豌豆抗白粉病er1等位基因er1-7及与基因er1-7连锁的分子标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物病理学、遗传育种及分子生物学领域，具体地说，涉及豌豆抗白粉 病erl新等位基因 erl-7及与基因 erl-7连锁的分子标记。
【背景技术】
[0002] 豌豆（Pisum sativum L.)是世界上重要的豆类作物。由白粉菌（Erysiphe pisi D. C.)引起的豌豆白粉病是世界性的重要病害，该病在温带及亚热带地区普遍发生，特别是 在白天温暖、夜间寒冷的气候条件下危害严重，造成25%~50%产量损失，严重感染的豌 豆品种损失可达 80% 以上（Nisar et al.，2011;Fondevilla et al.，2012)〇
[0003] 防治豌豆白粉病最为经济、有效且环境安全的方法是种植抗病品种。目前，国外 已经鉴定了大量的抗白粉病豌豆资源，并在抗性资源中鉴定了 3个独立遗传的抗白粉病基 因，包括2个隐性基因61'1〇^1'1&11(16七31.，1948)和612(}161'；[1^3 6七31.，1969)以及1 个显性基因 Er3(Fondevilla et al.，2007)。erl基因的抗性机制是抑制病原菌对寄主表 皮细胞的侵入，表现高抗或免疫，抗性不受环境条件的影响，具有广谱、持久抗性，已在欧 洲、北美洲及澳大利亚的豌豆育种中广泛应用（Fondevilla et al.，2006)。er2的抗性机 制是在病原菌入侵通过寄主细胞的死亡而限制白粉菌的发展，只在叶片上表现抗性，且抗 性受温度、叶龄等多种因素的影响，在多数情况下表现为感病，这限制了其在育种中的应用 (Fondevilla et al.，2006)。Er3是最近在豌豆野生种P.fulvum中发现的，其应用价值有 待进一步研究（Fondevilla et al.，2007) 0
[0004] 迄今，除在豌豆资源JI 2480中鉴定豌豆抗白粉病基因 er2和在豌豆野生种 P. fulvum中鉴定Er3外，大量抗性资源筛选和遗传分析方面的研究表明，许多不同地 理起源的抗白粉病豌豆资源的抗性均由erl控制（Tiwari et al·，1997a ;Ghafoor et al.，2012 ;Liu et al.，2003 ;Vaid et al.，1997)。因此，目前生产中应用的抗白粉病豌豆 资源的抗性均由erl控制。随着豌豆分子标记的开发和遗传图谱的构建，抗病基因 erl和 er2分别被定位在豌豆遗传图谱的第6连锁群（LG VI) (Timmerman et al.，1994)和第3 连锁群（LG III) (Katoch et al.，2010)上，而基因 Er3在豌豆遗传图谱上的位置还不确定 (Fondevilla et al. , 2007)〇
[0005] 最近，Humphry等（2011)和Pavan等（2011)研究发现，豌豆抗白粉病基因 erl 是由与大麦感白粉病基因（MLO)序列同源PsMLO功能丧失而产生的。在自然条件下，豌 豆PsMLO同源序列发生碱基缺失、插入、替换等导致不同的erl等位基因产生，如Mexique 4、Stratagem、JI 210和JI 1951因突变的位置与方式不同导致不同的erl等位基因产 生，即 erl_l、erl_2、erl_3 和 erl_4(Humphry et al.，2011)。通过化学诱变剂处理豌豆 感白粉病感病品种获得了 erl另一个等位基因 erl-5 (Pereira et al.，2010 !Humphry et al. ,2011)。最近，Sun et al (2015b)在中国豌豆地方品种中鉴定了 erl新等位基因 erl-6。
[0006] 我国对豌豆抗性研究较少，目前研究主要集中在豌豆抗白粉病的资源筛选，已经 鉴定了一些抗白粉病资源。最近，王仲怡等（2013)和付海宁等（2014)在控制培养条件下， 筛选出了许多免疫资源。在这些豌豆抗病资源中鉴定了抗病erl等位基因 erl-1、erl-2、 erl-6 (Sun et al·，2015a，2015b;王仲怡等，2015)。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供豌豆抗白粉病erl新等位基因 erl-7及其编码蛋白。
[0008] 本发明的另一目的是提供与豌豆抗白粉病等位基因 erl-7连锁的分子标记。
[0009] 为了实现本发明目的，本发明提供的erl-7蛋白，其氨基酸序列如Seq ID No. 1所 示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0010] 本发明还提供编码所述蛋白的豌豆抗白粉病erl等位基因 erl-7,其cDNA序列如 Seq ID No. 2 所示。
[0011] 本发明还提供与豌豆抗白粉病等位基因 erl-7连锁的分子标记。所述分子标记包 括 Sc0PE16-1600、Sc0PD-650、c5DNAme、PSAD60 和 PSMPSA5。
[0012] 其中，用于PCR扩增分子标记Sc0PE16_1600的引物序列如Seq ID No. 3和Seq ID No. 4所示；
[0013] 用于PCR扩增分子标记ScOPD-650的引物序列如Seq ID No. 5和Seq ID No. 6所 示；
[0014] 用于PCR扩增分子标记c5DNAme的引物序列如Seq ID No. 7和Seq ID No. 8所 示；
[0015] 用于PCR扩增分子标记PSAD60的引物序列如Seq ID No. 9和Seq ID No. 10所 示；
[0016] 用于PCR扩增分子标记PSMPSA5的引物序列如Seq ID No. 11和Seq ID No. 12所 不。
[0017] PCR反应体系按10 μ 1计，包括：2XTaq PCR MasterMix 4 μ 1，上、下游引物 0.2以111〇1/1，模板0嫩20即/^1，(1(1!120补足至1(^1。
[0018] PCR 反应程序：95°C预变性 5 分钟；94°C 30 秒，51°C ~67°C 30 秒，72°C 30 秒，35 个循环；72°C 10分钟，4°C保存。
[0019] 所述分子标记 Sc0PE16-1600、Sc0PD-650、cOTNAme、PSAD60 和 PSMPSA5 的退火温 度分别为 67 °C、65 °C、58 °C、57 °C、51 °C。
[0020] 本发明进一步提供所述等位基因 erl-7在豌豆资源抗白粉病的分子育种中的应 用。
[0021] 豌豆资源G0003967对中国白粉菌分离物EPYN和EPBJ均表现免疫。为了明确 豌豆抗白粉病资源G0003967的抗病erl等位基因，培育优良的抗性品种，以达到有效利 用G0003967抗病基因的目的，本发明通过抗性遗传分析，遗传连锁作图以及erl的候选基 因 PsMLOl cDNA序列进行测定，对G0003967的抗病基因进行了鉴定，与野生型感病基因 PsMLOl cDNA序列相比，发现G0003967的PsMLOl cDNA序列开放阅读框第111~120个碱 基缺失，从而引起PsMLOl蛋白功能的变化。这种小片段缺失突变是一种新的PsMLOl变异 形式，表明G0003967所含的抗白粉病的基因是一个新的erl等位基因，命名为erl-7,该等 位基因位于豌豆遗传图谱第VI连锁群的erl基因座位上。
[0022] 本发明通过对豌豆抗白粉病资源G0003967的erl候选基因 PsMLOl cDNA序列分 析，发现了新的抗性erl等位基因 erl-7。确定了新等位基因 erl-7的cDNA序列。本发明 首次鉴定了 erl的新等位基因 erl-7,对豌豆抗白粉病育种工作具有重要意义，通过育种手 段可有效控制豌豆白粉病的发生，减轻该病害造成的经济损失，并为豌豆资源抗白粉病的 分子育种提供新的基因资源。
【附图说明】
[0023] 图1为本发明实施例1中抗病资源G0003967 (左）和感病品种坝豌6号（右）接 种豌豆白粉菌分离物EPYN 10天后的表型。
[0024] 图2为本发明实施例2中绘制的豌豆抗白粉病erl等位基因 erl-7遗传连锁图谱。
【具体实施方式】
[0025] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0026] 以下实施例中涉及的豌豆抗白粉病品种G0003967、豌豆感白粉病品种坝豌6号均 来自于中国国家作物种质库。
[0027] 实施例1豌豆抗白粉病资源G0003967的抗性遗传分析
[0028] -、植物材料及接种体
[0029] 豌豆抗白粉病品种G0003967 ;豌豆感白粉病品种坝豌6号。白粉菌（Erysiphe pisi)中国分离物EPYN。
[0030] 二、G0003967的抗性遗传分析
[0031] 以抗病品种G0003967为父本，感病品种坝豌6号（Erl)作为母本，杂交产生F1 代，F1代自交产生F 2代，F 2代自交产生102个F 3家系，对上述群体进行抗性遗传分析、抗病 基因鉴定，并以其为作图群体。匕和？2群体采用离体叶片分生孢子抖落法进行接种，待豌 豆苗第3或第4茎节叶片展开时，采取叶片进行接种，F 3群体采用植株接种法，F 3群体的 每个家系选24粒种子播种，鉴定植株对豌豆白粉菌分离物EPYN的抗感反应。接种后，放 置于18~22°C，12h光照下培养。10天后，采用0~4级的病情分级标准