用于产生双等位基因敲除的方法和组合物的制作方法
【专利说明】用于产生双等位基因敲除的方法和组合物 相关申请的交叉引用
[0001] 本申请要求申请日为2013年7月19日的美国临时申请Serial Νο·61/856,579 的优先权，所述申请的内容在此以其全文形式被援引加入本文。涉及的序列表、表格或计算 机程序
[0002] 序列表的正式文本以ASCII格式的文本文件通过EFS-Web与本说明书同时提交， 其文件名为"LRX.0003_ST25.txt"，建立日期为2014年7月19日，大小为42千字节。通过 EFS-Web提交的序列表是本说明书的一部分，并在此以其全文形式被援引加入本文。
【背景技术】
[0003] 已经表明基因敲除技术在生物研究中具有巨大的价值。通过同源重组的传统基 因阻断技术是费力并且不可预测的过程。近年来开发的靶向基因组编辑更为有效的多，并 可通过在染色体中的靶向双链断裂（DSB)来实现。该技术的示例利用了成簇的规律间隔 的短回文重复序列（CRISPR)、锌指核酸酶（ZFN)或类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN) (Esvelt and Wang, Mol. Syst.Biol. ,2013,9:641)。其中，CRISPR 是最通用的基因组编辑 工具，这是因为其借助于与基因组修饰位点互补的特异性RNA序列的靶向机制。CRISPR允 许通过利用成簇的靶向RNA序列在多个位点进行基因组编辑。细胞中的DSB通过非同源末 端连接（NHEJ)修复，在低频导致可能产生移码和灭活感兴趣基因的小插入或缺失（插入缺 失）。
[0004] 使用大多数方法，基因组编辑率是较低的，通常小于5%。评定基因组编辑、利用 Swveyor⑩核酸酶分析（Transgenomic, Inc.，Omaha, NE)来检测双链体DNA错配或深度测 序的最常用的方法不区分单等位基因或双等位基因突变。由于在单个步骤中产生双等位基 因突变的可能性是可忽略不计的，一般要求两步骤（2步骤）序列基因组编辑。
[0005] 治疗性抗体是在过去二十年开发的成功的新药物类别。FDA已批准了超过三十种 重组治疗性抗体，用于治疗不同的疾病，包括癌症、病毒感染、器官移植排斥、类风湿性关节 炎和其它自身免疫性病症。更多的治疗性抗体处于临床试验中，用于日益扩大的疾病种类。 随着分子生物学的出现，在哺乳动物细胞中产生重组抗体已成为可能（N. Yamane-Ohnuki and M. Satoh，mAbs，2009, 1 (3):230-236)〇
[0006] 针对可溶性因子（例如血管内皮生长因子或肿瘤坏死因子）的抗体治疗的目的 仅仅在于通过免疫复合物形成来降低游离配体浓度。相比之下，当抗体治疗是针对细胞 表面抗原时（如同通常在抗肿瘤免疫治疗中的情况），目标通常是去除引起疾病的细胞本 身。抗体依赖性细胞（介导）的细胞毒作用（ADCC)--种对抗体靶向细胞的溶解性攻击， 在淋巴细胞受体（例如，FcyRs)通过抗体的恒定区（Fe)结合时被触发，所述抗体在大多 数情况下为免疫球蛋白亚类I (IgGl)。ADCC被视为是一些治疗性抗体的主要功能，虽然抗 体具有多种治疗功能（例如，抗原结合、诱导凋亡、和补体依赖性细胞介导的细胞毒作用） (T. Shinkawa 等人，J. Bio. Chem.，2003, 278 (5): 3466-3473)。在 ADCC 中，自然杀伤（NK)细 胞主要经由与NK细胞的FcyRIII受体的相互作用而识别抗体的恒定（Fe)区，然后激活细 胞溶解和细胞凋亡。
[0007] Fc-Fc γ RIII相互作用对Fc糖基化极为敏感。非糖基化的（aglycosylated)抗 体（例如，由非哺乳动物细胞系产生的那些）不能结合Fc受体（Leatherbarrow等人， Mol. Tmmun.，1985, 22:407-15 ;Walker 等人，Biochem. J.，1989, 259:347-53 ;Leader 等人， Immunology，1991，72:481-5)。另一方面，附接至Fc区的Asn297的糖链的岩藻糖基化降 低了与Fe YRIII的结合并且降低了体外ADCC活性（Shields等人，J. Biol. Chem.，2002， 277:26733-40 ;Shinkawa 等人，J. Biol. Chem.，2003, 278:3466-73 ;Niwa 等人，CancerRes.， 2004,64:2127-33)。
[0008] 大多数的哺乳动物免疫球蛋白被岩藻糖基化，包括由中国仓鼠卵巢细胞（CH0细 胞）产生的那些（Jefferis 等人，Biochem J.，1990, 268:529-37 ;Raju 等人，Glycobiology， 2000,10:477-86)。岩藻糖经由α-1，6岩藻糖基转移酶（FUT8)蛋白产生的α-1，6键附接 至 Fc 核心区（Oriol 等人，Glycobiology，1999,9:323-34 ;Costache 等人，J. Biol. Chem.， 1997,272:29721-8)。CHO细胞中Fut8基因的阻断/破坏可消除抗体的核心岩藻糖基化并 可增大 ADCC ~100 倍（Yamane-Ohnuki 等人，Biotech. Bioengin.，2004,87 (5) :614-622)。
[0009] 已使用基因组编辑通过敲低/敲降或敲除FutS等位基因来降低或消除FUT8活 性。Imai-Nishiya等人已经披露了 Fut8和GMD的双敲低，利用siRNA串联表达载体靶 向这些基因并将其引入IgGl抗体产生CH0/DG44 32-05-12细胞（BMCBiotechnology， 2007, 7:84 ;doi: 10. 1186/1472-6750-7-84)。为了产生双等位基因 Fut8 敲除 CHO 细 胞，Yamane-Ohnuki等人披露了 一种两步序列同源重组工艺（Biotech. Bioengin.，2004， 87(5):614-622)来克服低频率的同源重组。类似地，Collingwood披露了一种靶向ZFN 方法来敲除CHOK细胞中的两个FutS等位基因，这是通过在致死量的小扁豆凝集素（LCA) 存在的情况下连续培养来富集FutS裸细胞来进行，利用了由LCA与岩藻糖的特异性结 合所诱导的细胞毒性（W0 2009/009086 ;L. Malphettes 等人，Biotech. Bioengin.，2010， 106(5) :774-783)。
[0010] 此外，可能希望产生其中除Futs基因外的其它基因被部分或全部抑制的细胞系。 因为基因组编辑率低，通常小于5%，因此可合理地假定通过单个crRNA位点产生双等位基 因突变的可能性是可忽略不计的。可能必须要进行序列基因组编辑，以便获得双等位基因 敲除。例如，Cong等人披露了在两个内源基因（EMXl和PVALB)和在同一 EMXl基因的两个 靶位点中成功的基因组编辑（Science，2013, 339:819-823)。不过，当靶向EMXl基因中的2 个原型间隔序列时，缺失效率仅为1. 6%，并且没有报告双等位基因敲除。
【发明内容】
[0011] 在一个方面，本发明提供了一种通过为真核细胞提供CRISPR系统在真核细胞中 产生双等位基因敲除的方法，所述CRISPR系统包括核酸酶和与靶基因中的DNA间隔序列互 补的至少两个革G向RNA。在一个实施例中，相同的tracrRNA可与多个不同的crRNA -起使 用，并且许多crRNA可用单个tracrRNA组织。在一个实施例中，CRISPR系统包括至少三个 或四个靶向RNA。在一个实施例中，多个CRISPR靶（crRNA靶）在相同的基因中。在一个实 施例中，多个CRISPR靶在基因的相同外显子中。在一个实施例中，多个CRISPR靶在基因的 500bp、450bp、400bp、375bp、350bp、300bp、250bp、200bp、150bp、lOObp、或 50bp 内。在一个 实施例中，真核细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施例中，哺乳动物细胞是CHO细胞、CHOS 细胞、293细胞、NSO细胞、胚胎干细胞、或其衍生物、或抗体产生细胞或其衍生物。在另一实 施例中，核酸酶是Cas变体。在另一个实施例中，Cas变体核酸酶是Cas9。在一个实施例 中，革巴向RNA由tracrRNA和crRNA构成。在另一个实施例中，tracrRNA和crRNA可由发夹 RNA连接物连接。在另一个实施例中，靶基因是岩藻糖基转移酶。在另一个实施例中，靶向 的岩藻糖基转移酶基因是Fut8, a-(1-6)-岩藻糖基转移酶。在另一个实施例中，靶基因是 谷氨酰胺合成酶。在另一个实施例中，靶基因是二氢叶酸还原酶（DHFR)。在另一个实施例 中，靶基因是唾液酸酶。
[0012] 在另一个方面，本发明包括使用本发明的方法使Fut8敲除的哺乳动物细胞。在一 个实施例中，哺乳动物细胞包括Fut8敲除细胞，所述Fut8敲除细胞在荧光标记细胞表面岩 藻糖之后通过FACS对阴性荧光信号分离出来的。在一个实施例中，荧光标记包括与荧光素 标记的小扁豆凝集素（LCA-FITC)的结合。
[0013] 在另一方面，本发明包括使用本发明的方法使谷氨酰胺合成酶敲除的哺乳动物细 胞。
[0014] 另一方面，本发明包括使用本发明的方法使DHFR敲除的哺乳动物细胞。
[0015] 另一方面，本发明包括使用本发明的方法使唾液酸酶敲除的哺乳动物细胞。
[0016] 另一方面，本发明包括使用本发明的方法使其它靶基因敲除的哺乳动物细胞。
[0017] 另一方面，本发明包括使用本发明的方法由使FutS敲除的真核细胞产生的无岩 藻糖基化蛋白。在一个实施例中，无岩藻糖基化蛋白是抗体。在另一实施例中，抗体是利妥 昔单抗。
[0018] 另一方面，本发明包括质粒，所述质粒包含编码Cas9蛋白的核苷酸，以及crRNA 和tracrRNA中之一或两者，其中质粒是哺乳动物细胞表达载体，并且其中当crRNA和 tracrRNA均存在时，它们可选地由发夹RNA连接物连接。在一个实施例中，质粒包括crRNA 和tracrRNA中之一或两者，其中利用了能够革El向Cas9染色体位点的crRNA或tracrRNA的 部分序列。在另一实施例中，crRNA由靶基因的至少两个原型间隔序列组成。在另一个实 施例中，Cas9蛋白表达通过启动子进行表达。在另一实施例中，启动子是CMV启动子。在 另一个实施例中，tracrRNA通过启动子进行表达。在另一实施例中，crRNA通过启动子进行 表达。在另一个实施例中，通过发夹RNA连接物与tracrRNA连接的crRNA通过启动子进行 表达。在另外的实施例中，tracrRNA启动子和crRNA启动子是人U6启动子。在另一个实 施例中，质粒还包括抗生素抗性基因。在另一实施例中，抗生素是氨苄青霉素。
[0019] 另一方面，本发明提供了一种方法，其中本发明的细胞被转染有至少一个含有 Cas9的质粒。
[0020] 另一方面，本发明提供了一种方法，其中本发明的细胞被转染有至少一个含有 crRNA的质粒。
[0021] 另一方面，本发明提供了一种方法，其中本发明的细胞被转染有至少一个含有通 过发夹RNA连接物与tracrRNA连接的crRNA的质粒。
【附图说明】
[0022] 图IA-C示意性地示出了 Cas9介导的序列特异性DNA裂解：图IA示出了通常的 CRISPR系统，其具有三个组成部分：Cas9蛋白和两个小RNA(crRNA和tracrRNA) ;crRNA含 有与靶向DNA互补的序列（间隔序列加上NGG) ;tracrRNA含有与crRNA互补的序列；野生 型Cas9导致双链DNA断裂，而Cas9-D10A导致单链DNA断裂。图IB示出了本发明的经修 饰的CRISPR系统，其具有两个组成部分：Cas9蛋白以及结合crRNA和tracrRNA的序列的 单个gRNA，其中gRNA含有与靶向DNA互补的序列和发夹结构。图IC示出了含有3个不同 的靶向间隔区的crRNA的示意图；DR是指同向重复序列，而T1、T2、和T3是靶向序列。
[0023] 图2Α-Β示出了 Cas9介导的基因靶向系统的质粒图谱，哺乳动物细胞表达载体 LB200和LB221 ;Cas9通过CMV启动子进行转录；tracrRNA通过人