豌豆抗白粉病er1等位基因er1-8及其编码蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物病理学、遗传育种及分子生物学领域，具体地说，设及魏豆抗白粉 病erl新等位基因erl-8及其编码蛋白。
【背景技术】
[0002] 魏豆（PisumsativumL.)是世界上重要的食用豆类作物。我国是世界上第一 大菜用魏豆生产国和第Ξ大干魏豆生产国（FA0STAT数据）。由白粉菌巧巧si地episi 化C.)引起的白粉病是魏豆的主要病害之一，在全球范围内引起严重经济损失（Nisaret al. , 2011；Fondevillaetal. , 2012)〇
[0003] 防治魏豆白粉病最为经济、有效且环境安全的方法是种植抗病品种。目前，国外 已经鉴定了大量的抗白粉病魏豆资源，并在抗性资源中鉴定了 3个独立遗传的抗白粉病 基因（erl、er2 和Er3)(Harlandetal. , 1948:He;ringaetal. , 1969;Fondevillaet al.，2007)。迄今，除在魏豆资源JI2480中鉴定魏豆抗白粉病基因er2和在魏豆野生种 P.化Ivum中鉴定Er3外，大量抗性资源筛选和遗传分析方面的研究表明，许多不同地理起 源的抗白粉病魏豆资源的抗性均由erl控制（Tiwarietal. , 1997;(}hafooretal. , 2012; Liuetal., 2003;Vaidetal., 1997)。目前生产中应用的抗白粉病魏豆资源的抗性均由 erl控制。随着魏豆分子标记的开发和遗传图谱的构建，抗病基因erl被定位在魏豆遗传 图谱的第6连锁群（LGViHTimmermanet曰1.，1994)。抗病基因erl对白粉菌表现抗病 或者免疫的机制是抑制病原菌对寄主的表皮细胞的入侵。抗病基因erl具有抗病持久而 且不受外界环境的影响，在欧盟等国已广泛应用于栽培育种中。近来研究表明erl基因是 由于魏豆PsMLO同源基因序列发生基因插入、缺失、移位、替换等基因突变导致功能丧失而 产生的。目前，基于突变的位置和方式不同而已发现了 7个erl等位基因，分别是erl-1、 e;rl-2、e;rl-3、e;rl-4、erl-S、erl-G和e;rl-7,其中只有等位基因e;rl-2是由于插入大的未 知基因片段产生的，其它erl等位基因都是由单碱基突变或小片段缺失引起的化umphryet al. , 2011;Pavanetal. , 2011;Sunetal. , 2015a;201f5b)。
[0004] 魏豆在我国已有2000多年的栽培历史，魏豆白粉病已对我国魏豆生产造成严重 威胁。然而，我国对魏豆抗白粉病的研究较少，目前主要集中在魏豆抗白粉病的资源筛选， 并在中国魏豆资源中发现了对中国白粉菌分离物EPYN和EPBJ均表现免疫的较好资源（彭 化贤等，1991 ;曾亮等，2012 ;王仲怡等，2013 ;付海宁等，2014)。最近，在运些抗病资源中， 鉴定了抗病基因erl-l、e;rl-2、erl-G和erl-?。
【发明内容】
阳0化]本发明的目的是提供魏豆抗白粉病erl新等位基因erl-8及其编码蛋白。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明提供的erl-8蛋白，其氨基酸序列如SeqIDNo.1所 示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0007] 本发明还提供编码所述蛋白的魏豆抗白粉病erl等位基因erl-8,其cDNA序列如 SeqIDNo. 2 所示。
[0008] 本发明进一步提供所述等位基因erl-8在魏豆资源抗白粉病的分子育种中的应 用。
[0009] 为了明确魏豆抗白粉病资源G0004389的抗病erl等位基因，本发明对G0004389 的erl候选基因PsMLOlcDNA进行测序。序列分析结果显示G0004389的PsMLOlcDNA序列 与野生型感病基因PsMLOlcDNA序列相比，在1340-1342bp处存在3个碱基GTG缺失，运一 缺失导致翻译过程中移码突变并造成PsMLOl蛋白第447个氨基酸（鄉氨酸）缺失，从而引 起PsMLOl蛋白功能的变化。运与已鉴定的7个erl等位基因的突变位置和突变方式均不 相同，表明运是一个erl的新等位基因，将其命名为erl-8。该等位基因位于魏豆遗传图谱 第VI连锁群的erl基因座位上。
[0010] 本发明通过对魏豆抗白粉病资源G0004389的erl候选基因PsMLOlcDNA序列分 析，发现了新的抗性等位基因erl-8。确定了新等位基因erl-8的cDNA序列。本发明首次 鉴定了erl的新等位基因erl-8,对魏豆抗白粉病育种工作具有重要意义，通过育种手段可 有效控制魏豆白粉病的发生，减轻该病害造成的经济损失，并为魏豆资源抗白粉病的分子 育种提供新的基因资源。
【附图说明】
[0011] 图1为本发明中抗病资源G0004389(左）和感病品种巧魏6号（右）接种魏豆白 粉菌分离物EPYN10天后的表型。 阳012] 图2为本发明中控制魏豆白粉病抗性的功能基因PsMLOl的结构W及抗病资源 G0004389和野生型魏豆感病资源在基因PsMLOl的第15个外显子的核巧酸序列比对结果。
【具体实施方式】
[0013] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:a1油oratorymanual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0014] 实施例1魏豆抗白粉病资源G0004389的表型鉴定
[0015] 将抗病魏豆资源G0004389和感病对照品种巧魏6号W及抗病对照品种YI分别播 种于W粗赔石为基质的250mL的纸杯中，每杯播5粒，于18~26°C的溫室培养，待魏豆苗第 3或第4茎节叶片展开时，采用抖落法接种白粉菌分离物EPYN的分生抱子（NCBI，Accession number:KR957355)，接种后置于18~22°C溫室培养。采用0~4级的病害严重度分级标 准，0级：无病；1级：病斑上有淡薄菌丝层，可见绿色叶面，不产生抱子；2级：菌丝层较厚， 不透绿，产生一定量抱子；3级：菌丝层厚，产抱量较多；4级：产抱量多，病斑上的菌丝层全 被抱子覆盖（Vaidetal.，1997;Ranaetal.，2013)。接种10天后感病对照品种病害严 重度达4级后调查各供试资源的发病情况。抗性评价标准为：0级为免疫（I)，1~2级为 抗病（时，3~4级为感病（S)。对表现为免疫和抗病的魏豆资源进行重复鉴定。
[0016] 接种10天后，感病对照品种巧魏6号所有植株的叶片、茎杆和卷须上全部覆盖 厚的菌丝层，并产生大量分生抱子，茎杆和卷须也布满菌丝体和分生抱子，病害严重度为4 级，表现感病；抗病对照品种ΥΙ(ΡΙ391630)叶片、茎杆和卷须上均无可见症状，病级为0， 表现免疫。对照品种对分离物EPYN的表型反应与王仲怡等（2013)的鉴定结果相同。抗性 资源G0004389的表现型与抗病对照YI相同，对分离物EPYN表现免疫反应。
[0017] 抗病资源G0004389和感病品种巧魏6号接种魏豆白粉菌分离物EPYN10天后的 表型如图1所示。 阳0化]实施例2抗性资源的erl候选基因PsMLOlcDNA序列鉴定
[0019] 用RNApr巧植物总RNA提取试剂盒（离屯、柱型，购自天根生化）提取魏豆资源 G0004389、感病对照品种巧魏6号W及抗病对照品种YI(含er1-4等位基因）的植物总RNA。 具体操作方法如下：
[0020] 1)取约lOOmg魏豆幼嫩叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450μL化（使用前加 入β-琉基乙醇至终浓度为1 % )，满旋剧烈震荡混匀；
[0021] 2)将所有溶液转移至过滤柱CS上（过滤柱CS放在收集管中），1200化pm离屯、 5min，小屯、吸取收集管中的上清至RNase-化ee的离屯、管中；
[0022] 3)缓慢向离屯、管中加入0. 5倍体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起 转入吸附柱CR3中，静置2min，12000巧m离屯、Imin，倒掉收集管中的废液； 阳02引 4)向吸附柱CR3中加入500μL去蛋白液RW1，静置2min，12000巧m离屯、Imin，倒 掉收集管中的废液；
[0024] 5)面aseI工作液的配制：取10 μ L面aseI储存液放入新的RNase-化ee离屯、管 中，加入70 μ L RDD溶液，轻柔混匀； 阳02引 6)向吸附柱CR3中央加入80μL的面aseI工作液，室溫放置20min;
[0026] 7)向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，静置2min，12000巧m离屯、Imin，倒 掉收集管中的废液；
[0027]8)向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW(使用前加入无水乙醇），室溫静置2min， 1200化pm离屯、Imin，倒掉收集管中的废液； 阳0測 9)重复步骤8);
[0029] 10) 12000巧m离屯、2min，倒掉废液，将吸附柱CR3置于室溫放置数分钟，彻底惊干 残留的漂洗液；
[0030] 11)将吸附柱CR3放入一个新的RNase-化ee离屯、管中，向吸附膜的中间位置悬空 滴加50μLRNase-freed地2〇,室溫放置lOmin，12000巧m离屯、2min，得到RNA溶液； 阳(X31] RNA完整性检测：普通琼脂糖凝胶电泳，电泳条件：胶浓度1. 2 %;1XT邸电泳 缓冲液；150V;15min。 阳0巧用BioRT逆转录扩增脚-PCR)试剂盒（两步法）合成mRNA第1条cDNA链，用PsMLOl特异性引物对PsML01F/PsML01R(5' -AAAATGGCTGAAGAGGGAGTT-3' /5'-TCCACAAATCA AGCTGCTACC-3'）进行PCR扩增（Pavenetal.，2013)。PCR扩增产物经 1. 5%T邸琼脂糖 凝胶电泳检测，采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离屯、柱型，购自天根生化）回收并纯 化PCR