具有叶绿素酶活性的多肽和对其进行编码的多核苷酸的制作方法
【专利说明】具有叶绿素酶活性的多肽和对其进行编码的多核苷酸
[0001] 对序列表的引用
[0002] 本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
[0003] 发明背景 发明领域
[0004] 本发明涉及具有叶绿素酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸的用途。本发明 还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞连同产生这些多肽的方法。本 发明具体涉及具有叶绿素酶活性的多肽在食品应用和洗涤剂中的用途。
[0005] 相关技术说明
[0006] 众所周知植物中叶绿素酶具有酶活性，并且多种植物叶绿素酶描述于US 2005/0081263(杜邦公司（DuPont))中。叶绿素酶具有酯酶活性，通过切割酯键释放叶 绿素中的植醇侧链，以形成脱植基叶绿素和游离的植醇。叶绿素是植物中发现的一种绿色 色素并且因此源自植物的许多产物包含叶绿素。在许多植物来源的食物产品，例如植物油 中，通常不希望叶绿素的存在，因为其除了使油着色之外，还可引起氧化，导致油变质。植 物叶绿素酶已经用于，例如，降解植物油中的叶绿素。通过添加叶绿素酶升级植物油已经 显示有效于减少植物油中的叶绿素，如在WO2011/110967(丹尼斯克公司（DaniscoA/S)) 中描述的。含叶绿素的食物、饲料或植物油的酶加工描述于WO2006/009676(戴维斯公司 (DiversaCorporation))中。
[0007] 洗涤剂通常包括多种活性成分，例如酶、表面活性剂、助洗剂、以及漂白系统的一 个复杂组合。尽管当前洗涤剂具有复杂度，许多污物难以完全去除。特别顽固的污物群是 包含叶绿素的污物，例如，草渍。草渍可以是蛋白质、多种有机物质、叶绿素以及其他相对稳 定的着色化合物（例如，叶黄素和类萌萝卜素）的一种混合物。叶绿素酶已经被用于洗涤 剂中，例如，在WO2009/141073(科莱恩公司（ClariantInt.Ltd./C-LECTA))中描述了包 含叶绿素酶的一种清洁剂。叶绿素酶优选地与脂肪酶，特别是半乳糖脂酶组合使用。
[0008] 最常用的叶绿素酶源于植物，使植物以工业相关量表达是具有挑战性的。本发明 提供了源自Nakamurellamultipartita的一种叶绿素酶，该叶绿素酶与植物叶绿素酶具有 极低同源性。该叶绿素酶用于食品和洗涤剂应用。
[0009] 发明概述
[0010] 本发明涉及具有叶绿素酶活性的多肽在食品（例如用于处理植物油）和洗涤剂中 的用途。
[0011] 叶绿素酶已经在洗涤剂组合物以及食物产品（例如，植物油）加工中使用。本发 明的叶绿素酶对于这些目的也是有用的。
[0012] 本发明的第一方面涉及一种组合物，该组合物包括一种多肽，该多肽与SEQID N0:2具有至少60%-致性，其中该多肽具有叶绿素酶活性。另一个方面涉及一种多肽的用 途，该多肽与SEQIDN0:2具有至少60%-致性，其中该多肽在清洁过程中具有叶绿素酶活 性。本发明的另一个方面涉及一种进行清洁的方法，该方法包括使一种织物或纺织品与一 种洗涤剂组合物或添加剂接触，该涤剂组合物或添加剂包括与SEQIDNO: 2具有至少60% 一致性的一种叶绿素酶。
[0013] 本发明的一个具体方面涉及一种清洁组合物，该清洁组合物包括具有叶绿素酶活 性的一种分离的多肽，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
[0014] (a) -种多肽，该多肽与SEQIDNO:2的多肽具有至少60%序列一致性；
[0015] (b) -种多肽，该多肽由在中严谨度条件、或中-高严谨度条件下与以下各项杂交 的多核苷酸编码
[0016] (i)SEQIDNO: 1的成熟多肽编码序列，和/或
[0017] (ii)⑴的全长互补链；
[0018] (c) -种多肽，该多肽由与SEQIDNO: 1的成熟多肽编码序列具有至少60%序列 一致性的多核苷酸编码；
[0019] (d)SEQIDNO: 2的多肽的一种变体，该变体在一个或多个（例如若干个）位置处 包含取代、缺失、和/或插入；以及
[0020] (e) (a)、（b)、（c)、或（d)的多肽的一个片段，该片段具有叶绿素酶活性。
[0021] 本发明的另一个方面涉及具有叶绿素酶活性的一种分离的多肽在一种清洁过程 中的用途，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
[0022] (a) -种多肽，该多肽与SEQIDNO:2的多肽具有至少60%序列一致性；
[0023] (b) -种多肽，该多肽由在中严谨度条件、或中-高严谨度条件下与以下各项杂交 的多核苷酸编码
[0024] ⑴SEQIDNO: 1的成熟多肽编码序列，和/或
[0025] (ii)⑴的全长互补链；
[0026] (c) 一种多肽，该多肽由与SEQIDNO: 1的成熟多肽编码序列具有至少60%序列 一致性的多核苷酸编码；
[0027] (d)SEQIDNO: 2的多肽的一种变体，该变体在一个或多个（例如若干个）位置处 包含取代、缺失、和/或插入；以及
[0028] (e) (a)、（b)、（c)、或（d)的多肽的一个片段，该片段具有叶绿素酶活性。
[0029] 本发明的一个方面涉及一种植物油，该植物油包括具有叶绿素酶活性的一种分离 的多肽，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
[0030] (a) -种多肽，该多肽与SEQIDNO:2的多肽具有至少60%序列一致性；
[0031] (b) -种多肽，该多肽由在中严谨度条件、或中-高严谨度条件下与以下各项杂交 的多核苷酸编码
[0032] (i)SEQIDNO: 1的成熟多肽编码序列，和/或
[0033] (ii)⑴的全长互补链；
[0034] (c) 一种多肽，该多肽由与SEQIDNO: 1的成熟多肽编码序列具有至少60%序列 一致性的多核苷酸编码；
[0035] (d)SEQIDNO: 2的多肽的一种变体，该变体在一个或多个（例如若干个）位置处 包含取代、缺失、和/或插入；以及
[0036] (e) (a)、（b)、（c)、或（d)的多肽的一个片段，该片段具有叶绿素酶活性。
[0037] 本发明的另一个方面涉及具有叶绿素酶活性的一种分离的多肽在一种植物油的 加工中的用途，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
[0038] (a) -种多肽，该多肽与SEQIDNO:2的多肽具有至少60%序列一致性；
[0039] (b) -种多肽，该多肽由在中严谨度条件、或中-高严谨度条件下与以下各项杂交 的多核苷酸编码
[0040] (i)SEQIDNO: 1的成熟多肽编码序列，和/或
[0041] (ii)⑴的全长互补链；
[0042] (c) 一种多肽，该多肽由与SEQIDNO: 1的成熟多肽编码序列具有至少60%序列 一致性的多核苷酸编码；
[0043] (d)SEQIDNO: 2的多肽的一种变体，该变体在一个或多个（例如若干个）位置处 包含取代、缺失、和/或插入；以及
[0044] (e) (a)、（b)、（c)、或（d)的多肽的一个片段，该片段具有叶绿素酶活性，。
[0045] 本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，包含这些多核苷酸的核酸构 建体、重组表达载体、重组宿主细胞，并且涉及重组地产生这些多肽的方法。
[0046] 本发明还涉及用于制备供食物产品（例如植物油）中使用的组合物的方法、用于 处理一种或多种包括本发明叶绿素酶的植物油的方法。
[0047] 此外，本发明还涉及包含本发明叶绿素酶的洗涤剂组合物，以及使用本发明的叶 绿素酶进行洗衣和或硬表面清洁的方法。
[0048] 本发明还涉及一种用于处理植物油的方法，该方法包括以下步骤：使该油和与SEQ IDNO2具有至少60%-致性的多肽接触，其中所述多肽能够水解叶绿素或叶绿素衍生物， 并且涉及通过根据本发明的方法可获得的粗制或精制的植物油。
[0049] 定义
[0050] 具有叶绿素酶活性的多肽有时还被指定为果皮叶绿素酶（chlase)或叶绿素脱植 基叶绿素水解酶（chlorophyllchlorophylIidohydrolase) 〇
[0051] 在此将术语"叶绿素酶"定义为具有叶绿素酶活性或酯酶活性的一种酶，在当前背 景下，其被理解为通过切割酯键释放叶绿素中的植醇侧链以形成脱植基叶绿素和游离植醇 的一种酶或通过切割酯键释放叶绿素中的植醇侧链以形成脱镁叶绿酸和游离植醇的一种 酯酶。术语"叶绿素酶"包括属于EC3. 1.1. 14酶组的任何酶。EC编号参考加利福尼亚州 (California)的圣迭戈（SanDiego)的NC-IUBMB学术出版社（AcademicPress)的 1992 年酶命名法，分别包括出版于1994,欧洲生物化学杂志（Eur.J.Biochem. )223:1-5 ;1995， 欧洲生物化学杂志232:1-6 ;1996,欧洲生物化学杂志237:1-5 ;1997,欧洲生物化学杂志 250:1-6 ;以及1999,欧洲生物化学杂志264:610-650的增刊1-5。命名会定期得以增补和 更新；参见例如万维网（WWW)于http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html〇 在本发明的背景下应理解本发明的叶绿素酶是具有SEQIDNO2的多肽或与其具有至少 60%-致性的一种多肽。由此"具有叶绿素酶活性的多肽"是一种叶绿素酶。
[0052] 本发明提供了具有叶绿素酶活性的多肽在食物产品（例如植物油）和洗涤剂组合 物（例如洗衣或餐具洗涤组合物）中的用途。本发明还提供了编码这些多肽的多核苷酸。 使用在此实例1中所述来测量叶绿素酶活性。
[0053] 本发明的叶绿素酶具有SEQIDNO: 2的成熟多肽的至少20%，例如至少40%、至 少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、以及至少100 %的叶绿素酶 活性。
[0054] 如在此使用的术语"分离的多肽"是指从来源分离的多肽。在一个方面中，该变 体或多肽是至少20%纯的，更优选至少40%纯的，更优选至少60%纯的，甚至更优选至少 80%纯的，最优选至少90%纯的并且甚至最优选至少95%纯的，如通过SDS-PAGE所确定。
[0055]术语"基本上纯的多肽"在此指一种包含按重量计至多10%，优选至多8 %，更优 选至多6 %，更优选至多5 %，更优选至多4 %，更优选至多3 %，甚至更优选至多2 %，最优选 至多1 %，并且甚至最优选至多0. 5 %的该多肽和与其天然地或重组地相关的其他多肽材 料的多肽制剂。因此，优选的是该基本上纯的多肽按存在于该制剂中的所有多肽材料的重 量计是至少92 %纯的，优选至少94 %纯的，更优选至少95 %纯的，更优选至少96 %纯的，更 优选至少97%纯的，更优选至少98%纯的，甚至更优选至少99%纯的，最优选至少99. 5% 纯的，并且甚至最优选100%纯的。本发明的多肽优选处于基本上纯的形式。其可通过，例 如，以公知的重组方法或以经典的纯化方法制备该变体或多肽而达成。
[0056] 术语"成熟多肽编码序列"意指编码具有叶绿素酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在 一个方面，该成熟多肽是具有SEQIDNO2或SEQIDNO4的多肽。
[0057] 两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数"序列一致性"描 述。出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（尼德曼和翁施， 1970,分子生物学杂志（J.Mol.Biol. )48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的一致性 程度，该算法如EMBOSS软件包（EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件（TheEuropean MolecularBiologyOpenSoftwareSuite)，赖斯（Rice)等人，2000,遗传学趋势（Trends inGenetics) 16:276-277 :http://emboss,org)(优选 3. 0? 0 版或更新版本）的尼德尔 (Needle)程序所实施的。使用版本6. 1.0。所使用的这些任选参数是空位开放罚分10、空 位延伸罚分0. 5,及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩阵。尼德尔标注的"最长 的一致性"的输出（使用-非简化选项获得）被用作百分比一致性，并且如下计算：
[0058] (一致的残基X100V(比对长度-比对中的空位总数）
[0059] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件， 赖斯等人，2000,见上文：http://emboss,orfi)(优选3. 0. 0版或更新版本）的尼德尔程序 中所实施的尼德尔曼-翁施算法（尼德尔曼和翁施，1970,见上文）来确定两个脱氧核糖核 苷酸序列之间的一致性程度。使用版本6. 1. 0。所使用的这些任选参数是空位开放罚分10、 空位延伸罚分0. 5,及EDNAFULL(NCBINUC4. 4的EMBOSS版本）取代矩阵。尼德尔标注的 "最长的一致性"的输出（使用-非简化选项获得）被用作百分比一致性，并且如下计算：
[0060] ( 一致的脱氧核糖核酸核苷酸XlOOV(比对长度-比对中的空位总数）。
[0061] 术语"片段"意指使一个或多个（若干个）氨基酸从成熟多肽的氨基和/或羧基 末端缺失的多肽；其中该片段具有叶绿素酶活性。
[0062] 术语"多肽的功能片段"或"其功能片段"用来描述衍生自更长的多肽（例如，成 熟多肽）的多肽，以及已经在N-末端区或C-末端区或两个区域中截短以产生亲本多肽的 片段的多肽。为了成为功能多肽，该片段必须保持全长/成熟多肽的至少20%，优选至少 40 %，更优选至少50 %，更优选至少60 %，更优选至少70 %，更优选至少80 %，甚至更优选 至少90%，最优选至少95%，并且甚至最优选至少100 %的叶绿素酶活性。
[0063] 术语"子序列"意指使一个或多个（若干个）核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端 和/或3'端缺失的多核苷酸，其中该子序列编码具有叶绿素酶活性的一个片段。
[0064] 术语"等位基因变体"意指占用同一染色体位点的一种基因的两个或更多个替代 形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突 变可以是沉默的（在所编码的多肽中没有改变）或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。 多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
[0065] 术语"变体"意指在一个或多个（若干个）位置包含改变（即，一个或多个（若干 个）氨基酸残基取代、插入和/或缺失）的具有叶绿素酶活性的多肽。取代意指将占据某 个位置的氨基酸替换为不同的氨基酸；缺失意指去除占据某个位置的氨基酸；并且插入意 指邻近占据某个位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。
[0066] 术语"清洁组合物"和"清洁配制品"是指用于从有待清洁的物品上除去不希望的 化合物的组合物，这些物品是例如织物、地毯、餐具（包括玻璃器皿）、接触镜、硬表面（例如 瓷砖、锌（zincs)、地板和桌面）、头发（香波）、皮肤（肥皂和面霜）、牙齿（漱口剂、牙膏） 等。这些术语涵盖针对具体类型的所希望的清洁组合物和产品的形式（例如，液体、凝胶、 颗粒或喷雾组合物）所选的任何材料/化合物，只要该组合物与用于该组合物中的叶绿素 酶以及其他一种或多种酶可相容即可。通过考虑有待清洁的表面、物品或织物，以及针对使 用过程中的清洁条件的组合物的所希望的形式而容易地具体选择清洁组合物材料。这些术 语进一步是指适于清洁、漂白、消毒、和/或灭菌任何物品和/或表面的任何组合物。其意 图是，这些术语包括但不限于洗涤剂组合物（例如，液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物 洗涤剂；硬表面清洁配制品，如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面以及窗户；地毯清洁剂；炉 灶清洁剂；织物清新剂；织物柔软剂；和纺织品和衣物预去污剂，以及餐具洗涤剂）。
[0067] 除非另有说明，术语"洗涤剂组合物"包括颗粒状或粉状的全效或重垢清洗剂，尤 其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊状的全效清洗剂，尤其是所谓的重垢液（HDL)类型；液体 细薄织物洗涤剂；手洗餐具清洗剂或轻垢餐具清洗剂，尤其是高泡沫型的那些；洗碗机洗 碗剂，包括用于居家及机构使用的多种片型、颗粒型、液体型以及冲洗助剂型；液体清洁和 消毒剂，包括抗菌洗手液类型、清洁棒、漱口液、义齿清洁剂、汽车或地毯清洁剂、浴室清洁 剂；洗发香波和护发素；沐浴露、沐浴露；金属清洗剂；以及清洁助剂，如漂白剂添加剂和 "去污棒"或预处理类型。
[0068] 就预期用于脏物体和纺织品清洁的洗涤介质中的混合物而言，使用术语"洗涤剂 组合物"和"洗涤剂配制品"。在某些实施例中，就洗涤织物和/或衣服而言，使用该术语 (例如，"衣物洗涤剂"）。在替代的实施例中，该术语是指例如用于清洁餐具、刀具等等的那 些的其他洗涤剂（例如"餐具清洗洗涤剂"）。它并不意图使本发明限于任何特定的洗涤剂 配制品或组合物。其意图是，除了根据本发明的叶绿素酶以外，该术语涵盖了包含以下各项 的洗绦剂：例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂（chelator)或螯合试剂（chelatingagent)、 漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光增 亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防腐蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、一种或多 种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂、以及增溶剂。
[0069] 术语"织物"涵盖任何纺织材料。因此，其意图是，该术语涵盖衣服，连同织物、纱 线、纤维、非织造材料、天然材料、合成材料以及任何其他纺织材料。
[0070] 术语"纺织