专利名称：分支杆菌的快速检测的制作方法
分支杆菌的快速检测本发明涉及样品中分支杆菌的快速检测方法和其试剂及试剂盒。作为结核感染(TB)的病原体(aetiological agent)，结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis) (Μ. tuberculosis)是世界范围传染病死亡的主要原 因——潜伏感染影响差不多三分之一的世界人口。世界卫生组织(WHO)估计全球每年几乎 九百万的新的TB病例和几乎二百万的死亡出现。2005年中最大数量的新的TB病例出现在 东南亚(全球34%的新发病例)，并且估计在撒哈拉以南非洲的发病率几乎为每100，000 人群中350例病例。然而，TB感染不限于发展中世界自从20世纪80年代后期，UK已经观察到结核 病的再现，并且目前每年超过8000例的新病例——每100，000人群中14. 0例的比例。大 约40%的这些新病例出现在伦敦地区，在这里的感染率为每100，000人群中44. 8例。高度 危险的人群包括一些移民群体、无家可归的人、犯人和问题药物使用者。TB感染通常通过抗生素的6个月过程可以治疗；然而，患者对药物治疗的依从性 改变，当它们的症状停止时患者通常停止治疗。另外，TB比例在移民人群中是高的，使得实 行跟进的治疗困难。如果不治疗，活性TB疾病的每个人将在每年平均感染10到15个人之 间。WHO认可的综合策略——称为“直接观察治疗短期过程(Directly Observed Therapy Short-course) “ (DOTS)是增加药物依从性和减少多药物抗性结核分枝杆菌菌株出现的一 种方法。该WHO方法的一方面集中能够进行和促进研究，认识到TB的消除将依赖于新的诊 断学、药物和疫苗。因为最佳的患者管理需要药物治疗的尽早开始和尽可能快地隔离感染的个体，所 以在现有技术中存在对快速和可靠的检测技术的需要。然而，传统的TB感染的诊断方法或是长时间(生物培养)的，或者潜在地缺少灵 敏性(抗酸性涂片镜检)。肺外TB的诊断由于使用已知技术获得足够的检测材料的困难性 而变得复杂。更具体地，检测分支杆菌的现有标准方法学需要熟练的技术人员并可能导致多达 八周的诊断结果延迟。当前的WHO指导方针推荐具有可疑TB的人提交至少三份痰样品(在 分开的场合产生)以增加检测活动性TB的可能性。为了通过萋-尼染色(Ziehl Neelsen staining)检测痰中的分支杆菌，需要每毫 升痰超过5，000个生物以通过光学显微镜看到杆菌。这样，“涂片”试验通常缺少灵敏度和 特异性。而且，在患有活动性肺TB的患者中，只有估计的45%的感染通过痰显微镜方法检 测到(Dye等人，2005)。分支杆菌的培养仍然是诊断和药物敏感性测试的金标准，并且可以检测少至每毫 升痰10个生物。然而，这种技术由于长的温育时间(多至数周用于诊断)和在野外执行的 困难性而受到妨碍(Kent和Kubica，1985)。结核分支杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex) (MTBc)包括五个 种结核分枝杆菌(M. tuberculosis)、田鼠分枝杆菌(M. microti)、牛分支杆菌(M. bovis)、 Μ. canetti和非洲分支杆菌(M. africanum)——它们是全世界范围内大多数结核分枝杆菌感染(TB)病例的病原体。在这些种之间的高水平的DNA序列同一性已经限制了使用DNA 序列在MTBc的成员之间进行区分。由于在诊断分支杆菌学领域中引入核酸扩增分析，所以已经发展了多种室内和商 业分析。作为实例，Roche AMPLICOR. MTB系统扩增所有分支杆菌共有的16S rRNA基因 序列的584-bp区域。目前检测和分型MTB复合群“MTBc”的分支杆菌的分子方法学包括转座因子 IS6110的扩增(Thierry等人，1990 ；Yuen等人，1995)。然而，基于IS6110的方法具有不佳 的再现性和不佳的灵敏度。在这方面，IS6110的拷贝数在MTBc的成员之间不同，并且似乎是菌株依赖性的 (Poulet和Cole，1995)。尽管MTBc的许多成员包含在整个基因组中分散的8_15个拷贝的 IS6110，但是大约40%的结核分枝杆菌菌株仅具有该因子的一个或两个拷贝，而牛分支杆 菌只包含(平均)单个拷贝。在20世纪90年代晚期，报道了使用基于PCR技术、称为“间隔区寡核苷酸分型 (spacer oligotyping) ”(间隔区寡核苷酸分型法(spoligotyping))的技术，根据检测在 MTBc菌株中广泛存在的36bp同向重复(DR)基因座内的25_41bp的43个已知的多态性“间 隔”区域的存在或不存在，同时进行分支杆菌的检测和菌株区分(Kamerbeek等人，1997)。 在基因组中的DRs总量以及特定间隔区域的存在或不存在方面，菌株存在变化。因此，像基 于IS6110的方法一样，间隔区寡核苷酸分型法缺少区分能力。“^木干胃！^^ 白勺；gL7t” (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units) (MIRUs)是分散在位于整个MTBc分支杆菌基因组的约41个基因座中的可变数量串联重复 序列(VNTRs)。每个MIRU基因座包含可变数量的串联的MIRU重复序列元件(多至每个基 因座约13个重复元件)。Supply等人2001，描述了基于确定在结核分枝杆菌基因组中MIRU基因座处的串 联重复的数量对结核分枝杆菌菌株进行基因分型的方法。Supply等人描述的方法包括使用 对位于MIRU基因座侧翼的结核分枝杆菌基因组的区域特异的引物的PCR扩增。生成的扩 增子的大小反映在每个MIRU基因座的重复的数量。在本领域中存在对快速、简单、特异和高度灵敏的分子方法的需求，所述方法在低 至单个基因组拷贝的水平下检测样品如痰和呼吸道样本中的分支杆菌——优选为“当场 (on-the-spot)”技术，其被容易地被运输进入现场，例如在发展中世界。本发明通过提供检测样品中属于MTB复合群的分支杆菌的方法来满足这种需求， 所述方法包括使样品与一对正向和反向寡核苷酸引物接触；其中所述正向引物与位于分支杆菌散布重复单元(MIRU)重复元件内的靶核酸序 列杂交；和其中所述反向引物与位于分支杆菌散布重复单元(MIRU)重复元件内的靶核酸序 列杂交；(b)延伸所述正向和反向引物以生成扩增产物；和(c)检测所述扩增产物。该方法有利地提供结核分枝杆菌复合群(MTBc)的分支杆菌诸如结核分枝杆菌或牛分支杆菌的高度灵敏、快速和耐用的分子诊断分析。整个MTBc分支杆菌基因组中的MIRU重复的特定排列显著增加分析的灵敏性。在一个实施方式中，有利地是，可以在两个小时以内从分析中获得结果。在一个实 施方式中，有利地是，分析能够从痰直接进行单分子检测。在一个实施方式中，有利地是，可 以从微体积的患者样品(例如，痰)直接获得结果而不需要耗时的核酸提取步骤。因此，在一个实施方式中，所述分析显著地减少等待时间并且理论上允许近患者 ^验(near-patient testing)。本要求保护的分析的进一步优势是它的简单性——它优选地可以通过非专家工 作人员进行和读取，并且是非劳动密集型的。MIRU重复元件包括对MTB复合群的成员特异的核酸序列。因此，在一个实施方式中，本发明的检测方法基于该MTBCs-特异核酸序列的扩+曰O
在一个实施方式中，与正向引物杂交的靶核酸序列对于MTB复合群的分支杆菌特 异。在一个实施方式中，与反向引物杂交的靶核酸序列对于MTB复合群的分支杆菌特异。在一个实施方式中，正向和反向引物的延伸生成包括MTB复合群特异的核酸序列 的扩增产物。在一个实施方式中，检测包括MTB复合群特异的核酸序列的扩增产物。在一个实施方式中，与正向引物杂交的靶核酸序列不位于MIRU4重复元件(也称 为ETRD重复元件)内。在一个实施方式中，与反向引物杂交的靶核酸序列不位于MIRU4重 复元件(也称为ETRD重复元件)内。在一个实施方式中，正向引物和反向引物都不与位于 MIRU4重复元件内的靶核酸序列杂交。在一个实施方式中，扩增产物不包括MIRU4重复元件 核酸序列。在一个实施方式中，MIRU重复元件具有与选自以下的MIRU重复元件至少90%的 序列同一性(优选为91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的序列同一性):MIRU2重复 元件、MIRUlO重复元件、MIRU16重复元件、MIRU23重复元件、MIRU24重复元件、MIRU26重 复元件、MIRU27重复元件(也称为QUB5重复元件)、MIRU31重复元件(也称为ETRE重复 元件)和MIRU39重复元件。因此，在一个实施方式中，正向引物与位于MIRU重复元件内的靶核酸序列杂交， 其中所述MIRU重复元件具有与选自以下的MIRU重复元件至少90%的序列同一性(优选 为 91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 的序列同一性):MIRU2 重复元件、MIRUlO 重复元 件、MIRU16重复元件、MIRU23重复元件、MIRU24重复元件、MIRU26重复元件、MIRU27重复 元件(也称为QUB5重复元件)、MIRU31重复元件(也称为ETRE重复元件)和MIRU39重复 元件。在一个实施方式中，所述靶核酸序列对于MTB复合群的分支杆菌特异。在一个实施方式中，反向引物与位于MIRU重复元件内的靶核酸序列杂交，其中所 述MIRU重复元件具有与选自以下的MIRU重复元件至少90 %的序列同一性(优选为91、 92、93、94、95、96、97、98、99 或 100 % 的序列同一性):MIRU2 重复元件、MIRUlO 重复元件、 MIRU16重复元件、MIRU23重复元件、MIRUM重复元件、MIR似6重复元件、MIRU27重复元件 (也称为QUB5重复元件)、MIRU31重复元件(也称为ETRE重复元件)和MIRU39重复元件。 在一个实施方式中，所述靶核酸序列对于MTB复合群的分支杆菌特异。
作为实例，结核分枝杆菌的⑶C1551菌株的基因组包括在MIRU2基因座处的3个 串联重复元件、在MIRUlO基因座处的5个串联重复元件、在MIRU16基因座处的3个串联重 复元件、在MIRU23基因座处的5个串联重复元件、在MIRUM基因座处的1个串联重复元件、 在MR似6基因座处的5个串联重复元件、在MIRU27/QUB5基因座处的4个串联重复元件、 在MIRU31/ETRE基因座处的3个串联重复元件和在MIRU39基因座处的2个串联重复元件。因此，在一个实施方式中，正向引物与位于MIRU重复元件内的靶核酸序列杂交， 其中所述MIRU重复元件具有与选自以下的MIRU重复元件(参照结核分枝杆菌的⑶C1551 菌株)至少90%的序列同一性(优选为91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的序列同 一性)MIRU2 重复元件 1、2 禾口 3 ；MIRUlO 重复元件 1、2、3、4 和 5 ；MIRU16 重复元件 1、2 和 3 ；MIRU23 重复元件 1、2、3、4 和 5 ；MIRU24 重复元件 1 ；MIRU26 重复元件 1、2、3、4 和 5 ；MIRU27/QUB5重复元件1、2、3和4(优选为MIRU27/QUB5串联重复元件2、3和4)；MIRU31/ETRE重复元件1、2和3 (优选为MIRU31/ETRE重复元件2和3)；禾口MIRU39重复元件1和2。在一个实施方式中，反向引物与位于MIRU重复元件内的靶核酸序列杂交，其中所 述MIRU重复元件具有与选自以下的MIRU重复元件(参照结核分枝杆菌的CDC1551菌株) 至少90%的序列同一性(优选为91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的序列同一性)MIRU2 重复元件 1、2 禾口 3 ；MIRUlO 重复元件 1、2、3、4 和 5 ；MIRU16 重复元件 1、2 和 3 ；MIRU23 重复元件 1、2、3、4 和 5 ；MIRU24 重复元件 1 ；MIRU26 重复元件 1、2、3、4 和 5 ；MIRU27/QUB5重复元件1、2、3和4(优选为MIRU27/QUB5串联重复元件2、3和4)；MIRU31/ETRE重复元件1、2和3 (优选为MIRU31/ETRE重复元件2和3)；禾口MIRU39重复元件1和2。在一个实施方式中，所述MIRU重复元件包括(并且可以由以下组成)具有与选自 SEQ ID NOs :1- 的核苷酸序列(如在以下表1中显示)或其互补序列的至少90%序列同 一性(优选为91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%序列同一性)的核苷酸序列。表 1SEQ ID NO:序列(5’到3’)1 2345678910 11 12 13AGGCGCCGCTCCTCCTCATCGCTTCGCTGTGCATC GTCGCTGGCGCGAGTCATAGGCGCCGCTCCTCCTCATCGCTTCGCTGTGCAT CGTCGCCGGCGCGAGTCATAGGCGCCGCTCTCCCCCGCAAGTGGGAGGTGCC CCCACCTCATGTGTGGTCAACT ATGGCGCCGCTCCTCCTCATCGCTGCGCTCTGCAT CGTCGCCGGCGGTAGTTAATGGCGCCGCTCCTCCTCATCGCTGCGCTCTGCAT CGTCGCCGGCGGTAGTCAATGGCGCCGCTCCTCCTCATCGCTGCGCTCTGCAT CGTCGCCGGCGCGGGGGTCAT GCCGCTCCTCCTCATCGCTTCGCTCTGCATCGTCG TCGGCGCGGTTCACGAGCGCCGCTCCTCCTCATCGCTTCGCTCTGCAT CGTCGTCGGCGCGGTTCACGAGCGCCGCTCCTCCTCATCGCTTCGCTCTGCAT CGTCGTCGGCGCGGCTCACGTGG TGCGCCGCTCCTCCTCATCGCTTCGCTCTGCATCG TCACCGGCGCGACTCATCTGCGCCGCTCCTCCTCATCGCTTCGCTCTGCATC GTCACCGGCGCGACTCATCTGCGCCGCTCCTGCTCATCGCTTCGCTCTGCAT CGTCACCGGCGCGACTCATCTGCGCCGCTCCTCTCATCGCTTCGCTCTGCATC10
权利要求
1.检测样品中属于MTB复合群的分支杆菌的方法，所述方法包括(a)使所述样品与一对正向和反向寡核苷酸引物接触；其中所述正向引物与位于分支杆菌散布重复单元(MIRU)重复元件内的靶核酸序列杂 交；并且其中所述反向引物与位于分支杆菌散布重复单元(MIRU)重复元件内的靶核酸序列杂、-父；(b)延伸所述正向引物和反向引物以生成扩增产物；和(c)检测所述扩增产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述MIRU重复元件选自MIRU2重复元件、MIRUlO 重复元件、MIRU16重复元件、MIRU23重复元件、MIRUM重复元件、MIR似6重复元件、MIRU27 重复元件、MIRU31重复元件和MIRU39重复元件。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述MIRU重复元件包括与选自SEQID NOs 1-24的核苷酸序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，或其互补序列。
4.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述正向引物和所述反向引物为15-30个 核苷酸长。
5.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述正向引物与靶核酸序列杂交，所述靶 核酸序列包括与选自SEQ ID NOs 25-39的核苷酸序列的互补序列至少90%同一性的核苷 酸序列。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述正向引物靶序列包括选自SEQID NOs :25-39 的核苷酸序列的互补序列。
7.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述反向引物与靶核酸序列杂交，所述靶 序列包括与选自SEQ ID NOs 40-46的核苷酸序列至少90%同一性的核苷酸序列。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述反向引物靶序列包括选自SEQID NOs :40-46 的核苷酸序列。
9.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述正向引物包括与选自SEQID NO 47 或48的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列、或包括其至少15个连续核苷酸的 其片段。
10.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述反向引物包括与选自SEQID NO 49-51的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列、或包括其至少15个连续核苷酸的 其片段。
11.根据任何前述权利要求所述的方法，其中(i)所述正向引物具有与选自SEQID NO :47或48的核苷酸序列至少80%的同一性， 或具有包括其至少15个连续核苷酸的其片段；和(ii)所述反向引物具有与选自SEQID NOs :49-51的核苷酸序列具有至少80%同一性 的核苷酸序列、或包括其至少15个连续核苷酸的其片段。
12.根据权利要求5至11任一项所述的方法，其中所述正向引物和反向引物与位于相 同分支杆菌散布重复单元(MIRU)重复元件内的靶核酸序列杂交。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述扩增产物为30-55个核苷酸长，优选为 40-50个核苷酸长，最优选为约44个核苷酸长。
14.根据权利要求5至11任一项所述的方法，其中所述正向引物和所述反向引物与位 于不同分支杆菌散布重复单元(MIRU)重复元件内的靶核酸序列杂交。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述扩增产物包括来自相同MIRU基因座内的两 个或更多个邻近MIRU重复元件的核酸序列。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述扩增产物包括来自不同MIRU基因座内的两 个或更多个MIRU重复元件的核酸序列。
17.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述正向引物和/或所述反向引物包括 标记或标签。
18.根据任何前述权利要求所述的方法，其中标记或标签在引物延伸步骤期间掺入所 述扩增产物中，并且其中所述扩增产物通过包括捕获所述标记或检测所述标签的方法进行 检测。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述扩增产物包括生物素标记，并且其中所述 检测步骤包括使所述样品与捕获所述生物素标记的扩增产物的链亲和素包被的磁珠接触。
20.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述扩增产物通过包括以下的方法检测(i)使所述样品与寡核苷酸探针接触，所述寡核苷酸探针与所述扩增产物——如果存 在——形成杂交复合体，和( )检测所述杂交复合体。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述寡核苷酸探针为5-30个核苷酸长，优选为 8-12个核苷酸长。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述寡核苷酸探针包括与选自SEQID NOs :52-57的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列、或具有其至少8个连续核苷 酸的其片段。
23.根据权利要求20-22任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸探针包括标记或标签。
24.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述扩增产物通过包括解链曲线分析的 方法检测。
25.根据权利要求M所述的方法，其中所述扩增产物具有在90-95°C范围内的Tm，优选 在92-93°C范围内的Tm，最优选为约92. 5°C的Tm。
26.根据任一前述权利要求的方法，其中所述扩增产物通过包括以下的方法检测 (i)使所述样品与消化所述扩增产物的限制性核酸内切酶接触；和( )鉴定所述扩增产物的消化产物。
27.根据权利要求沈所述的方法，其中所述扩增产物的消化产物通过包括凝胶电泳的 方法检测。
28.定量感兴趣样品中MTBc分支杆菌负载的体外方法，包括(a)在所述感兴趣样品上进行根据任何前述权利要求的检测方法；(b)在预先确定的已知MTB分支杆菌负载的测试样品上进行所述方法；和(c)比较检测的所述感兴趣样品的扩增产物的量与检测的所述测试样品的扩增产物的量；并且由此定量所述感兴趣样品中的MTBc分支杆菌负载。
29.确定在药物治疗期间的过程中抗MTBc分支杆菌药物的效力的体外方法，包括(a)在药物治疗期间之内或之前的第一时间点获得的第一样品上进行根据权利要求 1-27任一项的检测方法；(b)在药物治疗期间之内或之后的一个或多个稍后时间点获得的一个或多个样品上进 所述方法；和(c)比较检测的所述第一样品的扩增产物的量与检测的所述一个或多个稍后样品的扩 增产物的量；并且由此确定在药物治疗期间的过程中的药物效力，其中与检测的所述第一样品的扩 增产物的量相比，检测的所述一个或多个稍后样品的扩增产物的量的减少显示所述药物对 MTBc分支杆菌的效力。
30.确定疫苗对MTBc分支杆菌感染的效力的体外方法，包括(a)在接种疫苗之前的第一时间点从患者获得的第一样品上进行根据权利要求1-27 任一项的检测方法；(b)在接种疫苗和用MTBc分支杆菌攻击之后的一个或多个稍后时间点从所述患者获 得的样品上进行所述方法；和(c)比较检测的所述第一样品的扩增产物的量与检测的所述一个或多个稍后样品的扩 增产物的量；并且由此确定疫苗的效力，其中与检测的所述第一样品的扩增产物的量相比，检测的 所述一个或多个稍后样品的扩增产物的量的减少显示所述疫苗对MTBc分支杆菌感染的效 力。
31.与位于MIRU重复元件内的靶核酸序列杂交的正向寡核苷酸引物，所述靶核酸序列 包括与选自SEQ ID NOs 25-39的核苷酸序列的互补序列至少90%同一性的核苷酸序列。
32.根据权利要求31所述的正向引物，其中所述正向引物包括与选自SEQID N0:47或 48的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列、或包括其至少15个连续核苷酸的其 片段。
33.与位于MIRU重复元件内的靶核酸序列杂交的反向寡核苷酸引物，所述靶核酸序列 包括与选自SEQ ID NOs 40-46的核苷酸序列至少90%同一性的核苷酸序列。
34.根据权利要求33所述的反向引物，其中所述反向引物包括与选自SEQID NOs 49-51的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列、或包括其至少15个连续核苷酸的 其片段。
35.一对正向和反向寡核苷酸引物，包括根据权利要求31或32所述的正向引物和根据 权利要求33或34所述的反向引物。
36.检测样品中属于MTB复合群的分支杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括根据权利要求 35所述的一对正向和反向寡核苷酸引物、扩增MTB复合体特异的核酸序列的试剂和/或检 测扩增产物的试剂。
37.根据权利要求36所述的试剂盒，其中检测所述扩增产物的所述试剂包括与所述扩 增产物杂交的寡核苷酸探针。
38.根据权利要求37所述的试剂盒，其中所述探针包括与选自SEQID NOs :52-57的 核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列，或包括其至少8个连续核苷酸的其片段。
39.根据权利要求36-38任一项所述的试剂盒，其中检测所述扩增产物的所述试剂包 括消化所述扩增产物的酶。
40.如在此之前描述的和/或在实施例和/或附图
中说明的方法、正向引物、反向引物 或试剂盒。
全文摘要
本发明提供检测属于样品中的MTB复合体的分支杆菌的方法，所述方法包括(a)使所述样品与一对正向和反向寡核苷酸引物接触；其中所述正向引物杂交到位于分支杆菌散布重复单元(MIRU)重复因子内的靶核酸序列；和其中所述反向引物杂交到位于分支杆菌散布重复单元(MIRU)重复因子内的靶核酸序列；(b)延伸所述正向和反向引物生成扩增产物；和(c)检测所述扩增产物。
文档编号C12Q1/68GK102057055SQ200980121612
公开日2011年5月11日 申请日期2009年4月9日 优先权日2008年4月9日
发明者C·阿诺德 申请人:健康保护机构