从来自谷类和块茎诸如马铃薯的植物 材料生产淀粉中。
[0481] 本发明之具木聚糖酶活性的多肽还可例如在造纸中用于加工木质纸浆。
[0482] 加工纤维素材料用于生物乙醇生产
[0483] 本发明之具木聚糖酶活性的多肽还可用于水解纤维素植物材料用于生产可发酵 成生物乙醇的糖。
[0484] 在某些具体的实施方案中，本发明所述具木聚糖酶活性的多肽在生面团加工温度 诸如大约20至大约40°C的范围内具有最佳木聚糖酶活性。在某些实施方案中，本发明所述 具木聚糖酶活性的多肽在食物烘焙过程中被灭活。
[0485] 在某些替代的实施方案中，本发明所述具木聚糖酶活性的多肽与相应的野生型酶 相比具有提高的热稳定性和/或温度最适值，以便在热处理之后保持活性。这两种特性均 是本领域技术人员所已知的。 实施例
[0486] 实施例1-木聚糖酶的定位诱变和表达
[0487] 利用构建体获得枯草芽孢杆菌木聚糖酶的特异突变体，所述构建体包含来自 pET24a 的核糖体结合位点（ctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacat)，并且与不 带信号序列（atggctagcacagactactggcaa--------tggtaa)之野生型木聚糖酶基因融合， 将其转移至载体pCRBlunt (InVitrogen, Carlsbad, CA, USA)。这导致了在用构建好的载体 转化后木聚糖酶在T0P10细胞（InVitrogen)中组成型表达，条件是所述基因的方向是〃 顺时针〃方向。然后依照制造商的流程使用〃QuickChange〃诱变试剂盒（Stratagene, La Jolla，CA, USA)获得该基因内的定位突变。突变体通过测序来验证。通过将已转化的T0P10 细胞以1升的规模进行培养来获得足够产量的已验证的突变体。
[0488] 实施例2-木聚糖酶突变体的麸皮溶解研究
[0489] 由于小麦麸皮用于商业应用中，所以我们利用小麦麸皮作为底物来评估木聚糖酶 变体的比活性。
[0490] 麸皮底物：
[0491] 举例而言，麸皮可以是通过实验室规模的Chopin⑶Auto Mill (Chopin Technologies, France)利用供应商所提供的的设置和条件将小麦碾磨成小麦面粉和麸皮 而获自干磨小麦的小麦麸皮。所获得的麸皮组分可在麸皮溶解试验中用作底物。在此实施 例中将小麦用作谷物来源。
[0492] 麸皮溶解试验：
[0493] 将（0. IM)-磷酸氢二钠（0. 2M)缓冲液，pH 5. 0中的小麦麸皮悬浮液配制成浓度 1，33%麸皮（w/w)。从此悬浮液中，将750ii 1等分试样边搅拌边转移入eppendorph管中。 将每个底物管在40°C预热5分钟。向其中加入250 ill酶溶液，使底物终浓度为1 %。从每 一种木聚糖酶制备三个稀释液（一式两份），对每个测定时间（〇, 30, 60和240分钟）采用 逐步升高的酶浓度（〇, 33 ;1，0和3, 0 ii g木聚糖酶/克麸皮）。使用木聚糖酶热变性溶液 作为空白。在给定的时间通过将管子转移至设置为95°C的孵育器上终止反应。热变性样品 保存于4°C直至所有的酶反应终止。当所有的酶反应终止时，将Eppendorph管离心以获取 清澈的上清液。酶溶解麸皮的能力以OD 41tl的增加表示，这是通过用PAHBAH试剂测定还原 性端基的增加而确定的（Lever, 1972)。
[0494] 简而言之，还原性端基与PAHBAH反应，形成有色反应产物，它可在OD41tl进行定量。
[0495] 以上麸皮溶解试验对于对麸皮底物中残余淀粉有活性的酶的附带活性敏感。
[0496] 枯草芽孢杆菌木聚糖酶纯化流程：
[0497] 通过离心（20分钟，3500x g，20°C )收获已表达木聚糖酶的大肠杆菌T0P10细胞 并重悬于 50mM Tris, 2mM EDTA, pH 7. 4 中。加入 lmg/ml 溶菌酶（ICN Biomedicals, Costa Mesa，CA, US，cat. No. 100831)打开细胞，在环境温度将浆状液体搅拌2小时，冻融后超声处 理。用IM HCl将pH调到4. 0,随后进行离心（20分钟，3500x g，20°C )。用以50mM乙酸钠 pH 4. 5平衡和洗脱的一次性F1D-IO脱盐柱（Amersham Bioscience, Sweden)将包含木聚糖 酶的上清液进行脱盐。将脱盐后的样品加到用50mM乙酸钠（pH 4. 5)预平衡的IOml SOURCE 15S柱（Amersham Bioscience, Sweden)上。然后用平衡缓冲液清洗柱子并用线性NaCl梯 度（50mM乙酸钠，0-0. 35M NaCl，pH 4. 5)进行洗脱。合并含木聚糖酶活性的组分并用于进 一步的分析。
[0498] 可调整相似的流程使其适于具有显著不同于枯草芽孢杆菌XynA之pi的非枯草芽 孢杆菌XynA来源木聚糖酶变体。
[0499] 表1.木聚糖酶麸皮溶解活性，表示为最大光密度、木聚糖酶突变体的斜率、与木 聚糖酶BSl (如SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌酶）和木聚糖酶BS3 (如SEQ ID No. 23 所示之枯草芽孢杆菌变体）相比的相对光密度和斜率
[0500]
【权利要求】
1. 具有木聚糖酶活性并包含以下特性之氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID No. 1具有至少88%的同一性或者与选自SEQ ID No. 2-22的氨基酸序列具有至少75%的同 一性，并且该多肽在第110位具有氨基酸修饰，其中所述第110位通过序列比对确定为相应 于SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌木聚糖酶序列第110位的位置。
2. 权利要求1所述的多肽，其具有木聚糖酶活性并且包含与SEQ ID No. 1具至少88% 同一性的氨基酸序列，并且该多肽在第110位具有氨基酸修饰，其中所述第110位通过序列 比对确定为相应于SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌木聚糖酶序列第110位的位置。
3. 权利要求2所述的多肽，其中所述多肽与SEQ ID No. 1具有至少95%的同一性。
4. 权利要求1所述的多肽，其中所述多肽与选自SEQ ID No. 2-22之中的、与其具有最 高同一性百分比的序列具有至少76, 78, 80, 85, 90, 95, 98或95%的同一性。
5. 权利要求1-4中任一项所述的多肽，其具有β -果冻卷折叠。
6. 权利要求1-5中任一项所述的多肽，其中第110位的氨基酸修饰是氨基酸取代。
7. 权利要求1-6中任一项所述的多肽，其中第110位的氨基酸修饰是替代成选自以下 的任一不同的氨基酸残基：丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷 氨酰胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸， 丝氨酸，色氨酸，酪氨酸和缬氨酸。
8. 权利要求1-7中任一项所述的多肽，其中第110位的氨基酸修饰是替代成选自以下 的任一个不同的氨基酸残基：谷氨酸，色氨酸，丙氨酸和半胱氨酸。
9. 权利要求8所述的多肽，其中第110位的氨基酸修饰是替代成丙氨酸。
10. 权利要求1-9中任一项所述的多肽，包含以下任何一个或多个氨基酸位置处的一 个或多个修饰：11，12, 13, 34, 54, 77, 81，99, 104, 113, 114, 118, 122, 141，154, 159, 162, 164， 166和175,所述位置被确定为SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌氨基酸序列的相应位置。
11. 权利要求1-10中任一项所述的多肽，包含选自以下的一个或多个氨基酸取代：11F ,12F, 122D, 113A, 13Y, 54Q, 54W, 113D, 141Q, 175L, 122F, 34K, 99Y, 104W, 154R, 159D, 175K, 81 I，166F, 162E, 162D, 164F, 114D, 114Y, 114F, 118V, 175K, 77L, 77M, 77S, 77V 和 77Y,所述位置 被确定为SEQ ID No. 1所示之枯草芽孢杆菌氨基酸序列的相应位置。
12. 制备权利要求1-11中任一项所述多肽的方法，所述方法包括表达编码所述多肽的 核苷酸序列；以及任选地在表达后分离和/或纯化该多肽。
13. 编码权利要求1 一 11中任一项所述多肽的核苷酸序列。
14. 一种组合物，其中包含权利要求1 一 11中任一项所述的多肽或依照权利要求12的 方法所制备的多肽或权利要求13所述的核苷酸序列混合非毒性组分。
15. 权利要求1 一 11中任一项所述的多肽或依照权利要求12的方法所制备的多肽或 权利要求13所述的核苷酸序列混合非毒性组分或者权利要求14所述组合物在修饰植物材 料的方法中的用途。
【文档编号】C12N15/56GK104293747SQ201410515266
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2009年12月23日 优先权日:2008年12月23日
【发明者】O·斯本森, J·F·索任森 申请人:杜邦营养生物科学有限公司