通过等位基因替代生成fmdv抗性牲畜的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本专利申请要求2013年3月15日提交的美国专利申请号No. 13/836,860,以及 2012年7月31日提交的美国临时申请号US61/677904的优先权，两者通过引用并入本文。
技术领域
[0003]
技术领域涉及遗传修饰的动物及相关技术。
【背景技术】
[0004] 感染口蹄疫病毒（FMDV)的偶蹄类动物由于急性水疱病变得迅速丧失行为能力。 牛和猪的FMD感染引起发热，痛性起泡，跛行以及食欲丧失。如感染原的名字所暗示的，经 常会发生足部的二次感染，引起慢性跛行以及延迟愈合，类似地乳腺炎在奶牛中可为常见 的结局。该疾病的急性阶段持续大约一周后在面对上升的免疫应答时消退，其中的抗体反 应显得尤其重要，因为它从血流中高效地清除病毒。由于导致循环衰竭的心肌感染，死亡 可发生在年轻动物中。该疾病为如此的高度传染性以至于在单个动物中的感染需要对整个 牲畜群进行毁灭和掩埋。因此FMDV被认为是世界上驯养的农场动物（domesticatedfarm animals)的最重要病原体。2001年在英国FMD的爆发造成了约$40-120亿的总损失[1]， 以及十多年前美国加州大学戴维斯分校估计仅在加利福尼亚州的FMD爆发由于动物流动 和售卖上的限制，在控制花费和市场丢失上可能花费了 $60-140亿。牛奶、和其他产品以及 肉类的售卖被停止，并且在相关行业中生产者和工人们的职位会丢失或被严重缩减。其他 国家的经济影响是成比例的。
[0005] 发明概述
[0006] 本文中记载了抗FMDV的动物。该动物可通过仅最小核苷酸改变且在精确位置进 行改变而不对动物基因组进行其他改变而产生。
[0007] 本发明的一个实施方式是遗传修饰的动物，其包括对eIF4G基因的基因组修饰。 该修饰可以包括例如eIF4G基因的一个或多个碱基的插入、缺失，或者取代。eIF4G基因可 以改变为表达出相对于动物野生型eIF4G蛋白改变的eIF4G蛋白以对口蹄疫病毒酶的蛋白 酶的切割有抗性，所述蛋白酶例如下列一个或两个：口蹄疫病毒酶的前导蛋白酶（Lpro)以 及口蹄疫病毒酶的病毒编码3C蛋白酶（3Cpro)。动物可以是哺乳动物。动物可以是实验 室研宄动物（例如，实验用小鼠、大鼠、狗、或猪物种（例如小型猪））。动物还可以是牲畜 动物，例如，选自由猪、鱼、兔、牛、鸡、山羊和绵羊构成的组。在一些情况下，动物来自第一品 种，遗传修饰是动物另一个品种中发现的eIF4G基因的天然等位基因。在另一种情况下，动 物来自第一物种，遗传修饰是第二物种（人或非人动物）的另一品种中eIF4G基因的等位 基因。一般而言，等位基因不是整个基因，而是编码介导FMDV蛋白酶结合以及蛋白水解的 蛋白部分的基因。动物可以是修饰的eIF4G基因上纯合性的或杂合性的。动物可以是建立 者动物（founderanimal)或建立者动物的后代，S卩可产生动物的新品种或品系。动物可以 含有由修饰的eIF4G基因表达的eIF4G蛋白。动物可以对口蹄疫有抗性。经修饰的eIF4G 蛋白可经修饰以阻止Lpro和Cpro中一个或两个的结合。
[0008] 本发明的一个实施方式是产生遗传修饰生物体的方法，其包括体外改变原代细胞 (primarycell)或者胚胎（或在胚胎情况下在子宫中）的天然eIF4G基因，并克隆原代细 胞或将胚胎移植到母体动物中（代孕者（surrogate))，其中eIF4G基因改变为表达抵抗口 蹄疫病毒蛋白酶的蛋白质水解的eIF4G同种型（isoform)。该方法可以涉及用位点特异性 核酸酶和核酸模板转染原代细胞或胚胎，所述位点特异性核酸酶特异性切割天然eIF4G基 因中的位点，所述核酸模板至少包含eIF4G基因的一部分，其中模板提供了天然eIF4G基因 的备选等位基因，所述备选等位基因编码对口蹄疫病毒酶的蛋白酶切割有抗性的eIF4G同 种型。位点特异性核酸酶的例子是选自由锌指核酸酶（ZFN)，转录激活因子样效应物核酸酶 (transcriptionalactivator-likeeffectornuclease，TALEN)，以及成族规律间隔短回 文重复序列（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeat) (CRISPR或 有时称为CRISPR/Cas9)组成的组中的基于核酸酶的系统。
[0009] 一个实施方式是包含对eIF4G基因的基因组修饰的体外细胞。eIF4G基因可表达 相对于动物的野生型eIF4G蛋白改变的eIF4G蛋白，从而抵抗口蹄疫病毒酶的蛋白酶的切 害J。细胞可以选自由小鼠、大鼠、马、迷你猪（mini-pig)、猪、鱼、兔、牛、鸡、山羊、偶蹄类、有 蹄类动物、山羊组成的组。细胞可进一步包含修饰的eIF4G基因表达的eIF4G蛋白。
[0010] 本发明的实施方式包括分离的核酸，其编码任何eIF4G蛋白的同种型，例如对口 蹄疫病毒酶的蛋白酶裂解有抗性的eIF4G蛋白。
[0011] 本发明的实施方式包括细胞、生物体、或者动物，其包含表达eIF4G蛋白或被FMDV 蛋白酶结合的所述蛋白的一部分的外源基因。外源基因表达竞争FMDV病毒结合从而降低 天然蛋白的切割。另外，eIF4G蛋白酶抗性的外源基因的表达为感染细胞提供了持续的细 胞功能。一个实施方式是产生遗传修饰的生物体的方法，包括体外将外源eIF4G基因的表 达添加到原代细胞或者胚胎中，克隆原代细胞或将胚胎移植到母体动物中，外源eIF4G基 因表达eIF4G同种型，其抵抗由口蹄疫蛋白酶进行的蛋白质水解。一个实施方式是包含对 eIF4G基因的基因组修饰或表达外源eIF4G基因的核酸的体外细胞。
[0012] 附图简述
[0013] 图1是体内总细胞蛋白的电泳图谱的放射自显影；来自细胞的35S标记总蛋白在 底部成像为以时间计的小核糖核酸病毒（Picornaviral)感染后时间的函数；全细胞裂解 (6. 5小时后）显示出宿主蛋白关闭的时间进程以及小核糖核酸病毒（picornaviral)蛋白 的多肽合成的近完全接管（takeover)。在5小时时的显著条带是由来自多蛋白前体的Lpro 切割的病毒蛋白（凝胶顶端的深色条带）。在近凝胶底部的强条带是源自于非多聚腺苷酸 化1111?敵(11011-口〇15^(1611713七6(11111?敵）的组蛋白，因此不是6正46依赖的并对病毒蛋白酶活 性敏感。
[0014] 图2显示了改变EIF4GI基因的一部分的实验结果。猪EIF4GI的一部分的序列 显示于小图A。野生型序列在相对于Lpro切割位点（箭头）的-3和-2位具有天冬酰 胺和亮氨酸残基。在该实施例中，提供模板以指导用天冬氨酸和苯丙氨酸来取代-3位 和-2位残基，从而使修饰的EIF4GI对Lpro切割有抗性。两对TALENs(顶部）设计为剪 切野生型EIF4GI以刺激同源重组。小图B)描述了用各个TALEN对转染猪成纤维细胞的 Surveyor(Cel-I)测定法的结果。小图C)描述了确定同源重组效率的RFLP检测。该图包 括左TALENCCGTCCTTTGCCAACCTT(SEQIDN0:12)，右TALENAGCAACCGTGGGCCCCCA(SEQID N0:13)，&TALENTGGCCGACCAGCCCTT(SEQIDN0:14);STALENCCCAAGGGGTGGGCC(SEQID NO: 15) ;EIF4GI基因部分CAGACTTCACTCCGTCCTTTGCCAACCTTGGCCGACCAGCCCTTAGCAACCGTGG GCCCCCAAGGGGTGGGCC(SEQIDN0:16);以及HDRCAGACTTCACTCCGTCCTTTGCCGACTTCGGCCGAC CAGCCCTTAGCAACCGTGGGCCCCCAAGGGGTGGGCC(SEQIDN0:17)。
[0015] 详细描述
[0016] 本公开解释了如何制备抗FMDV的动物。动物被遗传修饰，使得它们的真核翻译起 始因子4G蛋白（eIF4G)抵抗FMDV蛋白酶Lpro和3Cpro中一个或两个的切割（在此统称 为FMDV蛋白酶）。它们是由FMDV生产的蛋白酶，其可以攻击eIF4G蛋白。运作的实施例包 括产生经修饰的抗FMDV蛋白酶中一种攻击的牲畜原代细胞。采用经发明人证明过的对建 立者动物（founderanimals)有效的技术，动物可以克隆自这些细胞。这种修饰可以以位 点特异性方式制造，从而天然基因的等位基因经过修饰以制备表达抗FMDV蛋白酶的eIF4G 蛋白的修饰等位基因。
[0017] FMDV抗性
[0018] FMDV属于小核糖核酸病毒家族的口蹄病毒（Aphthovirus)属，为包括脊髓灰质炎 病毒（poliovirus)、鼻病毒（rhinovirus)(普通感冒）、以及甲型肝炎的动物病毒中最小 的。存在着具有多个亚型的七种血清型[2]。与其他小核糖核酸病毒相似，FMDV基因组是 可以直接翻译（正链基因组）的约8500个核苷酸的单链RNA，其编码超过IOOkDa的单一多 蛋白。FMDVRNA的N-端区域编码木瓜蛋白酶样蛋白酶，称为Lp"°，其有两个同种型，Lab和 Lb，其中Lb是重要的产品[3]。Lpm不仅格外小而且还是格外特异性的。当Lpm序列被合成 后其首先切割FMDV多蛋白，使自身从多蛋白中释放出来。接着游离的Lpm进一步将剩余的 多蛋白剪切成单个的功能性多肽，单个的功能性多肽产生大量的子代病毒。Lpra具有几个其 他的靶位点，其中最重要的似乎为真核翻译起始因子4G(eIF4G)[4,5]，其当由Lpm进行的 切割时不能促发哺乳动物细胞的4mG-帽化的mRNA的启动。EIF4G(其有eIF4GI和eIF4GII 两种同种型）是一种集合在所有帽化且多聚腺苷酸化的mRNA的5'和3'端附着于结构的 几个eIF4RNA结合蛋白的支架蛋白。在一些小核糖核酸病毒中，如脊髓灰质炎病毒中，2APM 蛋白酶与Lpro具有等同的活性。
[0019] eIF4G的净效应是非共价键桥接末端真核mRNA