中华蜜蜂种群中csd等位基因类型的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蜜蜂育种、保种技术领域，特别涉及一种中华蜜蜂种群中csd等位基因 类型的检测方法。
【背景技术】
[0002] 中华蜜蜂是我国特有的蜜蜂资源，具有抗螨能力强、嗅觉灵敏和善于采集零星蜜 粉源等特性。同其他种类的蜜蜂一样，中华蜜蜂的性别由单倍二倍体性别决定机制调控，调 控性别发育的主要基因为互补性性别决定基因 （Complementary sex determiner，csd) 〇 Csd基因包括多种类型的等位基因。Csd基因中有两个不同的等位基因时发育为二倍体雌 性，只有一个等位基因时则发育为单倍体的雄性，而如果csd有两个相同的等位基因时则为 二倍体雄性。其中，二倍体雄蜂在幼虫阶段即被工蜂清除。这种性别决定机制使得中华蜜蜂 对近交十分敏感。如果一个中华蜜蜂种群中csd等位基因类型较少，将会导致二倍体雄蜂的 出现几率变大，从而造成蜂子的生存能力下降，蜂群群势降低。因此，在中华蜜蜂的保种及 选择育种过程中，选择种群时要考虑csd等位基因的类型，防止由于csd等位基因的种类数 量下降而导致性位点基因纯合的机率上升，影响蜂子生存能力。因此，需要对中华蜜蜂种群 中csd等位基因类型进行检测。
[0003] 目前，中华蜜蜂种群中csd等位基因类型的检测方法是测定DNA序列。
[0004] 在实现本发明的过程中，本发明人发现现有技术中至少存在以下问题:测定DNA序 列虽然能够检测出不同的csd等位基因类型，但是操作过程复杂并且需要较长的时间、成本 较高。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述的技术问题，本发明提供一种操作简单、快速并且准确的中华蜜蜂 种群中csd等位基因类型的检测方法。
[0006] 具体而言，包括以下的技术方案：
[0007] -种中华蜜蜂种群中csd等位基因类型的检测方法，所述检测方法包括以下步骤： [0008]步骤a，从中华蜜蜂种群中采集预设数量的工蜂作为样本；
[0009] 步骤b，分别提取所采集的每只样本蜜蜂的DNA;
[0010] 步骤C，以步骤b提取的DNA作为模板，利用带有荧光标记的引物对进行PCR扩增得 到扩增产物；
[0011]步骤d，检测所述扩增产物的大小，根据所述扩增产物的大小判断所述中华蜜蜂种 群中csd等位基因的类型；
[0012 ]步骤c中所用引物对的核苷酸序列为：
[0013] FI:5'-CAYCRAGAG AACGAT CTCG-3'，
[0014] R1:5 '-CCCAAGGTYTAAYCATTATTGG-3 '，
[0015] 其中，引物R1的5 '端带有荧光标记，Y代表T或C，R代表G或A。
[0016]进一步地，步骤d具体包括:将所述扩增产物稀释后与分子量内标混合，利用基因 测序仪进行毛细管电泳，得到原始数据;对毛细管电泳得到的原始数据进行分析得到所述 扩增产物的大小信息，根据所述扩增产物的大小判断所述中华蜜蜂种群中csd等位基因的 类型。
[0017] 进一步地，所述引物R1带有的荧光标记为fam、hex、ned、vic^pet。
[0018] 进一步地，步骤C 中，PCR扩增程序为：95°C预变性5min ; 95°C30s，60°C30s，72°C 15s，30 个循环；72°C 延伸 7min。
[0019] 进一步地，步骤c中，PCR扩增反应体系为：总体积为5μ1，其中包括:双蒸水，2.11μ 1; 10 X Buf f er，0.5μ1;浓度为2mM的MgCl2水溶液，0.5μ1; dNTPs，0.4μ1，其中每种dNTP的浓 度为10mm〇l/L;质量浓度50 %的丙三醇水溶液，0.25μ1;浓度为20μΜ的F1引物，0. ΙμL;浓度 为20μΜ的R1 引物，0 · ΙμL;浓度为5Units/yL的TAQ-Ti DNA聚合酶，0 · 04μ1;DNA(16-65ngAx L) ,1μ1〇
[0020] 进一步地，步骤b中，采用Chelex提取所述样本蜜蜂的DNA。
[0021] 进一步地，步骤b中，采用质量体积浓度为5%的Chelex溶液提取所述样本蜜蜂的 DNA;所述Che 1 ex溶液的溶剂为1 /10ΤΕ缓冲液。
[0022] 本发明实施例提供的技术方案的有益效果是：
[0023] 本发明实施例提供了一种基于PCR技术(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链 式反应)的中华蜜蜂种群中csd等位基因类型的检测方法，通过合理设计带有荧光标记的引 物对，对样本蜜蜂的DNA进行PCR扩增并检测扩增产物的大小，由于不同的csd等位基因进行 PCR扩增后的扩增产物大小不同，因此可以根据PCR产物大小的不同来辨别不同的csd等位 基因。该检测方法样品通量较大，对样品的保存条件要求较低而且操作简单，能够快速准确 地对一个中华蜜蜂种群中的csd等位基因类型进行检测，为中华蜜蜂保种、育种工作过程中 种群的选择提供指导，避免蜂群因 csd等位基因的丢失造成csd纯合而出现生产力下降的不 良性状。
【附图说明】
[0024] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于 本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他 的附图。
[0025] 图1为不同中华蜜蜂样本的DNA用引物F2/R2的扩增结果；
[0026]图2为一只中华蜜蜂样本的DNA用荧光标记引物F1/R1扩增后扩增产物的大小值， 其中，横坐标为PCR扩增产物的大小数值，纵坐标为荧光强度。
【具体实施方式】
[0027] 为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进 一步地详细描述。
[0028] 本发明实施例提供一种中华蜜蜂种群中csd等位基因类型的检测方法，所述检测 方法包括以下步骤：
[0029]步骤a，从中华蜜蜂种群中采集预设数量的工蜂作为样本；
[0030]步骤b，分别提取所采集的每只样本蜜蜂的DNA;
[0031]步骤c，以步骤b提取的DNA作为模板，利用带有荧光标记的引物对进行PCR扩增得 到扩增产物；
[0032]步骤d，检测所述扩增产物的大小，根据所述扩增产物的大小判断所述中华蜜蜂种 群中csd等位基因的类型；
[0033] 步骤c中所用引物对的核苷酸序列为：
[0034] FI:5 '-CAYCRAGAG AACGAT CTCG-3 '，
[0035] R1:5 '-CCCAAGGTYTAAYCATTATTGG-3 '，
[0036] 其中，引物R1的5 '端带有荧光标记，Y代表T或C，R代表G或A。
[0037] 本发明实施例中利用PCR技术(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)对 中华蜜蜂种群中csd等位基因的类型进行检测。使用带有荧光标记的引物对进行PCR扩增， 由于不同的csd等位基因进行PCR扩增后的扩增产物大小不同，因此，可以通过检测样本蜜 蜂的DNA利用荧光标记的引物对进行PCR扩增后的扩增产物的大小值来辨别不同的csd等位 基因。利用该方法能够快速、准确地对一个中华蜜蜂种群中的csd等位基因类型进行检测， 为中华蜜蜂保种、育种工作过程中种群的选择提供指导，避免蜂群因 csd等位基因的丢失造 成csd纯合而出现生产力下降的不良性状。而且本发明实施例提供的检测方法样品通量较 大、对样品的保存条件要求较低而且操作简单。
[0038] 本发明实施例中，实现快速、准确检测中华蜜蜂种群中csd等位基因类型的关键在 于PCR扩增所用的引物对，只有采用合适的引物对才能准确地区分不同类型的csd等位基 因。2003年Beye等人通过定位克隆技术鉴定出蜜蜂的csd含有9个外显子，被2个大的内含子 分成3个区，第三个区域有1个精氨酸/丝氨酸富集区和脯氨酸富集区，这两个结构域之间为 一个高变区。本发明实施例所用的带有荧光标记的引物对就是根据中华蜜蜂csd基因高变 区两侧的核苷酸序列设计的。本发明实施例中，首先对采集的样本蜜蜂的DNA进行扩增，扩 增出625bp-691bp大小的基因片段(如图1所示），然后对扩增得到的基因片段进行克隆、测 序从而得出中华蜜蜂csd基因高变区的核苷酸序列，进而设计出带有荧光标记的引物对F1/ R1。上述对样本蜜蜂DNA进行克隆测序时所用的扩增引物的核苷酸序列如下：
[0039] F2:5 '-GAAAGAARTTGCAGTA RAGATAG-3 '，
[0040] R2:5'-CCACCTCTAAATCCTAGTAG-3'，其中，R代表G或A。
[0041] 进一步地，在上述的检测方法中，步骤d中对扩增产物的大小进行检测的具体步骤 包括：
[0042]步骤dl，将扩增产物稀释后与分子量内标混合，利用基因测序仪进行毛细管电泳， 得到原始数据；
[0043]步骤d2,对毛细管电泳得到的原始数据进行分析得到扩增产物的大小信息，根据 扩增产物的大小判断中华蜜蜂种群中csd等位基因的类型。
[0044]利用基因测序仪检测扩增产物大小的原理在于：当标记有荧光素的DNA片段移到 基因测序仪的检测窗口时，荧光素受到激光束的激发而产生荧光信号，此荧光信号被CCD检 测器所检测并被转化为电信号传递到计算机。根据不同的运行模式，工作站会自动地从数 据库中提取这些数据完成对样品DNA片段信息的分析，分析好的样品文件可以用片段分析 软件打开查看。
[0045] 基因测序仪的具体型号和对毛细管电泳原始数据进行分析所用的软件本发明实 施例均不作特殊限定，本领域常用的基因测序仪和常用的分析软件均可。例如，可以采用 ABI3130xl型基因测序仪进行毛细管电泳，采用GeneMapper软件对毛细管电泳的原始数据 进行分析。
[0046] 进一步地，在上述的检测方法中，引物R1带有的荧光标记的具体种类没有严格的 限定，本领域常规技术手段均可，例如可以为羧基荧光素(FAM)、荧光素氨基磷酸酯(HEX)、 NED、VIC或者PET等，其中优选羧基荧光素(FAM)。荧光标记位于引物R1的5 '端。
[0047] 进一步地，在上述的检测方法中，步骤c中，PCR扩增程序对最终检测结果也具有重 要的影响，优选采用以下的PCR扩增程序:95°C预变性5min; 95°C30s，60°C30s，72°C15s，30 个循环;72°C延伸7min。本领域技术人员也可以根据实际情况采用其他的程序进行PCR扩 增。
[0048] 进一步地，在上述的检测方法中，步骤c中，PCR扩增反应体系优选为：总体积为5μ 1，其中包括：双蒸水，2.1 ΙμL; 10 X Buff er，0.5μ1;浓度为2mM的MgCl2水溶液，0.5μ1; dNTPs， 0.4μ1，其中每种dNTP的浓度为10mm〇l/L;质量浓度50 %的丙三醇水溶液，0.25μ1;浓度为20 μΜ的F1引物，0. ΙμL;浓度为20μΜ的R1引物，0. ΙμL;浓度为5Units/VL的TAQ-Ti DNA聚合酶， 0·04μ1;DNA(16-65ng/yL)，ΙμL。
[0049] 进一步地，在上述的检测方法中，步骤b中用于提取蜜蜂D