经扩增的拷贝的细 胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
[0211] 用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普 通技术人员熟知的（参见，例如，萨姆布鲁克（Sambrook)等人，1989,见上文）。
[0212] 宿主细胞
[0213] 本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括本发明的多核苷酸，该多核 苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产 生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持 作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语"宿主细胞"涵盖 由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大 程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
[0214] 该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真 核细胞。
[0215] 原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括 但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆 菌属、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、 大肠杆菌、黄杆菌菌、梭杆菌菌、螺旋杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌 属、以及脲原体属。
[0216] 细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉 芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿 烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆 菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。
[0217] 细菌宿主细胞还可以是任何链球菌细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球 菌、乳房链球菌、以及马链球菌兽瘟亚种细胞。
[0218] 细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、阿维链 霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌以及变铅青链霉菌细胞。
[0219] 将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化（参见例如，张 (Chang)和科恩（Cohen)，1979,分子遗传学与基因组学（Mol.Gen.Genet.) 168:111-115)、 感受态细胞转化（参见，例如，杨格（Young)和斯皮宰曾（Spizizen)，1961，细菌学 杂志（J.Bacteriol.) 81:823-829 ;或杜拜努（Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森 (Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志（J.Mol.Biol. )56:209-221)、电穿孔（参见， 例如，茂川（Shigekawa)和道尔（Dower)，1988,生物技术（Biotechniques)6:742_751)、或 者接合（参见，例如克勒（Koehler)和索恩（Thorne)，1987,细菌学杂志169:5271-5278)。 将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化（参见例如，哈纳汗 (Hanahan)，1983,分子生物学杂志（J.Mol.Biol.) 166:557-580)或电穿孔（参见例如， 道尔（Dower)等人，1988,核酸研宄（NucleicAcidsRes.) 16:6127-6145)。将DNA引入 链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔（参见例如，贡（Gong)等人， 2004,叶线形微生物学（FoliaMicrobiol.)(Praha(布拉格））49:399-405)、接合（参 见例如，马佐迪耶（Mazodier)等人，1989,细菌学杂志171:3583-3585)、或转导（参见 例如，伯克（Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊98:6289-6294)。将DNA引入假单 孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔（参见例如，蔡（Choi)等人，2006,微生物学方 法杂志（J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合（参见例如，皮内多（Pinedo)和斯 梅茨（Smets)，2005,应用与环境微生物学（Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将 DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态（参见例如，佩里（Perry)和藏 满（Kuramitsu)，1981，感染与免疫（Infect.Immun.)32:1295_1297)、原生质体转化（参 见，例如，凯特（Catt)和乔力克（Jollick)，1991，微生物学（Microbios)68:189-207)、电 穿孔（参见，例如，巴克利（Buckley)等人，1999,应用与环境微生物学（Appl.Environ. Microbiol. )65:3800-3804)、或者接合（参见，例如，克莱威尔（Clewell)，1981，微生物学 评论（Microbiol.Rev. )45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细 胞中的任何方法。
[0220] 宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
[0221] 宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的"真菌"包括子囊菌门（Ascomycota)、 担子菌门（Basidiomycota)、壶菌门（Chytridiomycota)、以及接合菌门（Zygomycota)、连 同卵菌门（Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌（如由霍克斯沃思（Hawksworth)等人在安 斯沃思和拜斯比真菌词典（AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi)，第 8 版， 1995,国际应用生物科学中心（CABInternational)，大学出版社（UniversityPress)，英 国剑桥（Cambridge，UK)中进行定义的）。
[0222] 该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的"酵母"包括产子囊酵母（内孢霉 目）、产担子酵母和属于半知菌类（芽孢纲）的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，因 此出于本发明的目的，酵母应如酵母的生物学和活性（BiologyandActivitiesofYeast) (斯金纳（Skinner)、帕斯莫尔（Passmore)、以及达文波特（Davenport)编辑，应用细菌学学 会讨论会系列号 9 (Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo. 9)，1980)中所描述来定义。
[0223] 酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母 属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母（KluyveromycesIactis)、卡尔酵 母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母 (YarrowiaIipolytica)细胞。
[0224] 真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。"丝状真菌"包括真菌门（Eumycota)和卵菌 门的亚门（如由霍克斯沃思等人，1995,见上文所定义）的所有丝状形式。丝状真菌通常 的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体 壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母（如酿酒酵母）的 营养生长是通过单细胞菌体的出芽（budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。
[0225] 丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属 (Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属（Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌 科（Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌 属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属（Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属（Pleurotus)、 裂裙菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属（Trametes)、或木霉属细 胞。
[0226] 例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲 霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌（Bjerkanderaadusta)、干拟赌菌（Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟赌菌（Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟赌孑L菌（Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟赌菌（Ceriporiopsispannocinta)、环带拟赌菌（Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟赌菌(Ceriporiopsissubrufa)、虫拟赌菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狭边金孢子菌（Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金 抱子菌（ChrysosporiumIucknowense)、奠状金抱子菌（Chrysosporiummerdarium)、租 金孢子菌、女王杜香金孢子菌（Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金 抱子菌（Chrysosporiumzonatum)、灰盖鬼伞（Coprinuscinereus)、毛革盖菌（Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合 欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、 圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢 菌、产紫青霉、黄抱平革菌（Phanerochaetechrysosporium)、射脉菌（Phlebiaradiata)、 刺序侧耳（Pleurotuseryngii)、土生梭孢霉、长域毛栓菌（Trametesvillosa)、变色栓菌 (Trametesversicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
[0227] 可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法 以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP238023和 约尔顿（Yelton)等人，1984,美国科学院院刊（Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474、 以及克里斯滕森（Christensen)等人，1988,生物 / 技术（Bio/Technology)6:1419-1422 中描述。用于转化镰刀菌属物种的适合方法由马拉迪尔（Malardier)等人，1989,基因 (Gene)78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母： 贝克尔（Becker)和瓜伦特（Guarente)，在阿贝尔森（Abelson)，J.N.和西蒙（Simon)， M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法（GuidetoYeastGeneticsand MolecularBiology,MethodsinEnzymology)，第 194 卷，第 182-187 页，学术出版社有限 公司（AcademicPress,Inc.)，纽约；伊藤（Ito)等人，1983,细菌学杂志153:163 ;以及哈尼 恩（Hinnen)等人，1978,美国国家科学院院刊75:1920。
[0228] 产生方法
[0229] 本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括（a)在有益于产生该多肽的条 件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且（b)回收该多肽。在一个优选 方面中，该细胞是Nakamurella细胞。在一个更优选的方面中，该细胞是Nakamurella multipartita细胞。在一个最优选的方面中，该细胞是NakamurellamultipartitaDSM 44233。因此，本发明的一个方面涉及生产如下多肽的一种方法，该多肽与SEQIDNO:2具 有至少60 %-致性，该方法包括：
[0230](a)培养一种细胞，该细胞以其野生型形式在有益于产生该多肽的条件下产生该 多肽；以及（b)回收该多肽。
[0231] 本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括（a)在有益于产生该多肽的条件下 培养本发明的重组宿主细胞；并且（b)回收该多肽。
[0232] 因此，本发明的一个方面涉及产生如下多肽的一种方法，该多肽与SEQIDNO:2具 有至少60 %-致性，该方法包括：
[0233] (a)在有益于产生该多肽的条件下培养宿主细胞；并且
[0234] (b)回收该多肽。
[0235] 宿主细胞可以是细菌宿主细胞，例如芽胞杆菌属、链球菌属、或链霉菌属细胞。宿 主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。宿主细胞可以是真菌细 胞，该真菌细胞可以是一种酵母细胞。多种适合的宿主细胞描述于本发明的"宿主细胞"部 分中。
[0236] 细胞或宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养培 养基中培养的。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件 下，进行摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵（包括连续，分 批，分批补料，或固态发酵）来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合 营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获 得或可以根据公开的组成（例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中）制备。如果多肽 分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可 从细胞裂解液中进行回收。
[0237] 可以使用特异性针对该多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包 括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来 确定该多肽的活性。
[0238] 可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但 不限于，收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。
[0239] 可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽，这些程 序包括但不限于：色谱法（例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及 尺寸排阻色谱）、电泳程序（例如，制备型等电点聚焦）、差别溶解度（例如，硫酸铵沉淀）、 SDS-PAGE、或萃取（参见例如，蛋白质纯化（ProteinPurification)，詹森（Janson)和赖登 (Ryden)编辑，VCH出版社（VCHPublishers)，纽约，1989)。
[0240] 在一个替代性方面中，没有回收该多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞 用作该多肽的来源。
[0241] 组合物
[0242] 本发明还涉及包含本发明的一种叶绿素酶的组合物。该组合物可以包括本发明 的叶绿素酶作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，该组合物可以包含多种酶活 性，如氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环 糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、e-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、 a-葡糖苷酶、e-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、 果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、蛋白酶、核糖核 酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。可以例如通过微生物（如细菌或真菌）或通过植物或通 过动物产生另外的一种或多种酶。这些组合物可根据本领域已知的方法制备并且可以是液 体或干燥组合物的形式。例如，组合物可以处于颗粒或微颗粒的形式。该叶绿素酶可以根 据本领域中已知的方法稳定化。
[0243] 洗涤剂组合物
[0244] 在一个实施例中，本发明针对洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含结合一种或多 种额外的清洁组合物组分的本发明的叶绿素酶。另外的组分的选择在普通技术人员技术内 并且包括常规成分，包括以下列出的示例性、非限制性组分。
[0245] 对于纺织品保养，组分的选择可以包括以下考虑：有待清洁的纺织品的类型、污物 的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制。尽管根据一种具体的功能 性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技 术人员所理解，一种组分可以包括另外的功能性。
[0246] 该洗涤剂组合物可以适合于纺织品的洗涤或适合于硬表面清洁，包括餐具清洗 (包括自动餐具清洗）。
[0247] 在本发明的一个实施例中，可以将本发明的多肽以对应于以下各项的量添加至一 种洗涤剂组合物中：每升洗涤液体〇.OOl-IOOmg的叶绿素酶，例如0.Ol-IOOmg的叶绿素酶， 优选是0. 005-50mg的叶绿素酶，更优选是0. 01-25mg的叶绿素酶，甚至更优选是0. 05-10mg 的叶绿素酶，最优选是〇. 〇5_5mg的叶绿素酶，并且甚至最优选是0.Ol-Img的叶绿素酶。
[0248] 可以使用常规稳定剂使本发明的洗涤剂组合物中的一种或多种酶稳定化，这些 稳定剂例如是多元醇（如丙二醇或甘油）、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物（例如， 芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物（如4-甲酰苯基硼酸）），并且该组合物可以如（例如） WO92/19709和WO92/19708中所述进行配制，或者可以使用如WO2005/105826和WO 2009/118375所述的肽醛或酮使根据本发明的叶绿素酶稳定化。本发明的多肽还可以结合 到W097/07202中所披露的洗涤剂配制品中，通过引用将其结合在此。
[0249] 表而活件齐I丨
[0250] 洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离 子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的，或其混合物。在一个具体实施例 中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的 混合物。这种或这些表面活性剂典型地以按重量计从约0. 1%至60%的水平存在，例如约 1 %至约40%、或约3%至约20%、或约3%至约10%。基于所希望的清洁应用来选择这种