U6启动子进行转录。图 2A示出了载体LB200。图2B示出了载体LB221，其中IRES-GFP盒被插在Cas9之后。
[0024] 图3示出了 Cas9介导的基因革El向系统的质粒图谱，哺乳动物细胞表达载体 LB202a ;DR-T1-DR的crRNA通过人U6启动子进行转录。
[0025] 图4A-B示出了在引入靶向Fut8的CRISPR系统之前和之后在CHOS细胞上的岩藻 糖的LCA-FITC染色。图4A示出了没有LCA-FITC染色的阴性对照CHOS细胞和在野生型 CHOS细胞中具有LCA-FITC染色的阳性对照岩藻糖。图4B示出了在引入具有单个靶向RNA 或crRNA的CRISPR系统之后在CHOS细胞上的岩藻糖的LCA-FITC染色。
[0026] 图5A-C示出了在引入具有1-10个靶向RNA或crRNA的靶向Fut8的CRISPR系统 之前和之后在CHOS细胞上的岩藻糖的LCA-FITC染色。图5A示出了没有LCA-FITC染色的 阴性对照CHOS细胞和在野生型CHOS细胞中具有LCA-FITC染色的阳性对照岩藻糖。图5B 示出了在引入具有一（1)到十（10)个靶向RNA或crRNA的CRISPR系统之后在CHOS细胞 上的岩藻糖的LCA-FITC染色。图5C示出了在LCA-FITC染色之前和之后的CHOS细胞，以 及从标记为2. 123. 3P的转染#5 (三个靶向RNA)和标记为2. 123. 4P的转染#6 (四个靶向 RNA)的M2池克隆的细胞的LAC-FITC染色。
[0027] 图6A-C示出了岩藻糖的LCA-FITC染色（图6A);序列比对（图6B :Fut8外显子 I-SEQ ID N0:1 ;突变体I-SEQ ID N0:2 ;突变体2-SEQ ID N0:3 ;和突变体3-SEQ ID N0:4); 以及从转染#5 (三个靶向RNA)的M2峰分离出的克隆的转染率（图6C)。突变体1和3来自 细胞系2. 123-4,而突变体2来自细胞系2. 123-6。从转染#5的M2峰分离的其它突变体细 胞系是 2. 123-U2. 123-1U2. 123-12、2· 123-13、2· 123-15、2· 123-20、2· 123-23、2· 123-25、 和 2. 124-6。
[0028] 图7示出了在野生型CHOS细胞以及具有Fut8的双等位基因敲除的CHOS细胞中 进行的利妥昔单抗（美罗华，Rituxan)和曲妥珠单抗（赫赛汀，Herceptin)的聚糖分析。
[0029] 图8A-B示出了在野生型CHOS细胞以及具有Fut8的双等位基因敲除的CHOS细胞 中所得的利妥昔单抗（Rituxan)和曲妥珠单抗（Herceptin)的抗体依赖性细胞介导的细胞 毒性作用。图8A示出了在野生型CHOS细胞以及具有Fut8的双等位基因敲除的CHOS细胞 中所得的利妥昔单抗（Rituxan)的ADCC活性。图8B示出了在野生型CHOS细胞以及具有 Fut8的双等位基因敲除的CHOS细胞中所得的曲妥珠单抗（Here印tin)的ADCC活性。
【具体实施方式】
[0030] 本发明通过示例而非通过限制的方式进行阐述。应当指出，本文中提及一个/ 一 种（"an"）或一个/ 一种（"one"）或"一些（some)"实施例并不必然指同一实施例，所有 这样的提及意味着至少一个。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，而复数术 语应包括单数。在本申请中，除非另有说明，"或（or)"的使用意味着"和/或"。此外，术语 "包括（including)"以及其它形式的使用，例如"包括（includes)"和"包括（included)"， 不是限制性的。
[0031] 除非本文中另行规定，结合本发明所用的科技术语应具有本领域普通技术人员通 常理解的含义。这些术语的含义和范围应当是清楚的，不过，如果存在任何潜在的歧义，本 文提供的定义优先于任何词典或外来定义。
[0032] -般而言，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学 和蛋白质与核酸化学以及杂交结合使用的术语及其技术是本领域公知且常用的。除非另有 说明，本发明的方法和技术一般根据传统的方法进行，所述传统的方法是本领域公知的并 且如贯穿本说明书所引用和讨论的不同的一般参考文献和更为特定的参考文献中所述。酶 促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。为了 本发明可以更易于理解，下文定义了选定的术语。
[0033] 本文所用的术语"抗体"广义地是指由四个多肽链（两个重（H)链和两个轻（L) 链）组成的任何免疫球蛋白（Ig)分子、或任何功能性片段、突变体、变体、或其衍生物（保 留了 Ig分子的基本表位结合特征），包括例如基本上由免疫球蛋白基因、免疫球蛋白基因 的片段、杂合免疫球蛋白基因（通过组合来自不同动物的遗传信息而得）、或合成免疫球蛋 白基因编码的一种或多种多肽，或单链抗体、Fab、F (ab) 2、scFv、dAB、VHH、骆驼抗体、或纳米 抗体。所述突变体、变体或衍生抗体形式是本领域已知的。其非限制性实施例在下文讨论。
[0034] 在全长抗体中，每条重链由重链可变区（在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定 区组成。重链恒定区由三个功能区CH1、CH2和CH3组成。每个轻链由轻链可变区（本文缩 写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个功能区CL组成。VH和VL区可被 进一步细分为高变区，称为互补决定区（CDR)，穿插有称为框架区（FR)的更保守的区域。每 一 VH和VL由三个⑶R和四个FR组成，从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FRl、⑶Rl、FR2、 CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和 IgY)、类别（例如，IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或亚类。
[0035] 本文所用的"分离抗体"意指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体 (例如，特异性结合在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的分离抗体）。不过， 特异性结合CD20抗原的分离抗体对其它抗原例如来自其它种的CD20分子可能具有交叉反 应性。此外，分离抗体可基本无其它细胞物质和/或化学物质。
[0036] 本文所提及的术语"多核苷酸"意指2个或更多核苷酸的聚合形式，或者是核糖核 苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。术语包括单链形式和双链形式的 DNA，但具体地是双链DNA。
[0037] 本文使用的术语"分离的多核苷酸"应表示一种多核苷酸（例如，基因组的、cDNA、 或合成来源，或其某一组合），由于其来源，"分离的多核苷酸"不与在自然界中随之发现"分 离的多核苷酸"的多核苷酸的全部或一部分关联；可操作地连接至自然界不存在的多核苷 酸；或在自然界中不作为较大序列的部分出现。
[0038] 本文所用的术语"载体"意指能够转运与之连接的另一核酸的核酸分子。一种类 型的载体为"质粒"，其指的是另外的DNA片段可连接入其中的环状双链DNA环。某些载体 能够引导它们可操作地连接的基因的表达。所述载体在本文被称为"重组表达载体"（或者 简称为"表达载体"）。一般而言，用于重组DNA技术的表达载体常常为质粒的形式。在本 说明书中，"质粒"和"载体"可互换地使用，因为质粒是最常用的载体形式。不过，本发明旨 在包括可以发挥等同功能的此类其它形式的表达载体。在细胞内部，载体和/或质粒可在 染色体外存在或整合到宿主细胞DNA中。
[0039] 术语"可操作地连接（operably linked) "是指其中所述的组成部分处于允许它们 以其预期方式起作用的关系的并置。与编码序列"可操作地连接"的控制序列以这样的方 式接合/连接，使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下实现。"可操作地连接"的 序列包括与感兴趣的基因邻接的表达控制序列，和以反式或在远处起作用以控制感兴趣基 因的表达控制序列。本文所用的术语"表达控制序列"是指实现它们所连接的编码序列的 表达和加工所需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强 子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强 翻译效率的序列（即，Kozak共有序列）；增强蛋白质稳定性的序列；和在需要时，增强蛋白 质分泌的序列。所述控制序列的性质取决于宿主生物体而不同；在真核细胞中，一般所述控 制序列包括启动子和转录终止序列。术语"控制序列"旨在包括其存在对于表达和加工是 必要的组成部分，并且还可以包括其存在是有利的其它组成部分，例如前导序列和融合伴 侶序列（fusion partner sequence) 〇
[0040] 术语"将纯化DNA引入真核宿主细胞"或"转染"表示其中具有或没有伴随物质的 细胞外DNA进入宿主细胞的任何过程。术语"经转染的细胞（cell transfected) "或"转 染的细胞（transfected cell) "表示细胞外DNA已被引入并因而包含细胞外DNA的细胞。 DNA可能被引入细胞，使得核酸可复制作为染色体组成部分（chromosomal integrant)或 作为染色体外元件。本文所用的"启动子（promoter)"是指调苄基因表达的核酸序列。
[0041] 本文所用的术语"重组宿主细胞"（或简称为"宿主细胞"）意指其中已引入外源 DNA的细胞。应当理解，所述术语不仅意指特定的受试细胞，还意指此类细胞的后代。由于突 变或环境影响而在后续代中可能发生某些修饰，事实上这样的后代可能不与亲代细胞（母 细胞）相同，但仍被包括在本文所用的术语"宿主细胞"的范围内。尤其是，宿主细胞包括 真核细胞。
[0042] "真核细胞"是指任何哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞（来自真核生物）。作为非 限制性实例，能够在细胞培养条件下维持并且随后被转染的任何真核细胞都将包括在本发 明中。特别优选的细胞类型包括，例如，干细胞、胚胎干细胞、中国仓鼠卵巢细胞（CHO)、293 细胞、NSO细胞、C0S、BHK21、NIH3T3、HeLa、C2C12、癌细胞、植物细胞、真菌细胞、以及原代分 化细胞或未分化细胞。其它适合的宿主细胞对于本领域普通技术人员来说是已知的。
[0043] "感兴趣基因 （gene of interest)"或"转基因"优选地编码蛋白质（结构或调节 蛋白）。本文所用的"蛋白质"一般是指具有多于约十个氨基酸的肽和多肽。蛋白质对于宿 主可以是"同源的"（即，对于被利用的宿主细胞而言是内源的）、或"异源的"（即，对于被 利用的宿主细胞而言是外来的），例如由酵母产生的人类蛋白。可产生蛋白质为不溶性聚集 物或为可溶性蛋白于细胞的胞质周围间隙或胞质中、或细胞外介质中。
[0044] 标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成、组织培养和转化（例如，电穿孔、脂质 转染）。酶促反应和纯化技术可以按照制造商的说明书或如本领域通常所完成、或如本 文所述来进行。前述技术和程序可大体按照本领域所公知的传统方法和如贯穿本说明书 所引证和讨论的不同通用和更具体的文献中所述来进行。说明性的方法披露于Current Protocols in Immunology(编辑：Coligan，J.E.等人，John Wiley&Sons, NY, NY, 2001)， Ausubel 等人，Current Protocols in Molecul arBiology, Greene Publ. Assoc. Inc. &John Wiley&Sons，Inc.，NY, NY, 2001)，Sambrook等人（Molecular Cloning，3rd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview，NY，2001)以及别处。 本发明的概述
[0045] 本发明利用CRISPR系统以阻断/破坏真核细胞中的靶基因。更具体地说，系统瞬 时表达Cas9、tracrRNA(单个或多个）、和多个crRNA，其靶向真核细胞例如CHO细胞、293 细胞、NSO细胞、或任何抗体产生细胞中的感兴趣基因的多个外显子位点。相比于公开的 CRISPR方法，本发明的系统的主要优点在于，它通过利用相同系统中的多个crRNA序列在 一个步骤中特定敲除两个靶向等位基因。涉及CRISPR的大多数公开文献利用Surveyor? 核酸酶分析/测定（Tr