专利名称：乙酰肝素酶缺陷的非人类哺乳动物的制作方法
技术领域：
本发明与至少拥有一个受干扰的乙酰肝素酶等位基因片段的细胞和非人类哺乳 动物有关。本发明还与使用乙酰肝素酶(Hpse)缺陷的非人类哺乳动物进行医疗药品筛选有关。
背景技术：
乙酰肝素酶是一种哺乳动物体内产生的β -糖苷降解酶，专门用于降解肝素和硫 酸乙酰肝素(HS)蛋白多糖，因此与细胞表面和细胞外基质功能有密切联系。乙酰肝素酶活 动与肿瘤细胞的转移有关，因为乙酰肝素酶降解细胞间质(ECM)的HS，从而导致ECM的结构 改变，因而促进肿瘤细胞的转移。与之类似，乙酰肝素酶活动与血管形成、炎症和自身免疫 有关，参与血管内皮细胞的活动和免疫细胞的激活及运动。现有结果确定，乙酰肝素酶表达 量与肿瘤血管生成和癌症病人的存活率有关。尽管之前有关于多种哺乳动物肝素/HS降解内切酶(endoglycosidase)的报道， 目前研究的结果显示哺乳动物细胞只表达一个具有活性的乙酰肝素酶(Hulett等，Nat med.，1999，5 :803-809 ；Vlodavsky 等，Nat Med.，1999，5 :793-802)。由于乙酰肝素酶在哺乳动物体内从生理学功能(包括胚胎形成和发育)到多种疾 病(如炎性反应，血管再生和肿瘤转移)等基础生物现象中扮演了重要的角色，因此需要一 个动物模型对乙酰肝素酶进行活体研究。美国专利公报US2002/0194625表明转基因鼠表 达人类乙酰肝素酶用于研究肿瘤发生和病理过程。国际专利公报W02004/006949表明使用 乙酰肝素酶表达转基因鼠作为模型来测试乙酰肝素酶在毛发生长中多个方面的角色。由于乙酰肝素酶的重要性和多功能性，缺乏乙酰肝素酶的动物可以作为有价值 的工具来展现乙酰肝素酶所扮演的角色。尽管在这方面的需求得到广泛认同，并有多次 尝试建立乙酰肝素酶缺陷的动物，但是到目前为止这种动物还不存在。国际专利公报 W02005/118808表明利用小干扰RNA(siRNA)技术可以抑制细胞中的乙酰肝素酶活性。然而 很不幸，siRNA技术不适用于创造稳定的无乙酰肝素酶动物或者完全抑制乙酰肝素酶活性 的模型。所以对乙酰肝素酶缺陷的动物仍然有需求。
发明内容
本发明提供一个至少拥有一个受干扰的乙酰肝素酶等位基因片段的转基因非人 哺乳动物。在一个实例中，受干扰的乙酰肝素酶等位基因片段缺乏促进子和外显子1。更确 切的说，受干扰的乙酰肝素酶基因可能会缺少HindIII-Xbal片段。此发明包括受到干扰的 杂合子或纯合子哺乳动物。本发明还提供从上述非人类转基因哺乳动物中得到的细胞。另外，本发明提供了一种制作至少有一个受干扰乙酰肝素酶等位基因片段的转基 因非人类哺乳动物的方法，该方法包括在非人类哺乳动物胚胎干细胞中使用同源组合来敲除乙酰肝素酶基因的步骤；将得到的含有重组细基因的胞植入从动物体内分离的胚泡中； 将胚泡移植到假孕的非人类哺乳动物；移植的胚泡发育成为一个转基因非人类哺乳动物； 交配产生转基因非人类哺乳动物以繁殖后代；在后代中检测到拥有至少一个被干扰乙酰肝 素酶等位基因片段的非人类哺乳动物。在一个特定的实例中，乙酰肝素酶基因被删除部分 包括SEQ ID NO 1中的核酸序列。本发明还提供包含一个用于构建乙酰肝素酶核酸序列载体的质粒，在此载体中至 少一部分的乙酰肝素酶外显子序列被所选定的标记核酸序列所替代。在一个实例中，选定 的标记序列包含一个抗新霉素基因。另外，本发明提供一个筛选药品的模型，包含用至少拥有一个受到干扰的乙酰肝 素酶等位基因片段转基因非人类哺乳动物的步骤；如对上述的哺乳动物诱导疾病；然后在 该动物上筛选药品；从而通过该动物疾病的发展分析药物的作用。在一个实例中，给动物接 种肿瘤细胞或刺激造成炎症。上述的分析包括确定是否形成肿瘤转移或炎症反应程度。在 其它实例中，上述的疾病诱导包括实验性自身免疫脑脊髓炎。在其他一些实例中，上述的疾 病诱导剂可引起过敏反应。方法包括将结果与在其它非转基因非人类哺乳动物上实验的结 果进行比较。
本发明将根据实例和附带的数据进一步的详述。图IA显示设计的乙酰肝素酶基因(Hpse) 5’端的(指定为正常等位基因片段)和 被干扰的目标片段(指定为K/0等位片段)。同源组合造成第1外显子和促进子的消失并 被替换为一个neo基因。显示了在限制I或者ERv处理后的基因片段数量。编号 1 4的片段代表了可用于DNA印迹检测的探针。Neo的编码方向有所显示。图IB展示了用ERv切割后野生型(wt)、Hpsev_杂合型和Hpse+型的胚胎基因 DNA的DNA印迹分析。如图IA所示样品与3号探针进行了杂交。野生型(wt)胚胎只显示 了正常等位基因片段，杂合子胚胎同时显示了正常等位基因片段和变异等位基因片段，而 Hpsev-(KO)胚胎只显示了短的等位基因片段。图IC展示了乙酰肝素酶mRNA表达的PCR分析。RNA采集于野生型和Hpse-KO鼠 的肺和脾，并使用3对在不同区域用于放大Hpse基因的PCR引物进行了 PCR放大。在从野 生型中提取的样品中检测到了 Hpse表达，而在Hpse-KO样品中没有。L-19用来做内标。图ID展示了乙酰肝素酶活性分析实验。从4个野生型鼠和4个Hpse-KO鼠提取 的血液样本使用同位素硫(35S)标记的ECM进行了孵化(16h，37°C，pH 6.2)。同位标记的 降解物被释放到培养基中并6B进行了凝胶过滤分析。只在从野生型鼠提取 的样品中发现了乙酰肝素酶活性，Hpse-KO鼠中没有发现乙酰肝素酶活性。图IE展示了 HS降解分析实验。从野生型和Hpse-KO鼠摘取的肝、肾和脾组织勻 浆高速离心后，取上清与3H-Eicetyl标记的HS进行了孵育(18h，37°C，pH 5. 8)。反应后的 混合物用Superose-12进行了凝胶层析。A图显示空白(第一个峰)和阳性对照样品(被 重组肝素酶完全降解的样品；第二个峰)。B，C，D图显示Hpse-KO组织提取物(线)孵育 得到与空白对照(A图显示)同样的结果，表示没有发现乙酰肝素酶活性；野生型提取组织 的孵育显示明显的乙酰肝素酶活性(点线)，与重组乙酰肝素酶孵育后的图形(A图显示)一样。图2展示了来源于野生型鼠(点线)和Hpse-KO鼠(线)的HS分子结构对比。由 肝脏(图A和B)和肾脏(图C和D)提取的用同位素硫(35S)标记的HS链进行了 Superose 12凝胶层析分析。图A和C显示了硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)的分子结构，图B和D显示了 HS链的分子结构。图3展示了野生型鼠和Hpse-KO鼠乳腺形态的对比。3个月未受精雌鼠的乳腺组 织切片用苏木精(hematoxylin)染色。与相同年龄的野生型动物的组织相比较(上图)， Hpse-KO的乳腺(下图)显示丰富的侧枝和腺泡结构。图4A展示了在主动脉环模型中生长因子诱导的血管内皮芽。Hpse-KO和野生型鼠 的主动脉环受到了 FGF-2的诱导后6天生出血管芽。固定后，用0. 02%结晶紫溶液染色并 评估血管出芽量。Hpse-KO主动脉环(下图)比野生型主动脉环(上图)的出芽量高。图4B展示了用Matrigel plug试验血管再生。Hpse-KO (下图)和野生型(上图) 鼠皮下注射了 200μ 1只含80ng/ml FGF-2 (不含其它生长因子)的Matrigel。7天后，切出 植入的Matrigel并拍照。然后Matrigel勻浆后使用Drabkin试剂对血红蛋白进行分析。 与野生型鼠对比，Hpse-KO的血管生成反应更明显(Hpse-KO :55. 57士7. 18mg/dl ；野生型 26 士 4. 8mg/dl ；ρ ( 0. 0002)。图5Α展示了 MMP表达的实时定量PCR分析结果。从野生型鼠和Hpse-KO鼠的肾 脏、肝脏和乳腺中提取RNA，使用实时定量PCR分析ΜΜΡ-2、ΜΜΡ-9、ΜΜΡ-14和ΜΜΡ-25的表达。 野生型组织中每个MMP的表达程度都定为100% (黑色柱体)，测量得到的Hpse-KO的表达 量表现为与之相比较的百分比(白色柱体)。每个分析都重复进行了 6次，平均值表示为 +/-SD。图5Β展示了通过蛋白质印迹分析ΜΜΡ-2和β联蛋白(β-Catenin)表达的结果。 从肝脏、肾脏和乳腺的组织提取的组织勻浆电泳分离后，用ΜΜΡ-2单克隆抗体(mA801B ；上 图)，β联蛋白(mAbeiOlM;中图)，或α微管蛋白(B-5_l_2 ；下图)做的蛋白质印迹分析结果。图5C显示了 β联蛋白染色。固定并石蜡包埋的肾组织用抗β联蛋白抗体染色。 与从野生型得到的样本相比从Hpse-KO得到的肾样本有更强的染色。图6展示了乙酰肝素酶转染的人乳腺癌细胞(MDA-231)中多种MMP的表达。图6Α 显示MDA-231细胞分别表模拟转染的空(质粒)载体、活性乙酰肝素酶(Hpse)或突变的乙 酰肝素酶(mut-Hpse)基因。mRNA表达量由实时定量PCR测出。空(质粒)载体转染细胞 的mRNA表达量定为100%，Hpse和mut-Hpse转染细胞的表达量以与空(质粒)载体转染 细胞的百分比形式表达。图6B显示了数种MMP在这三个细胞株中的表达。在活性乙酰肝 素酶转染的细胞中发现ΜΜΡ-2、MMP-9、MMP-14的表达量减少，而此变化在转染带有突变的 乙酰肝素酶的细胞中没有看到。图7展示了在脂多糖(LPQ刺激后小鼠腹腔液中细胞分布。成年动物(每5个一 组)在腹腔内注射溶解在100 μ 1 PBS中的10 μ g LPS。16小时后将动物杀死并用IOmlPBS 冲洗腹腔。对腹腔中发现的细胞进行了计数。图8总结了伤口处的血管再生。野生型、Hpse-KO和Hpa-tg鼠麻醉后，剃毛，并在 背部做了 Icm长、全皮深的切口。切口用氰基丙烯酸盐胶封闭并在术后第1、3、7天用MRI进行检查。
具体实施例方式本发明的目的是提供用转基因手段消除或减弱乙酰肝素酶基因的细胞株和动物。 干扰手段引起乙酰肝素酶基因的部分或全面消除，比如在乙酰肝素酶基因上的关键位点 引入突变，导致该基因不能表达或不能生产有活性的功能蛋白。对乙酰肝素酶基因进行干扰可通过多种方式实现，比如同源组合、突变、cre/lox 技术、反义技术和转位子反转录转座子技术。用同源组合技术通常的方法是用一个标记基因，如抗生素抗性(新霉素抗性) 基因干扰一个正常的靶基因。将标记基因整合到目标基因的转录单位可起到干扰靶基 因的表达，同时为筛选有同源组合的细胞提供了手段。其中一个例子为新霉素选择质粒 (loxP-PGK-gb2-neo-loxP)，可从 Gene Bridges GmbH 获得。
在一个实例中，同源组合被用于淘汰Hpse基因。为了实现这个目的，设计了 一个 两端为与Hpse基因同源的DNA序列，中间是新霉素抗性基因的一个线性质粒结构用于感染 非人类哺乳动物胚胎干细胞。在细胞培养皿中加入抗生素来选择发生了同源组合的细胞。 然后同源组合的干细胞被注射到分离出来的胚泡中并植入假孕的非人类哺乳动物中。在同 源组合导致一个Hpse等位片段失活后，两代或更多选择性繁殖将提供Hpse基因的两个等 位基因同时被干扰的无Hpse非人类哺乳动物。本发明提供转基因非人类哺乳动物包括啮齿类动物，如老鼠、天竺鼠和小鼠， 在这些动物上乙酰肝素酶的基因编码被干扰。导致上述的动物部分缺乏、选择性缺乏或完 全缺乏有活性的乙酰肝素酶。鼠的乙酰肝素酶基因有12个外显子，为了使乙酰肝素酶的基因进入休眠状态可 将它们删除。但是，有些外显子可能不是活性的必要元素，删除它们只会使乙酰肝素酶部分 失活，这种导致乙酰肝素酶不完整失活的删除称为减弱删除。用一个结构来删除多于一个 外显子是提供无Hpse或减弱Hpse动物的一种选择。该技术的困难在于会增加需要删除的 序列的长度。在能提供无Hpse或减弱Hpse动物的结构中，首选外显子2和3的删除、外显 子4的删除、外显子5到9的删除、外显子10的删除、外显子11或12的删除。最佳的结构 为选择促进因子和外显子1的删除。一个特定实例提供了一个转基因Hpse敲除鼠，该鼠的Hpse基因的外显子1被完 全删除且促进因子也被部分删除。在一个更具体的实例中，Hpse基因缺少HindIII-XbaI限 制片段，该片段拥有的一个核酸序列在SEQ描述为ID NO :1。该鼠乙酰肝素酶有功能缺陷。本发明的实例提供了拥有被干扰Hpse基因的转基因鼠和其制备方法。获得无 Hpse或Hpse减弱鼠的方法与干扰其体内指定基因的方法相同。简单的说，从鼠的染色体中 确认乙酰肝素酶的基因编码特征。根据基因构架，设计一个结构来删除基因不需要的部分， 是靠适当的质粒来实现的。在首选的结构中，促进因子的一部分和外显子1被删除。在一 个实例中，21Λ 31Λ的上游序列和41Λ 61Λ的下游序列被包含在loxp-neo-loxp质粒中 同系整合。大鼠的hpse基因只有5个外显子，其它推选的结构包括外显子2的删除、外显 子3的删除、外显子2和3的删除、外显子4或5的删除。结构可由基因作图和部分排序来 确认。将该结构注射到一个鼠的ES细胞中，再根据选用的标记来选择形成的克隆。对克隆进行同源整合检测，比如DNA印迹分析和/或PCR。有同源整合的ES克隆被注射到分离出 来的鼠胚泡中，然后将胚泡植入假孕的鼠中。最后繁殖的后代用于种系选择。杂交动物可 使用近亲繁殖的方式来获得纯种的后代。在另一个实例中反义技术和转位子反转录转座子技术，如长散在核元件(LINE) 可用于提供无Hpse的转基因非人类哺乳动物，特别是鼠类。按照本专利发明的转基因哺乳动物可与其他转基因非人类哺乳动物交配繁殖提 供其它转基因非人类哺乳动物。按照本发明产生的转基因非人类哺乳动物可用于建立乙酰肝素酶缺乏哺乳动物 细胞系。用于建立这种细胞系的方法是成熟的技巧。首选的细胞系包括胚胎干细胞和纤维 母细胞系。纤维母细胞系可作为乙酰肝素酶缺陷细胞株使用。Hpse基因目标干扰的成功可由已知的方法来分析。比如RNA印迹可用于确认乙 酰肝素酶mRNA表达的减量或缺失。其它已知的方法夜可用来确认乙酰肝素酶活性的缺失。本发明的转基因非人类哺乳动物可用于多种药品的测试。测试方法可包括将哺乳 动物暴露给疾病诱发因素后，向该动物注射相应需要测试的药物。然后就疾病的发展对该 哺乳动物进行分析。在一些实例中，本发明的非人类哺乳动物可用于检测抗乙酰肝素酶和/或抗癌药 物。一个典型的分析实验包括给无Hpse的动物接种如黑色素瘤、上皮癌或肝癌细胞等肿 瘤细胞作为疾病激发物。在接种后这些动物接受需要测试药品的治疗，通常按不同的间隔 时间和量进行腹腔内注射、尾静脉注射、喂食或鼻吸入。被测试药物在肿瘤转移(如肺或 骨)中的作用，经过与感染同样疾病同样年龄同样性别的野生动物进行比较。分析实验法 可用来确定被测药物的有效剂量。本发明的转基因动物，乙酰肝素酶的缺失可用一些MMP，特别是MMP2和MMP14的增 量表达来弥补。因此，一个特定的实例，使用此动物来评估抗MMP物质的药用潜力。由于MMP在多重硬化症、炎症和神经系统损伤中扮演着重要角色，本发明的一个 实例是关于使用无Hpse的动物来测试多重硬化症治疗药物的效果。为了实现这个目的，一 个已知疾病模型是实验性自身免疫性脑脊髓炎。针对多重硬化症可将本发明中的转基因非 人类哺乳动物暴露给Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein(MOG)肽和百日咳毒素(Shao et al.，Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2004,45 :4060-4065)。通过给药后对疾病的发展进 行评估，瘫痪数量的降低是药用潜力的标志。本发明的转基因非人类哺乳动物与相应的野生动物相比对炎症促进剂有强烈反 应(图7)，所以可用于筛选抗炎症药物。为了这个目的，无Hpse哺乳动物可暴露在下述多 禾中ISSi^帛牛莫M中:Carrageenan Paw Edema (CPE), Adjuvant-Induced Arthritis (ΑΙΑ), Collagen-Induced Arthritis(CIA), Mouse Ear Edema, intraperitoneal injection of lipopolysaccharide (LPS) and Air Pouch。然后对使用的抗炎症药物进行评估，减弱的炎 症反应是抗炎症潜力的标志。本专利的转基因非人类哺乳动物也可用于筛选用于促进伤口愈合的药物。在一 个实例中，分析实验法包括麻醉野生型、Hpse-KO和Hpa-tg鼠，剃毛，并在背部做了 Icm长， 全皮厚度的切口。切口用氰基丙烯酸盐胶闭合并在术后第1、3、7天分别测量伤口上皮边 缘的方法来检测伤口的复原情况。另外伤口液体可通过插入适当海绵，比如5立方厘米的polyvinyl海绵，的方法来采集。在插入海绵一定的时间，比如一天，后可将海绵拔出。然后 通过离心过滤的方法收集吸附在海绵中的液体，并对液体炎症因子使用如蛋白质印迹这样 的方法进行分析。伤口组织也可切片后用于组织染色分析。在实验分析中测试的伤口治疗 药物可在任意时间直接使用在伤口上或皮下注射。此外，本专利的转基因非人类哺乳动物显示出特定蛋白酶贮藏的增加。例如肥大 细胞蛋白酶-5和-6以及carboxylp印tidase A的贮藏。根据蛋白质印迹分析显示，这些 酶在无Hpse鼠中有所增加。这一结果显示了乙酰肝素酶在调节肥大细胞功能中的角色，特 别是对过敏反应的调节。因此转基因非人类哺乳动物可用于筛选用于抗过敏反应的药，也 可用作慢性过敏模型。用于对过敏药品的效果经过评估并与感染同样疾病的同年龄同性别 的野生动物进行比较。转基因鼠可繁殖并显示出正常的生命期限，没有明显病理变化，仅有一些细小的 改变(乳腺的过渡分枝，较强的血管再生反应)。对大脑、心脏、肝、肺、肾和脾等多个器官的 组织分析没有显示任何病理改变。因此，敲除乙酰肝素酶没有给动物造成伤害反而提供了 一个可以展示乙酰肝素酶在多个生理和病理环境中所扮演角色的平台，同时可以用来筛选 治疗用的药物。实施例1乙酰肝素酶缺陷小鼠的制作乙酰肝素酶缺陷的小鼠是通过干扰所选择的ES细胞中的基因制作的。目标载体 通过删除部分促进子(起始点上游大约500bp)和全部第一外显子(图1A)，来制作一个功 能缺陷的突变体。被删除部分的核酸序列展示在图SEQ ID N0:1，一个长达151Λ的乙酰肝 素酶的基因由一个鼠(U9/SV)基因组的噬菌体基因库(Stratagene，Cedar Creek, TX)中 分离出来。基因上游一段2. 5kb长的序列作为同源克隆的短臂，放入含有新霉素抗性基因 (neo)白勺pNT_Lox2质f立(由Dr. Peter Carmeliet,Department of Molecular and Cellular Medicine, Catholic University, Leuven, Belgium 提供)。外显子 1 下游的一段 4. 8kb 的 序列作为内源性基因的同源长臂。目标载体的总长约为14.5-1Λ。目标载体由限制酶Not I线性化并被电转到由Uppsala Transgenic facility提 供的胚胎干细胞(EQ中。也可选择其它ES细胞。显现新霉素抗性基因的ES克隆通过在 培养液中加G418(350yg/ml，Invitrogen，Carlsbad, CA)的方法来筛选，并使用DNA印迹 法来分析目标基因DNA的同源重组。简单来说从ES细胞中提取的染色体DNA由EcoR V或 Seal切割。产生的片段用0. 8%的琼脂糖凝胶分离后转到尼龙膜上，然后与32P标记的探针 进行杂交(见图1A)。筛选出400个具有抗新霉素抗性的ES克隆，其中只有两个克隆有Hpse基因中 的同源重组，而且没有在其它位点上发现有整合。这两个有同源重组的克隆被注入到由 C57BL/6受精鼠分离出来的胚胞中，然后移植到假孕的小鼠中。产生的雄性嵌合鼠与雌性 C57BL/6鼠进行了杂交，其中一个克隆表现出有性繁殖能力。此杂交小鼠后代近亲交配得到 Hpse缺失的纯合子鼠。对这种混合基因背景(U9/SvJ/Sv/C57BL/6)的小鼠进行了表型的 研究。全部动物实验按照瑞典和以色列国家动物实验协会的规定进行。鼠的后代用基因印迹法进行了分析(图1B)，结果显示没有早死现象。为了验证 Hpse基因已被完全干扰，使用实时PCR按照具体的参数对来自野生型和Hpse-KO鼠的组织中提取的乙酰肝素酶mRNA进行了检查。从脾和肺组织中用TRIzoI分理出RNA并用分光光 度法定量(约IOOmg)。用500ng的RNA和寡核苷酸引物反转录后的到的cDNA用于PCR进 行了放大。检测乙酰肝素酶表达的PCR条件是，94°C变性2分钟，然后是25个循环，包括变 性94°C 15秒，58°C退火1分钟，72°C延伸1分钟。扩增产物(10 μ 1)用1. 5%琼脂糖凝胶 电泳分离，溴化乙锭染色(Hy Labs, Rehovot, Isreal)。PCR中使用的引物在表1中进行了 总结。设计用来检测乙酰肝素酶基因的引物包括5_’端，中部，和3_’端区域。如图IC所 示，只在来自野生型鼠的样本中发现了乙酰肝素酶mRNA。
表1 用于检测Hpse mRNA的引物放大的基因/区域序列5’ -3，SEQ ID NO mHpse 5'顺向5 ‘ -CGACCGACGACGTGGTAGAC-3‘2mHpse 5'反向5' -GCAACAGCTCCTGGAAGGG-3‘3mHpse Middle顺向5' -TTTCTGAGCTCTGATGCGCTG-3'4mHpse Middle反向5' -TGGGCCTTTCACTCTTGACAG-3'5mHpse 3'顺向5 ‘ -ACTTGAAGGTACCGCCTCCG-3‘6MHpse 3，反向5 ‘ -GAAGCTCTGGAACTCGGCAA-3‘7L-19顺向5 ‘ -ATGCCAACTCTCGTCAACAG-3‘8L-19反向5 ‘ -GCGCTTTCGTGCTTCCTT-39确认乙酰肝素酶活性已被消除。用放射性同位素硫(35S)标记的ECM(图1D)或者 放射性同位素硫(35S)标记的可溶性硫酸肝素作为底物(图1E)对来自野生型鼠和Hpse-KO 鼠的4份血清样本和3份组织样本(肝、肾和脾)进行了乙酰肝素酶活性的分析。血清样 本用缓冲液(20mM phosphate-citrate, pH 6.2，含有 ImM dithiothreitol, lmMCaC12, and 50mM NaCl)按1 : 1进行稀释，然后与35S-标记的ECM进行孵育(16h，37°C )。收集培养 后，离心(20，000秘，41，11^11)，并用琼脂糖凝胶(^-68柱进行凝胶过滤分析。收集的洗脱 液(每管O.aiil)，用beta闪烁计数器进行分析，检测有mS-标记的HS降解片段。未降解 的HS蛋白多糖(HSPGs)从琼脂糖凝胶6B柱的死体积区洗脱出来(peak I，Kav < 0. 2)， 而HS降解片段从柱的Vt中洗脱出(peak II,0. 5 < kav < 0. 8)。此分析方法使用的ECM 表层皿的准备方式如下牛角膜内皮细胞培养液中加入放射性同位素硫(Na2[35S]04) (GE Healthcare Bioscience, Uppsala, Sweden)，在细胞培养的第一天和第五天分别加入两次 (25 μ β Ci/ml)。7到10天后在细胞培养皿中加入含有0. 5% Triton X-100的PBS和20mM NH4OH,将细胞单层溶解后，暴露ECM。然后使用PBS清洗四次，除去细胞残渣，而ECM没有受 到影响并坚固的附着在培养皿上。组织样本的分析用了四个月的野生型鼠和Hpse-KO鼠。动物杀死后，收集的器官立即置于 2ml PBS，pH7. 4，含有 1 % Triton X-100 和蛋白酶抑制(Sigma-Aldrich， St. Louis,MO)的缓冲液中勻浆。均浆被放在冰上30分钟，然后4°C，15，OOOrpm离心20min。 然后收集的上清用HiTrap肝素-琼脂糖凝胶柱(GE Healthcare Bioscience)纯化。在 使用IOml的PBS清洗后，用含有IM NaCl的PBS洗脱结合的蛋白质。蛋白质的总量由 Bradford方法测定。来源于洗脱物的50μ g蛋白质样本与5000cpm[3H]-acetyl标记的 HS，在 20mM phosphate-citrate, ImM DTT，ImM CaCl2, and 50mM NaCl, pH 5· 8 缓冲液中孵 育(37°C，过夜)。得到的最终产品使用琼脂糖凝胶12层析柱进行了分析(GE Healthcare Biosciences)0不论在任何实验分析系统中，没有在一个来自Hpse-KO鼠的样本中检测到乙酰肝 素酶活性，而来自野生型鼠的样本显现出了正常程度的乙酰肝素酶活性(图ID和E)。特 别是在血清样本中，通常由于血小板和白细胞的激活而释放出大量的乙酰肝素酶。如图ID 所示，来自野生型鼠的血液样本洗脱液第20-40管中含有大量的低分子物质，说明有高活 性乙酰肝素酶反应(图1D，Peak II)。Peak II中洗脱的标记物为HS的降解物，这些片 段比HSPk的完整HS链小5 6倍，而且不会被乙酰肝素酶进一步消化。相对而言，来自 Hpse-KO鼠的血液样品没有展示肝素酶活性，因为缺少HS降解产物(Peak II)，而只是在洗 脱液第5-10管中检测到高分子量的标记物质，即完整的HSPGs，由细胞外基质中蛋白酶降 解基质而产生。同样，来源于野生型鼠和Hpse-KO鼠器官组织样本的测试结果与血液样本 测试得到的结果相同。实施例2乙酰肝素酶缺陷鼠的表型分析纯合子突变的动物没有显示明显的异常表型，有正常生育能力和正常的生命周 期。为了检验是否有年龄相关的表型，6，12和18个月的鼠被杀死，其器官在96%乙醇、冰醋酸和3%水的溶液中固定。石蜡包埋的组织切片，由Hematoxlin&eosin染色。对来自 Hpse-KO鼠各个器官切片的组织学检查没有发现任何重大的异常。为了研究乳腺形态，来自三个月大的未交配过的雌性纯合子Hpse-KO鼠或野生型 鼠的整个乳腺在Tellys固定液(100111170% EtOH, 5ml福尔马林，5ml冰醋酸)中固定，组织 切片用Hematoxlin&eosin染色后，用自来水清洗(1个小时)，脱水并保存在水杨酸甲酯中。 未交配过的Hpse-KO鼠的乳腺显示出异常丰富的分支管道和早熟的腺泡结构，即一般在怀 孕的鼠中才会发生的情况(图3，下图)；而未交配过的野生型鼠乳腺则没有这种不正常的 发育。以前，在未交配过的超标达人肝素酶(hpa-tg鼠)转基因母鼠观察到过此现象，但是 与hpa-tg鼠不同，Hpse-KO鼠和野生型鼠的主要管道的宽度没有区别。为了检验乙酰肝素酶缺失和HS结构改变带来的后果，从15只野生型鼠和15只 Hpse-KO鼠中提取了血液样本(72小时禁食前后)。样本被用于分析蛋白质总量和肌酸酶 的含量、以及谷草转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)的活性。血液样本 用Kodak950检测。使用自动的Kodak250系统检测尿液样本(25 μ 1)中的蛋白质量和肌酸 酶含量。结果显示在野生型鼠和Hpse-KO鼠之间没有重大区别。另外血小板中乙酰肝素酶 含量较高，血液样本进行了凝血性能检测(APTT)。同样野生型鼠和Hpse-KO鼠之间没有重 大区别。以前报道称在肝脏的发育和再生过程中乙酰肝素酶活性比健康肝脏更明显。另外，本专利发明者最近的研究工作发现乙酰肝素酶有促进肝再生的作用(未发表的结果)。 因此，设想的是Hpse-KO小鼠肝脏在部分切除后，可能表现出响应较慢的再生率。野生型鼠 和Hpse-KO鼠G个动物每组)接受了部分肝切除。每只鼠都用MRI检查，以评估体内肝脏 大小。出人意料，两组动物在肝脏切除手术后的8天中没有观察到有任何重大不同。实施例3乙酰肝素酶缺陷鼠硫酸乙酰肝素结构的生化分析降解硫酸肝素是乙酰肝素酶的一个主要功能，因此对从被选择的内脏中分离出来 的HS进行了分析。野生型和Hpse-KO鼠腹腔内注射了 0. 5mCi Na235SO4 (specif ic activity 1，500Ci/mmol ；Perkin Elmer, ffaltham, MA)，动物容许自由接触食物和水45分钟。然后动 物被颈椎脱位法杀死并解剖。选择的器官组织在50mM Tris-HCLpH 7.4,1% (v/v)Triton X-100，4M urea，0. 25M NaCl含有蛋白酶抑制(Sigma-Aldrich)的缓冲液中勻浆，然后在 4°C孵育过夜。离心后，取上清加载于DEAE-kphacel层析柱，在50mM Tris-HCl, pH 7.4， 0.3M NaCl中进行分离。上样后，柱子用缓冲液多次清洗，然后使用同样的缓冲液加1. 5M NaCl 脱洗。洗脱液用 chondroitinase ABC (Seikagaku, Tokyo, Japan)禾口 benzonase (Merck, San Diego, CA)消化，然后进行脱盐，冻干。再次使用DEAE-kphacel来除掉降解的硫酸软 骨素和寡核苷酸。经过1. 5M NaCl洗脱的HSPG被用于进一步的分析。为了分析HS的分子结构，在琼脂糖凝胶12柱上进行了 HSPk和HS的凝胶层析， 用 50mM Tris-HCl, pH 7. 4，IM NaCl,0. 1% Triton X-100 进行了脱洗。为了分析 HS 的微 细结构，HS样本用亚硝酸在pHl. 5处理后，得到不同大小的寡糖片段，然后用NaB『H]4进行 还原反应。还原后的产品用生物胶P-10柱(Bio-Rad，Hercules, CA) (1x200cm)进行了分 离，用0.5M NaCl洗脱。一部分的亚硝酸降解产品用葡聚糖凝胶G-15柱进一步分离，并收 集双糖部分。由降解N-sulfated域而产生的3H or mS标记的双糖脱盐，浓缩后在HPLC系 统上用阴离子交换柱Partisil-IOSAX上进行了进一步分析。如预料的，Hpse-KO组织的HS链的分子量比野生型组织的HS高(图2)。另夕卜， Hpse-KO组织中分离出来的HS自由链的洗脱峰更窄和更勻称，意味着比野生型组织的HS有 较高的均一性。在来自野生型和Hpse-KO组织的HS样品没有磺基化程度的不同。实施例4乙酰肝素酶缺陷鼠中血管内皮细胞出芽的分析实验证明乙酰肝素酶在细胞转移和血管新生中起重要作用。所以，对乙酰肝素酶 基因敲除对内皮细胞迁移和萌芽生长的影响进行了评价。首先，应用体外主动脉环法。简单 讲，8只野生型和8只Hpse-KO鼠被杀死。主动脉被洗净后切1_2毫米厚的环。两个环嵌入 不含生长因子的三维Matrigel (BD Biosciences, San Jose，CA)，并在含有FGF-2 (50ng/ml， 0.5ml)的生物-MPM 中(Biological industries, Beithaemek, Israel)培养。这样的培养 在(37°0，8%0)2，潮湿的空气)维持了 6天，培养液和FGF-2每2天更换一次。培养过程中 每天都评估了血管出芽，为期6天，然后用4%的福尔马林将组织固定M小时，并用0. 02% 的水晶紫在乙醇中染色(Sigma-Aldrich)，用Nikon EclipseTS 100相差显微镜拍照。如所 期望的，FGF-2缺失的情况下，野生型或Hpse-KO环中只有少量出芽或没有出芽。用FGF-2 刺激后野生型和Hpse-KO环中出现了内皮发芽(图4B)。与野生型环相比，Hpse-KO环展现 的管形成更加明显(图4B，上、下图)，提示Hpse-KO对FGF-2的反应较高。
为了验证以上体外结果，我们进行了体内血管生成分析试验。在此模型中，小鼠皮 下注射200 μ 1不含生长因子的Matrigel。然后加入或不加入FGF-2 (80ng/ml)。7天后，切 出此Matrigel，拍照，在低渗裂解液中(250 μ 1 0. 1 % Bri j-35/plug)和用5000xg离心5 分钟。上清液用测量德拉布坎的试剂分析血红蛋白含量，以评估新血管生成。相对野生型 鼠而言，含有FGF-2的Matrigel在Hpse-KO鼠内引起了剧烈的血管生成反应，证实了体外 的结果。血红蛋白测定结果显示，在Hpse-KO鼠的Matrigel中血红蛋白是野生型鼠的2倍 (55. 57 士 7. 18mg/dl vs. 26 士 4. 8mg/dl ；ρ ( 0. 0002)。实施例5乙酰肝素酶缺陷鼠补偿性反应的分析Hpse-KO鼠乳腺腺体的异常形态和异常的新生血管形成能力引发了对这些表型 背后机制的调查。其中一个问题是其它ECM降解酶对缺乏乙酰肝素酶是否起了补偿作用。 Hpa2，一个与乙酰肝素酶基因有显著同源性(大约38% )但是无乙酰肝素酶活性的蛋白质 是调查的第一个对象。对Hpa2的分析在野生型和Hpse-KO鼠间没有发现任何的不同。另 外在Hpse-KO鼠中发现的未经降解的HS也不支持有另外的类乙酰肝素酶。考虑到蛋白酶，尤其是基质金属蛋白酶(MMP)，在调节细胞外基质的功能和结构 中发挥重要作用。因此，对几种选择的基质金属蛋白酶的表达由实时PCR进行了研究。对 从HPSE-KO和野生型鼠肾脏，肝脏和乳腺提取的RNA，使用相应的MMP-2，-3，-9，-14，-25 特异性引物进行了分析(表幻。实时量化PCR是由自动转子基因系统RG-3000A (Corbett research, Sydney, Australia)来完成的。PCR反应体系(20 μ 1)由 10 μ 1 QPCR SYBR green mix(ABgene,Epsom,UK),5y 1稀释后的cDNA和0. 3μΜ引物组成(每个样品做了 6个重复 管)。PCR的条件如下，初始变性步骤为95°C 15分钟。然后是40个循环，每个循环包括 94°C 15秒，57°C杂交30秒并在72°C延伸30秒。肌动蛋白被用来作为内参标准。图2 用来发现MMP表现的引子
权利要求
1.一种转基因非人类哺乳动物，所述转基因非人类哺乳动物具有至少一个缺损的乙酰 肝素酶等位基因。
2.如权利要求1所述的转基因非人类动物，其中，所述缺损的乙酰肝素酶等位基因缺 乏启动子和外显子1。
3.如权利要求2所述的转基因非人类动物，其中，所述缺损的乙酰肝素酶基因缺乏 HindIII-XbaI 片段。
4.如权利要求1 3中任一项所述的转基因非人类动物，所述动物就乙酰肝素酶基因 的缺损而言是纯合性的。
5.一种分离细胞，所述分离细胞源自权利要求1 4中任一项所述的转基因非人类哺 乳动物。
6.一种权利要求1所述的转基因非人类哺乳动物的制备方法，所述方法包括a)通过在非人类哺乳动物胚胎干细胞中的同源重组来删除部分乙酰肝素酶基因；b)将步骤a)中得到的细胞植入分离的胚泡；c)将所述胚泡移植至假孕的非人类哺乳动物内；d)让所述移植胚泡发育成转基因非人类哺乳动物；e)将所述转基因非人类动物育种以产生后代；和f)对所述后代进行筛选以鉴定出具有至少一个缺损的乙酰肝素酶等位基因的转基因 非人类哺乳动物。
7.如权利要求6所述的方法，其中，在a)中删除的所述部分包含SEQID N0:1所示的 核苷酸序列。
8.一种用于制备权利要求1所述的转基因非人类哺乳动物的载体，所述载体包含编码 乙酰肝素酶敲除构建体的核酸序列，其中所述乙酰肝素酶编码序列的一个外显子的至少一 部分被选择性标记物序列所替代。
9.如权利要求8所述的载体，其中，所述选择性标记物序列包含新霉素抗性基因。
10.一种治疗性药物候选物的筛选方法，所述方法包括a)提供权利要求1所述的转基因非人类哺乳动物；b)使所述哺乳动物接触疾病刺激物；c)对所述哺乳动物施用所述药物候选物；和d)对所述动物由所述疾病刺激物诱导的疾病的发展进行分析。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述疾病刺激物包含接种的肿瘤细胞，且所述步 骤d)包括确定任何肿瘤转移的形成。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述疾病刺激物是炎症刺激物，且所述步骤d)包 括确定任何炎症响应的水平。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述疾病刺激物诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎。
14.如权利要求10所述的方法，其中所述疾病刺激物诱导过敏反应。
15.如权利要求10 14中任一项所述的方法，所述方法还包括将所获得的结果与在野 生型非人类哺乳动物中获得的相应结果进行比较。
全文摘要
本发明涉及到细胞和至少有一个受到干扰的乙酰肝素酶基因的转基因非人类哺乳动物。本发明还涉及到利用非人类的乙酰肝素酶缺失哺乳动物和细胞筛选药物和筛选方法。
文档编号C12N15/85GK102056479SQ200980121892
公开日2011年5月11日 申请日期2009年4月9日 优先权日2008年4月11日
发明者乌尔夫·林达尔, 伊斯拉埃尔·弗洛达夫斯基, 埃亚·兹切拉, 李晋萍 申请人:乌普萨拉多糖研究股份公司