一种制备iGb3S基因敲除的非人哺乳动物的方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及制作基因敲除动物模型的领域，具体讲，涉及一种制备iGb3S基因敲除的非人哺乳动物的方法及应用。其制备方法为：从基因组DNA中分离iGb3S基因，经长链PCR方法扩增获得同源臂，与抗生素耐药基因复合构建打靶载体；将打靶载体转入到胚胎细胞，将重组胚胎细胞注入代孕动物胚胎中，移植到假孕动物体内，与正常动物交配；对得到的嵌合体动物进行基因型验证，筛选基因成功敲除的阳性基因敲除的嵌合体动物；进一步与野生型动物交配，获得F1代杂合子；F1代杂合子之间交配后获得两条染色体均被剔出的纯合子动物，建系获得基因敲除动物种群。
【专利说明】一种制备iGb3S基因敲除的非人晡乳动物的方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及制作基因敲除动物模型的领域，具体讲，涉及一种制备iGb3S基因敲 除的非人哺乳动物的方法及应用。
【背景技术】
[0002] 由哺乳动物细胞外基质构成的生物源性材料因其具有良好的生物相容性被广泛 用于外科的创伤修复、组织重建和组织工程的支架材料等。异种器官也早已成为解决器官 移植中供器官严重缺乏的潜在途径之一。然而，动物源性生物材料或异种器官组织应用于 人体所带来的免疫学问题直接影响着这类材料使用的安全性和有效性。异种器官移植的最 大障碍是供器官异种抗原与受者体内天然抗体结合后激活补体系统，攻击供器官而产生的 超急性免疫排斥反应（Hyperacute rejection，HAR)，其发生时间在异种移植后的几分钟至 数小时，供器官在短时间内发生功能衰竭使移植失败。动物源性生物材料虽经各种去除抗 原的处理，却难以彻底去除所有的异种抗原，残留抗原仍然是造成慢性免疫排斥反应和免 疫毒性而影响创伤愈合的重要因素。
[0003] 已有研究显示异种抗原α -半乳糖基抗原（α -1，3-galactosyle，a -Gal)是动物 源性生物材料或异种器官移植超急性免疫排斥反应中的主要靶抗原。a -Gal是含有聚乳 糖胺核心末端残基的细胞表面分泌型糖蛋白或糖脂，广泛存在于猪和其它低等动物体内。 a -Gal 主要受：α -1，3 半乳糖基转移酶（α 1，3-galactosyltransferase，α -1，3GT)及异 红细胞糖苷酯合成酶（isoglobotriosylceramide synthase或isogloboside 3 synthase， iGb3S)调控。由于人体及类人猿、旧世纪猴的半乳糖苷转移酶基因有2个碱基错位变异而 不表达Gal抗原，但人血清中存在高滴度的抗a -Gal抗体（占总血清球蛋白的1% )，因此 当人体接受含有Gal抗原的生物材料或异种器官移植时会导致超急性免疫排斥反应及慢 性的免疫毒性反应。有研究证实人血清中的抗a -Gal抗体既与α -1，3GT催化的Gal抗 原（糖蛋白）反应，也与iGb3S催化的Gal抗原（糖脂肪）反应。动物源性生物材料或异 种器官移植中Gal抗原的去除成为降低免疫排斥和慢性免疫毒性反应的关键。目前，如何 评价Gal抗原的去除和残留Gal抗原诱导的免疫毒性尚存在着瓶颈。由于野生型低等动物 都表达a-Gal抗原，因此无法利用野生型低等动物去评价a-Gal抗原相关的免疫毒性反 应，只能用狒狒作为受体来考察a -Gal抗原阳性或者异体器官的免疫毒性反应，而这种动 物稀少很难普及使用。因此，如何评价动物源性生物材料或异种器官组织的免疫毒性存在 着瓶颈。检测与监管机构因没有方法和标准可依据而无法进行有效的安全性和质量监控， 同时也限制了该类产品的研发和产业化发展。
[0004] 国际上早在90年代就有通过构建a-l，3GT基因敲除小鼠，来研究a-Gal相关的 免疫学反应，探讨不含Gal抗原的克隆动物的构建方法和可行性。早在1996年，RG Tearle 等报告了 a-l，3GT基因敲除小鼠模型的成功制作方法，为a_l，3GT基因敲除克隆猪的 构建开辟了先锋。之后开始有报告使用a-1，3GT基因敲除小鼠模型研究其与人所诱导抗 体的相似性及其免疫学特征。Chiang TR等报告，a-l，3GT基因敲出小鼠免疫后诱导的 抗-Gal抗体与a -Gal结合的亲和性和人的抗Gal抗体相似，是能够诱导Gal抗原阳性异 种心脏补片的超急性免疫排斥反应。Chong A等报告，a_l，3GT基因敲除小鼠能够诱导自 然的抗a -Gal IgM和IgG，并呈现周龄依存性增强；在同种异体或异种补片移植后可以观 察到T-cell依存性的抗a -Gal抗体反应。这些研究提示α -1，3GT基因敲除小鼠模型对 Gal抗原残留诱导的免疫毒性具有敏感的反应性。
[0005] a -Gal抗原引起的超急性免疫排斥反应和慢性免疫毒性的克服方法得到了深入 研究。许多实验室采用了不同的方法对供器官或细胞进行处理，其中以酶处理法、物理化学 分离法及交联法和基因改造等方法的研究最广泛。在2000年初研究者们开始了 a_l，3GT 基因敲除猪的研究，甚至a-l，3GT基因敲除牛的研究，期望能够直接从a_l，3GT基因敲除 猪或牛获得没有Gal抗原的组织或器官，以避免动物源性生物材料及异种脏器移植的免疫 排斥反应。Dai Y及Lai L等报道，他们运用核转移技术成功培育出了 a_l，3GT基因敲除 猪（GT/KO pig)。实验研究显示a-l，3GT基因敲除猪来源的生物材料能够显著减轻Gal抗 原诱导的超急性排斥反应。
[0006] 国内关于a-l，3GT基因敲除动物模型的研究也已起步，但进展缓慢，大部分研究 都还停留在打靶载体构建或胚胎细胞重组的阶段。关于iGb3S基因敲除动物的研究未见报 道。第三军医大学的张伟在博士论文中曾记述了 C57BL/6J小鼠胚胎干细胞的a-l，3GT基 因敲除的工作，成功获得了 a-1，3GT基因敲除的小鼠胚胎干细胞。作者周建在林爱星导师 的指导下曾进行了"猪体细胞a -1，3-半乳糖基转移酶基因的敲除并敲入HLA-G1基因的 研究"，获得敲除a _1，3GT并敲入HLA-G1基因的体细胞。在2011年，南方医科大学的郑道 山硕士研究生开展了 "利用启动子缺陷型打靶载体敲除五指山小型猪GGTA1 ( a -1，3GT)基 因"的研究。军事医学科学院野战输血研究所的作者常宏宇报道了利用正负筛选打靶载体 在猪肾细胞系PK-15细胞中敲除GGTA1基因，获得了杂合子GGTA1 (+/-)PK-15细胞。戴一 凡教授早在2002年在美国留学期间就在国际上率先发表了 a _1，3GT基因敲除猪的研究成 果。据报道戴一凡教授于2011年回到南京医科大学代谢疾病研究中心，率领团队开始了 a -1，3GT基因敲除猪的深入研究和育种繁殖，并很快成功迎来了首批转基因克隆猪的诞 生。
[0007] 有研究发现，a _1，3GT基因敲除的小鼠或者猪仍然表达a-Gal抗原，仍然能够 观察到轻度的免疫排斥反应。另外有研究已经证实人的组织器官中不表达活性的iGb3， 提示由iGb3S转移酶基因转写的iGb3含半乳糖基脂蛋白可能是动物源性材料移植于人 体时造成异种免疫排斥反应的另一种外源性抗原。Milland等的研究显示在a-l，3GT基 因敲除动物体内仍然表达低水平但有显著意义的Gal抗原。a -1，3GT基因敲除小鼠表达 iGb3S mRNA，更重要的是a-l，3GT基因敲除小鼠来源的抗体与iGb3S合成的脂肪骨架的 Gal a (1，3) Gal抗原反应。这一研究结果提示iGb3S合成的Gal a (1，3) Gal糖脂肪抗原可 能是造成异体移植慢性免疫排斥反应的主要原因。因此，Milland等认为a_l，3GT基因敲 除动物虽然避免了急性免疫排斥反应，脂肪连接的Gal抗原是异体移植后期慢性免疫排斥 反应的根源。有学者开始研究iGb3介导的免疫反应以及iGb3S缺损模型动物的免疫学变 化。
[0008] 然而，上述的一些研究也只限于个人的实验室研究范围，国内还没有具有自主知 识产权的iGb3S基因敲除小鼠。而由于国际间技术壁垒的存在，在国内无法得到相关的模 型动物。针对现有技术的不足和缺陷，特提出本发明。
【发明内容】
[0009] 本发明的首要发明目的在于提出了一种制备iGb3S基因敲除的非人哺乳动物的 方法。
[0010] 本发明的第二发明目的在于提出该iGb3S基因敲除的非人哺乳动物的应用。
[0011] 为了实现本发明的目的，采用的技术方案为：
[0012] 一种制备iGb3S基因敲除的非人哺乳动物的方法，包括以下步骤：
[0013] (1)构建打靶载体：从基因组DNA中分离iGb3S基因，经长链PCR方法扩增获得同 源臂，与抗生素耐药基因复合构建打靶载体；
[0014] (2)将打靶载体转入到胚胎细胞，将重组胚胎细胞注入代孕动物胚胎中，移植到假 孕动物体内，与正常动物交配；
[0015] (3)对得到的嵌合体动物进行基因型验证，筛选基因成功敲除的阳性基因敲除的 嵌合体动物；进一步与野生型动物交配，获得F1代杂合子；F1代杂合子之间交配后获得两 条染色体均被剔出的纯合子动物，建系获得基因敲除动物种群。其制备方法的流程图如附 图18所示。
[0016] 本发明的第一优选技术方案为：所述的非人哺乳动物为小鼠，进一步优选C57BL 小鼠。
[0017] 本发明的第二优选技术方案为：所述的iGb3S基因敲除为敲除iGb3S基因的功能 性催化区第五外显子，其核苷酸序列如SEQ NO ID:1所示，全长687kb。
[0018] 本发明的第三优选技术方案为：所述打靶载体含有5'同源臂、耐药抗生素基因 NeoR-PA和3'同源臂，用NeoR-PA取代第5外显子。
[0019] 本发明的第四优选技术方案为：耐药抗生素基因 Ne0R-PA5'端和3'端的同源臂序 列取自小鼠第四条染色体上iGb3S基因第五外显子的5'端和3'端，分别为8. 3kb和9. lkb。
[0020] 本发明的第五优选技术方案为：构建打靶载体的步骤为：
[0021] (1)从正常C57BL/6J小鼠分离基因组DNA，扩增第5外显子5'端Cl(586bp)、 A(547bp)和 3' 端 B(486bp)、C2(585bp)片段，分别连接到 pBlunt 载体；
[0022] (2)将酶切鉴定、测序正确的A和B片段依次连接到pL452载体得到 pL452-iGb3S-A-B，同时，通过Overlap PCR将测序正确的Cl、C2片段融合后连接到 pDTA-Down 载体上；
[0023] (3)将连接正确的 pL452-iGb3S-A-B 用 EcoRV 酶切，pL452-AB 切出 2880bp、2885bp 两条带，回收目的片段A-NeoR-B，电转含pBCTG的BAC菌进行重组；菌落PCR检测A-NeoR-B 片段重组BAC，鉴定扩增条带正确；
[0024] (4)pDTA-down-iGb3S-C 的线性化处理，即 EcoRV 酶切处理 pDTA-Down-iGb3S-C， 回收目的条带，电转已经重组了 NeoR的iGb3S的BAC菌；pDTA-iGb3S-C拯救iGb3S-NeoR BAC (AmpR+KanR);对C拯救后的菌落进行PCR检测鉴定，将重组正确克隆进行扩增，经 Stbl3纯化后酶切验证。
[0025] 本发明的第六优选技术方案为：步骤（2)包括以下步骤：制备不育雄鼠和假孕母 鼠；超排卵；收获受:精卵；目的DNA的制备；将目的DNA导入受：精卵；受:精卵的移植；首建鼠 中目的DNA整合情况的检测；通过杂交繁育基因剔出小鼠种系。
[0026] 本发明还涉及来自基因敲除动物的精子、卵细胞、受精卵、胚胎、子代、组织或细 胞。
[0027] 本发明还涉及基因敲除的非人哺乳动物或来自基因敲出动物的精子、卵细胞、受 精卵、胚胎、子代、组织或细胞在生物源性材料中的应用；所述生物源性材料包括动物源性 或取自人体的，所述的动物源性生物材料不包括灵长类动物；所述的动物源性生物材料的 种类包括取自动物体内的各种组织、脏器及其衍生物，或者由组织或脏器制备的各种材料； 所述的灵长类动物特指古世纪猴、狒狒。所述的应用包括在免疫学研究、免疫毒理学、免疫 排斥反应及其机理的研究、安全性评价中的应用，所述的安全性评价包括生物源性材料在 临床试验前的安全性评价。
[0028] 所述的iGb3S基因敲除为敲除iGb3S基因的功能性催化区第五外显子，其核苷酸 序列如SEQ NO ID:1所示。全长688kb，其核苷酸序列为：
[0029] 7728 gta cctggagaag
[0030] 7741 tacctggaac acttcctggt atcggcagag cagcacttca tggtcggcca gaacgtggtg
[0031] 7801 tactatgtgt ttacggatcg cccggaagca gtgccctatg tggctctagg ccagggtcgc
[0032] 7861 ctgctgcggg caaaacccgt gcagcgagag aggcgctggc aggacgtgtc catggcacgc
[0033] 7921 atgcccacgc tacacgaggc tctgggaggg cagctgggcc aagaagctga ctttgtgttc
[0034] 7981 tgcctggacg tggaccagta cttcaccggt aacttcgggc ctgaggtgct ggcagatttg
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[0036] 8101 gacaagcgat cggctgctgc gctgtcgtta agcgaaggcg atttctacta ccacgctgcg
[0037] 8161 gtgtttggcg gcagtgtggc tgcactgctc aagctgacgg cccactgtgc gactggccaa
[0038] 8221 cagctggacc ataagcgcgg cattgaggca ctctggcacg acgaaagcca ccttaacaag
[0039] 8281 ttcttctggc tgaacaagcc caccaagctg ctgtcgcctg agttctgctg ggcagaggaa
[0040] 8341 attatctgga ggagagagat ccatcaccca cgcctgctct gggcacccaa ggaatatacg
[0041] 8401 ctggtgcgaa actag
[0042] 下面对本发明的技术方案做进一步的解释和说明。
[0043] 本发明涉及一种制作基因敲除动物模型的方法，以及该动物模型在多种生物源性 材料（动物源性、取自人体的）、组织或器官的免疫学研究、免疫排斥反应及其机理的研究、 临床前安全性评价（如免疫学评价、植入实验等）中的用途；以及由该模型动物衍生出来的 细胞、组织、器官及胚胎在上述领域中的用途。
[0044] 本发明的动物模型被人为地剔出了 iGb3S基因的功能性催化区第5外显子。利用 了细菌人工染色体同源重组技术，以抗生素耐药基因和附加在5'端（上游）与3'端（下 游）的同源臂构成打靶载体，替换iGb3S基因的功能性催化区第5外显子。实施该发明的途 径主要包括打靶载体构建、重组胚胎细胞克隆和囊胚显微注射。首先从C57BL小鼠的基因 组DNA中分离iGb3S基因，经长链PCR方法扩增获得同源臂，再与抗生素耐药基因复合构建 打靶载体；从C57BL小鼠的胚胎中分离胚胎细胞，短期扩增培养后用于打靶载体的电转，筛 选、获得阳性胚胎细胞克隆；经显微注射方法将重组胚胎细胞注入鼠胚胎中，然后移植到假 孕鼠体内；获得黑斑状嵌合体小鼠；进一步与野生型C57BL小鼠交配，获得F1代杂合子；利 用分子生物学方法对得到的F1代杂合子小鼠进行基因型验证，筛选基因成功敲除的阳性 基因敲除的杂合子小鼠；F1代杂合子之间交配后获得两条染色体均被剔出的纯合子小鼠； Southern Blot方法进彳丁基因型鉴定后，建系犾得基因敲除动物种群。在此基础上，可以进 一步获得该动物模型的细胞、器官及胚胎。
[0045] 具体的，本发明提出了一种从小鼠基因组中剔除了 iGb3S基因的功能性催化区第 5外显子的啮齿类基因敲除动物的制作方法。本发明所用的iGb3S基因全长约10kb，基因 序列选自C57BL/6J小鼠第4染色体基因组DNA。iGb3S基因含有5个外显子，其功能性催 化区位于第5外显子。本发明所构建的打靶载体长度为25. 2kb，如图1所示，含有5' (上 游）同源臂（8. 3kb)、NeoR-PA(7· 34：3bp)和 3' (下游）同源臂（9. lkb)。用 NeoR-PA 取代 第5外显子。
[0046] 与文献报道的不同：文献 Normal development and function of invariant natural killer T cells in mice with isoglobotrihexosylceramide(iGb3)deficiency (PNAS, 2007, 104(14)5977-5982)利用 Cre-介导的 loxP-NeoR 选择盒（PGK-gb2-neomycin selection cassette (neo) symbolize loxP sequences)剔除第 5 外显子，重组完成之后脱 掉NeoR序列，其不意图如图2所不。最上端为野生型基因位点（WT locus)，含有1?5个 外显子（Exonl-5);插入的抗生素耐药基因（neo, PGK-gb2_neomycin selection cassette) 取代了外显子5和部分3'端序列；打靶载体包括上游同源臂（含2?4外显子），抗生素 耐药基因序列和下游同源臂；重组完成后脱掉neo序列（recombined locus)。
[0047] 通过显微注射（Microinjection)生产基因敲除动物的过程包括以下步骤：制备 不育雄鼠和假孕母鼠；超排卵；收获受精卵；重组胚胎细胞的制备；将重组阳性的胚胎细胞 导入受精卵；受精卵的移植；嵌合体小鼠的获得，进一步与野生型小鼠交配，获得杂合子小 鼠（首建鼠）；首建鼠（Founder)中重组DNA整合情况的检测；通过杂交繁育基因剔出小鼠 种系。
[0048] 本发明获得的首建鼠具有新的表型。一般生命指征正常，生长发育正常。由于 iGb3S基因剔除动物模型的报道极少，其表型特征有待进一步观察。
[0049] 采用如下方案交配建系：对于雌性嵌合体小鼠（图7)则与正常雄鼠交配，选择周 龄在10周，具有交配经历、身体健壮的C57BL小鼠与之交配。同居1周后开始检查受孕情 况，如果发现怀孕即将雌鼠单独饲养，直至生产。如果为雄性嵌合体小鼠，则选择8周以上， 健壮的雌鼠与之交配。每一只纯合子小鼠的后代单独标记，作为一个系对待。检测发现基 因剔出能在后代中稳定遗传，每窝产仔数量与正常小鼠无异，一般能成功喂养，少有吃仔等 母性不良现象。这些有利特性为下一步大规模繁殖建系打下了基础。
[0050] iGb3S的基因水平表型鉴定采用iGb3S mRNA的RT-PCR鉴定法。iGb3S的蛋白质 水平表型鉴定采用alpha-Gal ELISA抑制法，利用其特异性抗体进行alpha-Gal抗原表达 的检测。alpha-Gal抗原的表达由alpha-GT(GGTAl)和iGb3S调控。由于iGb3S是催化合 成alpha-Gal抗原的基因之一，iGb3S基因表达的缺失将会导致alpha-Gal抗原表达的减 少。alpha-Gal ELISA抑制法采用alpha-Gal抗原的特异性抗体M86,先用M86与组织中的 alpha-Gal抗原反应，再进行离心分离未反应的剩余抗体；将剩余抗体通过alpha-Gal/BSA 固相抗原包被96孔板进行测定，以此计算与组织反应的alpha-Gal抗原的表达量。iGb3S 基因剔除动物的生命周期与野生型动物无显著差异，未见生命周期不同的报道。本发明中， 首建鼠的生命周期未见缩短现象，且一般状态正常。
[0051] 本发明涉及制作基因敲除动物模型的方法，以及该动物模型在多种生物源性材料 (动物源性、取自人体的）、组织或器官的免疫学研究、免疫排斥反应及其机理的研究、临床 前安全性评价（如免疫学评价、植入实验等）中的用途；以及由该模型动物衍生出来的细 胞、组织、器官及胚胎及其在上述领域中的用途。
[0052] 本动物模型被人为地剔出了 iGb3S基因的功能性催化区第5外显子。目前，没有 人研究用来作为动物源性生物材料安全性评价和质量控制的一种工具和方法；国内还没有 具有自主知识产权的iGb3S基因敲除小鼠，国内无法得到相关的模型动物；除此之外，还有 许多研究利用a-Gal能够诱导人体超急性免疫反应的特性将其用于肿瘤的免疫治疗，自 体肿瘤疫苗：将自体肿瘤细胞，如血液肿瘤细胞、固体肿瘤细胞膜，与神经氨酸酐酶、尿嘧啶 核苷二磷酸半乳糖和重组Q-1.3GT共培养。本发明利用同源重组技术以及胚胎干细胞技 术构建稳定遗传的iGb3S基因敲除小鼠，用于动物组织Gal抗原相关的免疫学研究和免疫 排斥机理的研究；动物源性生物材料的免疫毒理学研究、再生修复医学研究；同时还可用 于癌症治疗的免疫学研究。
[0053] 说明书附图：
[0054] 图1为iGb3S基因打靶位点示意图，标出了与全基因拼接相关的酶切位点和重组 验证用探针的位点；
[0055] 图2为【背景技术】中文献报道打靶位点示意图；
[0056] 图3为打靶载体pDTA-iGb3S-A-B_C酶切验证的电泳图；
[0057] 图4为打靶载体pDTA-iGb3S-A-B_Cl号质粒大提后酶切验证的电泳图；
[0058] 图5为重组ES细胞经探针1的Southern Blot确认阳性克隆电泳图；
[0059] 图6为重组ES细胞经探针2的Southern Blot确认阳性克隆电泳图；
[0060] 图7为嵌合体小鼠照片；
[0061] 图8为iGb3S(+/_)杂合子小鼠（首建鼠）照片；
[0062] 图9为杂合子小鼠基因型鉴定高保真PCR引物设计图；
[0063] 图 10 为 iGb3S-WT-F/WT_R 高保真 PCR 电泳图；
[0064] 图11为Gb3S-Neo_F/WT-R高保真PCR电泳图；2、3、7号为阳性克隆；
[0065] 图12为iGb3S(-/_)纯合子小鼠照片；
[0066] 图13为纯合子小鼠基因型鉴定高保真PCR扩增基因片段的电泳图；
[0067] 图14为Southern blot筛选策略的示意图；
[0068] 图 15 为基因组 DNA 经 5' Probe 的 Southern Blot 图；
[0069] 图 16 为基因组 DNA 经 3' Probe 的 Southern Blot 图；
[0070] 图17为iGB3S mRNA的RT-PCR检测结果图；
[0071] 图18为本发明制作基因敲除动物模型的流程示意图。
[0072] 本发明的【具体实施方式】仅限于进一步解释和说明本发明，并不对本发明的内容构 成限制。
【具体实施方式】
[0073] 实施例1
[0074] 1、打靶载体的构建
[0075] 1. 1从正常C57BL/6J小鼠分离基因组DNA，然后采用PCR方法分别扩增第5外显 子5'端Cl(586bp)、A(547bp)和3'端B(486bp)、C2(585bp)片段，A和B片段分别位于外 显子5催化功能区的5'端和3'端，C1和C2片段分别位于A片段的5'端和B片段的3' 端。
[0076] 打靶位点示意图如图1所示：基因序列选自C57BL/6J小鼠第4染色体基因组 DNA(GRCm38. pi C57BL/6J，NCBI Reference Sequence:NC_000070. 6)。剔除基因部分位 于外显子5,其长度为第5外显子催化区全长687bp加上5' (上游）端的255bp，全部长度 为942bp。本发明所用打靶载体长度为25. 2kb (图1-A)，含有5' (上游）同源臂（8. 3kb)、 NeoR_PA(7. 343bp)、3' (下游）同源臂（9. lkb)。
[0077] 克隆A片段的引物序列如SEQ NO ID: 2和SEQ NO ID: 3所示；
[0078] SEQ NO ID:2 的核苷酸序列为：CGATGGTACCGATATCACAGAATCTTTCTCTGTTTTC ;
[0079] SEQ NO ID:3 的核苷酸序列为：CGATGAATTCCATATGCAGGGTTTCTCTGTGTAGCC ;
[0080] 扩增体系和条件如表1所示：
[0081] 表1:
[0082]
[0083]
【权利要求】
1. 一种制备iGb3S基因敲除的非人哺乳动物的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 构建打靶载体：从基因组DNA中分离iGb3S基因，经长链PCR方法扩增获得同源臂， 与抗生素耐药基因复合构建打靶载体； (2) 将打靶载体转入到胚胎细胞，将重组胚胎细胞注入代孕动物胚胎中，移植到假孕动 物体内，与正常动物交配； (3) 对得到的嵌合体动物进行基因型验证，筛选基因成功敲除的阳性基因敲除的嵌合 体动物；进一步与野生型动物交配，获得F1代杂合子；F1代杂合子之间交配后获得两条染 色体均被剔出的纯合子动物，建系获得基因敲除动物种群。
2. 根据权利要求1所述的制备iGb3S基因敲除的非人哺乳动物的方法，其特征在于，所 述的非人哺乳动物为小鼠，进一步优选C57BL小鼠。
3. 根据权利要求1所述的制备iGb3S基因敲除的非人哺乳动物的方法，其特征在于， 所述的iGb3S基因敲除为敲除iGb3S基因的功能性催化区第五外显子，其核苷酸序列如SEQ NO ID: 1 所示。
4. 根据权利要求1所述的制备iGb3S基因敲除的非人哺乳动物的方法，其特征在于， 所述打靶载体含有5'同源臂、耐药抗生素基因 NeoR-PA和3'同源臂，用NeoR-PA取代第5 外显子。
5. 根据权利要求1所述的制备iGb3S基因敲除的非人哺乳动物、子代、胚胎或细胞的方 法，其特征在于，耐药抗生素基因 NeoR-PA5'端和3'端的同源臂序列取自小鼠第四条染色 体上iGb3S基因第五外显子的5'端和3'端，分别为8. 3kb和9. lkb。
6. 根据权利要求2所述的制备iGb3S基因敲除的非人哺乳动物的方法，其特征在于，构 建打靶载体的步骤为： (1) 从正常C57BL/6J小鼠分离基因组DNA，扩增第5外显子5'端C1片段、A片段和3' 端B片段、C2片段，分别连接到pBlunt载体； (2) 将酶切鉴定、测序正确的A和B片段依次连接到pL452载体得到pL452-iGb3S-A-B， 同时，通过Overlap PCR将测序正确的Cl、C2片段融合后连接到pDTA-Down载体上； (3) 将连接正确的 pL452-iGb3S-A-B 用 EcoRV 酶切，pL452-AB 切出 2880bp、2885bp 两 条带，回收目的片段A-NeoR-B，电转含pBCTG的BAC菌进行重组；菌落PCR检测A-NeoR-B片 段重组BAC，鉴定扩增条带正确； (4) pDTA-down-iGb3S-C 的线性化处理，即 EcoRV 酶切处理 pDTA-Down-iGb3S-C，回 收目的条带，电转已经重组了 NeoR的iGb3S的BAC菌；pDTA-iGb3S-C拯救iGb3S-NeoR BAC(AmpR+KanR);对C拯救后的菌落进行PCR检测鉴定，将重组正确克隆进行扩增，经 Stbl3纯化后酶切验证。
7. 根据权利要求1所述的制备iGb3S基因敲除的非哺乳动物、子代、胚胎或细胞的方 法，其特征在于，步骤（2)包括以下步骤：制备不育雄鼠和假孕母鼠；超排卵；收获受精卵； 目的DNA的制备；将目的DNA导入受精卵；受精卵的移植；首建鼠中目的DNA整合情况的检 测；通过杂交繁育基因剔出小鼠种系。
8. -种来自权利要求1所述的基因敲除动物的精子、卵细胞、受精卵、胚胎、子代、组织 或细胞。
9. 一种如权利要求1所述的基因敲除的非人哺乳动物或如权利要求8所述的精子、卵 细胞、受精卵、胚胎、子代、组织或细胞在生物源性材料中的应用；所述生物源性材料包括动 物源性或取自人体的，所述的动物源性生物材料不包括灵长类动物；所述的动物源性生物 材料的种类包括取自动物体内的各种组织、脏器及其衍生物，或者由组织或脏器制备的各 种材料；所述的灵长类动物优选古世纪猴、狒狒。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的应用包括在免疫学研究、免疫毒 理学、免疫排斥反应及其机理的研究、安全性评价中的应用，所述的安全性评价包括生物源 性材料在临床试验前的安全性评价。
【文档编号】A01K67/027GK104120147SQ201410313280
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年7月2日 优先权日:2014年7月2日
【发明者】徐丽明, 邵安良, 范昌发, 单永强, 陆艳, 章娜, 杨昭鹏, 林永亮, 徐斌 申请人:中国食品药品检定研究院