用于检测和/或分类靶标的捕获剂以及相关方法和系统的制作方法

专利名称：用于检测和/或分类靶标的捕获剂以及相关方法和系统的制作方法
技术领域：
本文公开的内容涉及在样品(如生物样品)中检测和/或分类一个或多个靶标， 特别是生物标记物。更特别地，其涉及用于检测和/或分类靶标的捕获剂和相关方法和系 统。
背景技术：
在生物分子分析领域，靶标，特别是生物标记物的高灵敏度检测已成为一种挑战， 特别是在针对复数个靶标的检测和/或针对某尺寸的或者以低浓度存在于样品中的靶标 的检测时。无论是对于病理检查还是基本生物学研究，有若干种方法通常被用于各种类别 的生物材料和生物分子的检测。一些在实验室中最通常用于单一生物靶标检测的技术包括凝胶电泳，聚丙烯酰胺 凝胶电泳(PAGE)，蛋白质印迹，荧光原位杂交(FISH)，荧光活化细胞分类(FACS)，聚合酶链 式反应(PCR)，和酶联免疫吸附测定(ELISA)。这些方法能够在生物样品(比如组织)中检 测一个或多个生物标记物，并且还适用于诊断目的。由申请人研发的连续多核苷酸编码方法提供了超越现有技术的改进，特别是，其 允许对靶标进行高灵敏度和选择性多重检测。
发明内容
概述此处提供的是多核苷酸编码的捕获剂，特别是模块化的捕获剂以及相关的阵列方 法和系统，在若干实施方式中，通过可变以及通用的模块化分子工具，其容许大量靶标系列 的选择性及灵敏检测。特别地，此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂包括以受控方式结合和脱开的标 准化分子单元所形成的靶标结合组分，支架组分以及编码组分。相应地，在此处所述的模块 化捕获剂中，不仅相同的支架可以和不同的靶标结合结构相结合，而且相同的支架也可以 和复数个靶标结合结构相结合，因此显著地改进该捕获剂可完成的检测，灵敏度以及选择 性。根据第一个方面，描述了被设置为用于和靶标特异性结合的模块化多核苷酸编码 捕获剂。该模块化多核苷酸编码捕获剂包括至少一个被设置为与该靶标特异性结合的结合 分子，被设置为与附着于基质的基质多核苷酸特异性结合的编码多核苷酸，以及被设置为 用位置可区分的支架结合区域附着该至少一个结合分子和该编码多核苷酸的支架分子。在 该支架分子中，该位置可区分的支架结合区域被布置为，依据该至少一个结合分子以及该 编码多核苷酸的结合，可以有至少一个用于和该靶标特异性结合的结合分子，以及用于和 该基质多核苷酸特异性结合的该编码多核苷酸。根据第二个方面，公开了在样品中检测靶标的方法和系统，该方法和系统基于附 着于基质的基质多核苷酸和，以及包括附着至少一个结合分子和编码多核苷酸的模块化多 核苷酸编码捕获剂的组合使用。在该模块化多核苷酸编码捕获剂中，该至少一个结合分子 被设置为与该靶标特异性结合，该编码多核苷酸被设置为与附着于该基质的该基质多核苷 酸特异性结合。在该方法中，该模块化多核苷酸编码捕获剂和/或组成所述模块化多核苷酸编码 捕获剂的单元，该样品以及该基质多核苷酸在允许该至少一个结合分子与模块化多核苷酸 编码捕获剂-靶标复合物中的靶标结合以及该编码多核苷酸与基质多核苷酸结合的条件 下接触一段时间，由此提供与该基质多核苷酸结合的模块化多核苷酸编码捕获剂-靶标复 合物。在该方法中，与基质多核苷酸结合的模块化多核苷酸编码捕获剂-靶标复合物随后 通过检测技术进行检测，本领域技术人员基于对本文公开的内容的理解将可确定这些检测 技术。在该系统中，提供了基质，其具有附着于该基质的基质多核苷酸，以及至少一个被 设置为与靶标特异性结合的结合分子，和被设置为与附着于基质的基质多核苷酸特异性结 合的编码多核苷酸，以及被设置为用位置可区分的支架结合区域附着该至少一个结合分子 和该编码多核苷酸的支架分子。在该支架分子中，该位置可区分的支架结合区域被布置为， 依据该至少一个结合分子以及该编码多核苷酸的结合，可以有至少一个用于和该靶标特异 性结合的结合分子，以及用于和该基质多核苷酸特异性结合的该编码多核苷酸。根据第三个方面，公开了用于分类复数个靶标中的靶标的方法和系统，该方法和 系统基于附着于基质的复数个基质多核苷酸，以及复数个模块化多核苷酸编码捕获剂的组 合使用。在一些实施方式中，这些靶标为细胞，且该方法和系统用于分类复数个细胞。
在该方法和系统中，各基质多核苷酸是序列特异性的并相对于其它基质多核苷酸 是位置可区分的。在该方法和系统中，各模块化多核苷酸编码捕获剂包括至少一个被设置 为与该复数个靶标的互补靶标特异性结合的结合分子，被设置为与该复数个基质多核苷酸 的基质多核苷酸特异性结合的编码多核苷酸，以及被设置为用位置可区分的支架结合区域 和至少一个结合分子和编码多核苷酸相结合的支架分子。该位置可区分的支架结合区域在 该支架分子上被布置为，依据至少一个结合分子以及编码多核苷酸的结合，可以有用于和 靶标特异性结合的至少一个结合分子，以及用于和基质多核苷酸特异性结合的编码多核苷 酸。在该方法中，该复数个模块化多核苷酸编码捕获剂和/或组成所述复数个模块化 多核苷酸编码捕获剂的单元在允许至少一个结合分子与靶标结合的条件下与样品接触一 段时间，由此提供复数个模块化多核苷酸编码捕获剂-靶标复合物。在该方法中，该复数个 多核苷酸编码捕获剂-靶标复合物随后在允许该编码多核苷酸与附着于该基质的基质多 核苷酸相结合的条件下与复数个基质多核苷酸接触一段时间，由此将结合于该基质的复数 个多核苷酸-编码捕获剂-靶标复合物中的复数个靶标分类。该系统中包含基质，其具有附着于该基质的复数个基质多核苷酸，以及复数个结 合分子，各结合分子特异性结合至该复数个靶标中的互补靶标，复数个编码多核苷酸，各编 码多核苷酸特异性结合至附着于该基质的复数个基质多核苷酸中的每一个多核苷酸，至少 一个被设置为用位置可区分的支架结合区域和该复数个结合分子的每一个结合分子以及 该复数个编码多核苷酸的每一个编码多核苷酸相结合的支架分子，该位置可区分的支架结 合区域在该支架分子上被布置为依据至少一个结合分子以及编码多核苷酸的结合，可以有 用于和靶标特异性结合的至少一个结合分子，以及用于和基质多核苷酸特异性结合的编码 多核苷酸。根据第四个方面，描述了支架分子，该支架分子包括被设置为附着于至少一个结 合分子的第一支架结合区域，以及被设置为附着编码多核苷酸的第二支架结合区域，其中 该至少一个结合分子被设置为与靶标特异性结合，并且该编码多核苷酸被设置为与附着于 基质的基质多核苷酸特异性结合。在该支架分子中，第一支架结合区域和第二支架结合区 域是位置可区分的，且被布置于该支架分子中，由该至少一个结合分子和第一结合区域结 合以及该编码多核苷酸与第二结合区域结合来最小化该至少一个结合分子和该编码多核 苷酸之间的相互作用。根据第五个方面，描述了多核苷酸编码捕获剂。该多核苷酸编码捕获剂由特异性 结合至靶标的结合分子，以及附着于该结合分子的编码多核苷酸组成。该编码多核苷酸由 特异性结合至基质多核苷酸的序列组成。该基质多核苷酸与一基质相连，并含有能和编码 多核苷酸特异性结合的序列。在该多核苷酸编码捕获剂中，该编码多核苷酸包括至少一个 限制性内切酶位点，使其可被相应的限制性内切酶裂解。在若干实施方式中，该多核苷酸编 码捕获剂可以是在此描述的模块化多核苷酸编码捕获剂。根据第六个方面，此处公开的每一个方法，系统与阵列的基质均与微流组分存在 适用的联合，该微流组分包括用来携带流体的微流特征件。相应地，在此处描述的方法中， 编码多核苷酸与基质的接触至少可以在该微流特征件携带的流体中进行。此外，此处公开 的每一个系统还可以进一步包括含有该微流特征件的微流组分。
在此描述的模块化多核苷酸编码捕获剂，以及相关的阵列方法和系统中，靶标结 合结构从支架结构分离出来，从而相较于现有技术的对应装置提高了使用上的灵活性和通 用性。另外，在若干实施方式中，此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂，以及相关的阵 列方法和系统可以将复数个结合分子(特别是蛋白质)与单个多核苷酸编码捕获剂结合， 而各个结合分子结合同一靶标。相应地，得到的模块化多核苷酸编码捕获剂的灵敏度和/ 或选择性可以得到控制，特别是得到改进。特别地，在若干实施方式中，此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂，以及相关的 阵列，方法和系统相较于现有技术的某些方法和系统可以有更好的目标探测选择性和灵敏度。更特别地，在若干实施方式中，此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂，以及相关 的阵列，方法和系统甚至允许从复杂混合物中检测和/或分类靶标(如仅有低亲和性配体 存在的细胞)，以及靶标(如配位体以<< 0. 的极低丰度存在的细胞)。在若干实施方式中，此处所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，以及相关的阵列，方 法和系统还允许用稳固平台进行靶标探测，其不必包括抗体。特别地，在若干实施方式中，此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂，以及相关的 阵列，方法和系统可以产生稳固的模块化阵列，用于高效目标探测和/或分类，鉴于它们的 稳定性，其能够显著地优于文献中用表面结合的蛋白质来捕获和检测靶标的方法。此外，在若干实施方式中，模块化多核苷酸编码捕获剂，以及相关的阵列方法和系 统允许该多核苷酸编码捕获剂-靶标复合物的选择性释放，由此在靶标(尤其是靶细胞) 检测和/或分类上可以用于许多生物分析方法。此处所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，以及相关的阵列方法和系统可与若干检 测和/或分类靶标的分析方法结合使用，其包括，但不限于，单参数和多参数分析(比如基 因组和蛋白组分析)，及技术人员可确认的其它分析法。特别地，此处描述的该平台的模块 化可以对俘获的靶标(特别是俘获的细胞)进行通常在玻璃基质上进行的标准化分析在 上，比如免疫组织化学，FISH，和技术人员基于阅读本文公开内容可确认的其它分析方法。此处所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，以及相关的阵列方法和系统可被用于各 种领域，其包括但不限于，分子诊断，分子治疗，基础生物学研究，组织工程，以及生物材料。以下的附图和实施例内容叙述了本文公开的一个或多个实施方式的细节。根据说 明书，实施例和附图，以及权利要求书，其余特征，目的，以及优点将变得显而易见。


合并于说明书中并构成说明书一部分的这些附图示范了本文所公开内容的一个 或多个实施方式，它们和详细说明及实施例一起用于解释本公开的原理和实施。图1显示了根据本文所公开实施方式的模块化多核苷酸编码捕获剂的示意图。图2显示了根据本文所公开实施方式的模块化多核苷酸编码捕获剂的示意图。图3显示了根据本文所公开的实施方式的模块化多核苷酸编码捕获剂，方法和系 统的示意图。图4显示了根据本文所公开的实施方式的模块化多核苷酸编码捕获剂，方法和系
9统的示意图。图5显示了根据本文所公开的实施方式用模块化多核苷酸编码捕获剂进行的细 胞分类试验结果。面板A显示了对于酪氨酸酶TCR特异性的ssDNA-p/MHC四聚物阵列与T 细胞接触后的灰阶荧光图像。该图像显示了在基质上的T细胞的检测和细胞分类，其中附 着的基质DNA与该ssDNA-p/MHC四聚物互补。面板B显示了用两套ssDNA-p/MHC进行细胞 分类，其各自的编码ssDNA的结合是可以相互区分的。箭头指示每一套在接触靶标T细胞 之后的结合。图6显示了根据本文所述的实施方式用模块化多核苷酸编码捕获剂进行细胞分 类试验的结果。面板A显示了对于酪氨酸酶TRC特异性的ssDNA-SA-p/MHC四聚物阵列与 不同频率的互补基质多核苷酸以及T细胞相接触后的灰阶版荧光图像。面板B显示了面板 A中所示数据的量化图表。图7显示了根据本文所述实施方式的支架(面板A)以及相应的优化支架(面板 B)的结构模型。图8示范了根据本文所述实施方式的优化多核苷酸编码捕获剂的结合容量的试 验结果。特别地，面板A显示了在表达，重折叠，以及提纯的各种步骤检测到的SAC蛋白质 的变性PAGE凝胶。SAC单体的分子量为 12kda。面板B显示了用于检验ssDNA_SAC轭合 物的形成的凝胶移位分析。面板C显示了了用2- '-羟基偶氮苯)苯甲酸分子(HABA) 确定生物素连接SA的摩尔比率的算式。图9示范了根据本文所述实施方式的模块化多核苷酸编码捕获剂的俘获效率的 试验结果。面板A显示了 ssDNA编码蛋白质阵列的灰阶明视野图像，其包括链亲和素支架 和对于人TCR转换的T细胞(左)以及鼠科TCR转基因的T细胞(右)特异性的p/MHC粘 合蛋白。面板A的各子面板显示了该ssDNA-编码蛋白质与互补的基质DNA以及所示特定 细胞接触之后的阵列的明视野图像。面板B显示了 ssDNA-编码蛋白质的阵列的灰阶明视 野图像，其包括优化的链亲和素支架和对于人TCR转换T细胞(左)和鼠科TCR转基因T 细胞(右)特异性的P/MHC结合体蛋白质(细胞和上面板一致)。面板B的各子面板显示 了该SAC-ssDNA p/MHC与互补的基质DNA和所示特定细胞接触之后的阵列的明视野图像。图10显示了用常规蛋白质阵列和用根据本文所述实施方式的模块化多核苷酸编 码捕获剂进行靶标捕获的比较。面板A显示了包含在多核苷酸编码蛋白质中的p/MHC阵列 的灰阶荧光图像，和常规的在各种模式基质上的直接P/MHC蛋白点样策略相比，其进一步 包括优化的SA支架。面板B的图表量化显示了面板A中所示数据。各数据点源自于三个 代表性的点。图11显示了用常规蛋白阵列和用根据本文所述实施方式的模块化多核苷酸编码 捕获剂进行靶标捕获的比较。面板A显示了包含在ssDNA编码蛋白中的p/MHC蛋白阵列的 灰阶版本的荧光图像，其还包括SAC支架。各行表示在不同的栽玻片上进行的不同实验。面 板B显示了单用p/MHC蛋白点样的衍生表面的灰阶版本荧光图像。各行表示在不同的栽玻 片上进行的不同实验。图12显示了用根据本文所述实施方式的模块化多核苷酸编码捕获剂进行细胞分 类试验的结果。面板A显示了三种不同的基质多核苷酸的阵列(标为A，B和C)用由与多核 苷酸A互补的ss-DNA编码的p/MHC四聚物以及用Jurkata_Tylr细胞提供的靶标接触后的灰阶荧光图像。面板B显示了不同的基质多核苷酸阵列(标为A，B和C)用与多核苷酸A互 补的ss-DNA编码的对于Mart-I-特异性TCR特异性的p/MHC四聚物，与多核苷酸B互补的 ss-DNA编码的对于酪氨酸酶-特异性TCR特异性的p/MHC四聚物，以及预先用亲脂性染料 染色(分别为绿和红色，在灰阶版本中为浅灰色和深灰色)的Jurkata-stoH和Jurkatα_Τ!Τ 细胞的混合群体提供的靶标接触后的灰阶荧光图像。面板C显示了对于酪氨酸酶-特异 性TCR特异性的多核苷酸编码蛋白的阵列在和JUrkata_TiT在所示的不同的连续稀释下 (50%,10%,1%,0. 1%)接触后的灰阶荧光图像。面板D显示了面板C所示数据的量化图 表。图13显示了用根据本文所述实施方式的模块化多核苷酸编码捕获剂进行的基因 工程细胞检测。面板A显示了用F5MART-1 TCR转染PMBC细胞的实验方法的示意图，以及 相关的显示由流细胞计数法测定的转染效率的图表。面板B显示了在微阵列上分类的转染 PBMC的灰阶明视野图像，该微阵列含有分别被编码为A和B的同源捕获蛋白(MART-126_35/ HLA-A2. 1)和对照捕获蛋白(CMV pp6 5495_5(13/HLA-A2. 1)。面板C显示了重叠的共焦和明视 野图像，以检验面板B中所示的细胞捕获为特异性(MART-1细胞以浅灰色显示)。图14是根据本文所述实施方式的模块化多核苷酸编码捕获剂的检测特异性和灵 敏度的示意图表。面板A显示了由流细胞计数法测定的对于EBV BMLF1259_267特异性的人 ⑶8+T细胞的数量和特异性图表。面板B显示了由流细胞计数法测定的对于CMV pp6 5495_5Q3 特异性的人CD8+T细胞的数量和特异性图表。图15显示了用根据本文所述实施方式的模块化多核苷酸编码捕获剂进行内 源性初级细胞的检测。面板A显示了含有所示的多核苷酸编码p/MHC捕获蛋白质EBV BMLF1259_267/HLA-A2. 1 和 CMVpp6 5495_503/HLA-A2. 1，在与对于图 13 的 EBV-BMLF-I 特异性 的⑶8+T细胞接触后的阵列图像(患者NRA 13)。左侧面板显示了在患者NRA 13细胞接 触和捕获后用 p/MHC 捕获蛋白 raV BMLF1259_267/HLA-A2. 1 和 CMVpp6、5_5(13/HLA-A2. 1 定位 (分别对A和B cDNA点)的阵列，该患者NRA13细胞含有对于EBV-BMLF-I特异性而不是 对CMV-pp65特异性的⑶8+T细胞(在图13中独立地以流细胞计数法检查)。右侧的两个 面板是这些细胞用荧光性EBV BMLF1259_267/HLA-A2. 1 (蓝色，图中显示为白色箭头)和CMV pp6 5 495_503/HLA-A2. lp/MHC四聚物(红色，在该图的灰阶版本中显示为黑色箭头)染色后的 代表性灰阶荧光图像。面板B显示了所示的对于EBV或者CMV特异性的ss-DNA-SAC-p/MHC 在和图13所示的对EBV-BMLF-I特异性的CD8+T细胞(患者NRA 13)及对CMV_pp65特异 性的⑶8+T细胞(患者NRA 11)的1 1混合物接触后的阵列图像。左侧面板显示了细 胞捕获后T细胞定位于A和B点的即刻明视野图像。右侧两个面板是这些细胞用荧光性 EBV(蓝色，在图中显示为白色箭头)和CMV p/MHC四聚物(红色，在该图的灰阶版本中显 示为黑色箭头)染色后的阵列的代表性荧光图像。面板C显示了 0. 4%，0. 2%和0.
人EBV-特异性T细胞群体混合物以流细胞计数法测定的数量和特异性。面板D显示了对 于EBV特异性的模块化多核苷酸编码蛋白阵列在和面板C的混合物接触后的灰阶版本荧光 图像。EBV-特异性的T细胞群体用浅灰色箭头标记，非特异性细胞用黑色箭头标记。图16显示了用根据本文所述实施方式的模块化多核苷酸编码捕获剂所捕获的靶 标的控制释放。面板A显示了该实验方法的示意图。面板B显示了(i)在p/MHC阵列上捕 获的(ii)用BamHI处理后的(iii)用EcoRI处理后的以及(iv)用BamHI和EcoRI处理后
11的Jurkat^H (红色在灰阶版本中显示为深灰色)以及Jurkata_TiT细胞(绿色在灰阶版 本中显示为浅灰色)的灰阶版本的荧光图像。图17显示了荧光标记的ssDNA-p/MHC四聚物可以被用作流细胞计数法的着色试 剂并且可以通过DNA杂交来定位抗原-特异性T细胞。在面板A中，Cy3-标记的A ‘ -SAC轭 合物被用于产生荧光性酪氨酸酶368-376ssDNA-p/MHC四聚物，以及被用于流细胞计数法 检测Jurkata 细胞。在Cy3NACS p/MHC四聚物(下面板)和常规的酪氨酸酶368-376 (PE) p/MHC四聚物(上面板)之间可观察到类似的染色形态。在面板B中，在暴露至DNA阵列之 前，用酪氨酸酶368-376-A' p/MHC四聚物将Jurkata_Tylr细胞染色。该Jurkata-Tylr细胞通 过DNA杂交被定位至点。图18显示了支链肽的示意图。反应性的伯胺用“星”标注，硫醇的反应性马来酰 亚胺基团用虚线框标注。图19显示了用由优化蛋白支架SAC(左面板)和SAC 3(右面板)制成的编码为 链A，的酪氨酸酶368-376/HLA-A2. 1四聚物对Jurkata_TylrT细胞的检测。图20显示了用免疫-PCR检测细胞表面受体。面板A显示了用ssDNA编码的荧光 性MART-lp/MHC四聚物染色的Jurkata一·—1和Jurkat"5^细胞的流细胞计数法分析。面 板B显示了用ssDNA标记编码的荧光性的抗-EGFR抗体染色的⑶胶质瘤细胞和Jurkat T 细胞的流细胞计数法分析。底面板显示通过用PCR扩增该编码ssDNA检测该同源细胞受体 (a -MART-1TCR,面板 C ；EGFR,面板 D)。图21显示了用DNA编码的p/MHC四聚物和DNA编码的抗体对捕获抗原-特异性 细胞的TCR触发激活的功能性描绘示意图。图22显示了在玻璃纤维基质上捕获和活化的抗原特异性T细胞的功能概况。面 板A包含用三种不同的细胞因子在三个不同的时间点编码的独立点的荧光性图像。面板B 显示了一个独立的IFN-Y簇的荧光放大率。
详细说明本文描述了多核苷酸编码捕获剂，特别是模块化的多核苷酸编码捕获剂和相关的 阵列方法及系统，根据在此处所称的NACS方法或者技术，其可以和基质多核苷酸组合用于 检测样品中的一个或多个靶标。词组“多核苷酸编码捕获剂”指可特异性结合靶标的多核苷酸编码分子构造。特 别地，多核苷酸编码捕获剂通常包括可特异性结合于，并由此在此被定义为互补于靶标的 结合组分，支持该结合组分的结构组分，以及附着于该结构组分的编码多核苷酸，其编码该 分子结构。在“模块化多核苷酸编码捕获剂”中，该多核苷酸编码捕获剂的结合组分，结构组 分和编码组分由可以受控方式彼此结合或者分离的标准化分子单元形成。特别地，在此处 描述的模块化多核苷酸编码捕获剂中，该结合组分由至少一个结合分子形成，其被设置为 与靶标特异性结合，并因此被定义为与靶标互补；该编码组分由编码多核苷酸形成，其被设 置为特异性结合附着于基质的基质多核苷酸，并因此被定义为和附着于基质的基质多核苷 酸互补；该结构组分由附带至少一个结合分子和编码多核苷酸的支架分子形成。特别地，在 该模块化多核苷酸编码捕获剂种，该至少一个结合分子特异性结合至靶标，该支架分子和编码多核苷酸根据图1或者图2的示意图彼此相附或者准备彼此相附，以下将对此进一步 描述。本文所用的术语“附着”或者“被附着”指通过键，连接，力或者捆绑的连接或者组 合，以将两个或两个以上组分保持在一起，其包括直接或者间接的附着方式，比如第一分子 直接与第二分子或者材料结合的实施方式，以及一个或多个中间分子被布置于第一分子和 第二分子或者材料之间的实施方式。分子包括但不限于多核苷酸，多肽，特别是蛋白和抗 体，多糖，核酸适配子(aptamers)和小分子。本文所用的术语“多核苷酸”指由两个或两个以上单体组成的有机聚合物，所述单 体包括核苷酸，核苷或者其类似物。术语“核苷酸”指由结合了嘌呤或者嘧啶碱基，以及磷酸 基并且为核酸的基本结构单元的核糖或者脱氧核糖组成的若干化合物中的任何一种。术语 “核苷”指由和脱氧核糖或者核糖相结合，并且特别在核酸中发现的嘌呤或者嘧啶碱基组成 的化合物(如鸟嘌呤核苷或者腺嘌呤核苷)。术语“核苷酸类似物”或者“核苷类似物”分 别涉及一个或多个的单个原子已被不同的原子或者不同的官能团替换的核苷酸或者核苷。 相应地，术语多核苷酸包括任何长度DNA RNA类似物及其片段的核酸。三个或者三个以上 核苷酸的多核苷酸也被称为核苷酸低聚物或者低聚核苷酸。本文所用的术语“多肽”指由两个或两个以上氨基酸单体和/或其类似物组成的 有机聚合物。术语“多肽”包括任何长度的氨基酸聚合物，包括全长的蛋白和肽，以及其类似 物和片段。三个或者三个以上的多肽也被称为蛋白低聚物或者寡肽。本文所用的术语“氨 基酸”，“氨基酸单体”，或者“氨基酸残基”指二十种天然存在的氨基酸中任何一种，包括具 有非天然侧链的合成氨基酸，并包括D和L旋光异构体。术语“氨基酸类似物”指一个或多 个的单个原子已被不同的原子，同位素，或者不同的官能团替换，但其它和天然氨基酸类似 物一致的氨基酸。本文所用的术语“蛋白”指具有特定二级和三级结构的多肽，其可以参与，然而 并非限于，和其它生物分子的相互作用，所述其它生物分子包括其它蛋白，比如抗体，DNA, RNA，脂质，代谢物，激素，趋化因子，和小分子。本文所用的术语“抗体”指受到抗原刺激后特异性结合至该抗原，在生物系统中促 进免疫反应后由活化的B细胞生成的蛋白，其通常由四个子单元组成，包括两个重链和两 个轻链。术语抗体包括天然和合成抗体，其包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体或者其片 段。示范性的抗体包括IgA，IgD, IgGl, IgG2，IgG3，IgM以及类似物。示范性的片段包括 Fab Fv, Fab' F(ab' )2以及类似物。单克隆抗体是可特异性结合至，因此也被定义为互 补于另一个生物分子的单个特定的空间和极性结构，称为“抗原决定簇”的抗体。多克隆抗 体指具有各种结合不同抗原性的抗原决定簇的单克隆抗体的单克隆抗体混合物。抗体可以 通过本领域众所周知的技术进行制备，比如免疫宿主并收集血清(多克隆)或者通过制备 连续的杂交瘤细胞系并采集分泌性蛋白(单克隆)。本文所使用的术语“多糖”指由通过糖苷键彼此结合的单糖单元形成的聚合物。多 糖包括超大的，通常为支链的巨大分子，包括任何长度的聚合物，从单-或双-糖类聚合物 到包括数百或者数千单糖的聚合物，其可以具有约IOOODa至约20KDa的分子量。示范性的 多糖包括糖原，纤维素，淀粉，和壳多糖。本文所用的术语“核酸适配子”指可结合特定靶标的低聚核苷酸或者肽分子。特别地，核酸适配子包括已经通过重复的离体选择循环或等效手段，SELEX(指数富集配位体系 统进化)进行细胞工程处理，以结合至各种分子靶标，比如小分子，蛋白，核酸，甚至细胞， 组织和有机体的核酸物质。核酸适配子可被用于生物工艺学和治疗学，因为它们可提供和 抗体竞争的分子识别性能。肽核酸适配子是设计成可与其它蛋白在细胞内部相互作用的蛋 白。它们由在两端附着至蛋白支架的可变肽环组成。和抗体的结合亲合力相比，这种双结 构限制大大增加了该肽核酸适配子的结合亲合力水平(纳摩尔范围)。本文所使用的术语“小分子”指不是聚合物并且具有约IODa至2000-3000Da尺寸 的有机化合物。小分子包括生物学活性分子和不具有生物学活性的分子。示范性的小分 子包括4-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-N-W-甲基-3-[(4-吡啶-3-基嘧啶-2-基)氨 基]-苯基]-苯甲酰胺(Gleevec ),磺基琥珀酰亚胺基-6-(生物素酰胺)己酸酯，和琥珀 酰亚胺基-6-胼基烟酸酯丙酮腙。在本文所述的模块化多核苷酸捕获剂中，该至少一个结合分子特异性结合至靶 标，且该编码多核苷酸特异性结合至附着于基质的基质多核苷酸。本文所用的关于一分子结合或者附着于另一分子的词语“特异性的”，“特异性 地”，或者“特异性”指该分子和另一分子之间的识别，接触和稳定复合物的形成，以及在每 一分子和另一分子与其它分子之间基本上较少，甚至没有识别，接触和稳定复合物的形成。 示范性的特异性结合为抗体-抗原相互作用，细胞受体-配位体相互作用，多核苷酸杂化， 酶底物相互作用等等。本文所用的关于复合物分子组分的术语“特异性”指组分与该组分 所属的特定复合物的独特的联合。本文所用的关于多核苷酸序列的术语“特异性”指具有 为互补序列的单个多核苷酸的序列的独特联合。本文所用的词语“基质多核苷酸”指附着于基质以保持其与互补多核苷酸结合能 力的多核苷酸。基质多核苷酸可以是，特别地，包括特异性结合多核苷酸编码蛋白的编码多 核苷酸，并因此被定义为与多核苷酸编码蛋白的编码多核苷酸互补的序列。本文所用的术语“基质”指置于下面的支持体或者底层。示范性的基质包括固体 基质，比如玻璃板，微量滴定孔板，磁珠，硅片和技术人员根据对本文公开内容的理解可以 确认的其它基质。在一些实施方式中，附着于支架组分的编码多核苷酸对于该结合组分是特异性 的。这些实施方式可被用于进行利用该结合组分-靶标特异性相互作用的分析，以检测蛋 白，细胞因子，趋化因子，小分子，DNA, RNA,脂质，等等，只要靶标是已知的，并且需要灵敏检 测该靶标。在若干实施方式中，该结合组分和该结构组分由蛋白形成。本文所用的术语“检测(动词)”或者“检测(名词)”指测定靶标或者信号在空 间的有限部分中的存在，出现或者实况，包括但不限于，样品，反应混合物，分子复合物和基 质。当提及，关于，或者涉及靶标或者信号的量或者数量时，检测是“定量的”(也称为定 量)，其包括但不限于，设计成可测定该靶标或者信号的量或者比例的任何分析。当提及， 关于，或者涉及对于另一靶标或者信号的相对丰度的靶标或者信号的性质或者种类的识别 时，检测是“定性的”，其不被量化。本文所用的术语“靶标”指所关心的被分析物。术语“被分析物”指其本身在样 品中的存在或者缺乏需要被检测的物质，化合物或者组分。被分析物包括但不限于生物分 子，特别是生物标记物。本文所用的术语“生物分子”指与生物环境有关的物质化合物或者组分，其包括但不限于，糖类，氨基酸，肽蛋白，低聚核苷酸，多核苷酸，多肽，有机分子，半抗 原，抗原决定簇，生物细胞，生物学细胞的部分，维生素，激素及类似物。术语“生物标记物” 指与生物环境的特定状态有关的生物分子，其包括但不限于，细胞周期的阶段，健康和疾病 状态。生物标记物的存在，缺乏，减少，正相调节和特定状态相关并且可作为特定状态的征 兆。本文所用的术语“样品”指限定量的事物，其象征更大量的该事物，包括但不限于 来自生物环境的液体，标本，培养物，组织，商业的重组蛋白，合成化合物或者其部分。在若干实施方式中，该模块化多核苷酸编码分子包括至少一个结合分子，支架分 子和编码多核苷酸。本文所用的术语“结合分子”或者“亲合剂”指能够与靶标在适当的条件下特异 性结合的分子。特别地，该结合分子或者亲合剂能够与至少一个靶标在适当的条件下特 异性结合，其包括例如在溶液中(如从生物体取得或者合成)，在细胞表面上，在人工表面 上(如衍生的珠，纳米微粒)或者在其它技术人员可以确认的混合物或者表面中结合至该 靶标。结合分子的实例包括任何对于预定靶标体现结合亲合力的分子，包括但不限于蛋白 结合剂，比如抗体，凝集素，Fc受体，MHC蛋白A/G，肽核酸适配子等等，非蛋白粘合剂，比如 多核苷酸(例如RNA e/o DNA)核酸适配子，肽，小分子，和药物，比如伊马替尼甲磺酸盐 (Gleevac ),环蛇毒素，烟碱样乙酰胆碱受体抑制剂等等。在该模块化多核苷酸编码捕获 剂中，该亲合剂被附着于支架，其中可以进行直接或者间接的结合，例如通过中间分子(如 生物素分子)，通过任何共价的附着方案(本领域人员易于识别)或者通过非共价的方案， 比如静电，Fc蛋白A/G相互作用，生物素等等。用于本文所述的模块化多核苷酸编码蛋白中的结合分子通常对于要检测的靶标 展现出结合亲合力和结合选择性，其可以用本领域已知的技术进行测量，比如表面等离子 共振(SPR)，酶联免疫吸附分析(ELISAs)，和技术人员可以确认的其它技术。针对模块化多 核苷酸捕获剂的结合分子的选择是技术人员鉴于将被检测的靶标以及试验设计而作出的。 例如，当该靶标为细胞时，该结合分子展现对生物分子，特别是存在于特定细胞类型的表面 上的生物标记物的结合亲合力和选择性。示范性的表面分子包括但不限于膜蛋白，受体，糖 蛋白，离子通道或者主要组织相容性复合体及其他可以由技术人员依据对本文公开内容的 理解可以确认的分子。在测定候选的结合分子所展现的对于靶标的结合亲合力和选择性，并考虑附着至 支架(见下文)的结合分子数目的基础上，技术人员还能够为某靶标确定适当的结合分子。在若干实施方式中，依据适当的支架选择，可以通过控制捕获剂对于靶标的化合 价(即由捕获剂与该靶标所形成的化学键数目)调整附着于该支架的结合分子数目，以实 现所需的结合亲合力和/或选择性。例如，对于某靶标(例如细胞)低亲合力(例如Kd > ΙΟ"6)的结合分子很可能需 要增加附着于该支架的分子数量，以确保包括这种结合分子的模块化多核苷酸编码捕获剂 的特异性结合。相应地，在若干实施方式中，该捕获剂对于某个靶标的结合亲合力是可控制的，并 且特别地，可以通过提供相同或者不同的结合分子的多重拷贝提高结合亲合力。特别地，如 果相同或者不同的结合分子以适当方式位于该支架上，其可以使该结合分子/支架对于所
15感兴趣的细胞类型构成比该亲合剂单独可实现的亲和力明显更高的结合亲合力。特别地，多重配位体捕获剂可以通过将各种结合分子(比如上述的结合分子)结 合至相同的支架进行组合。在某些需要探查靶标样品内多重要素的情形下(例如，多重细 胞表面标记物，来自相同的抗原递呈细胞的内源性和外源性的肽/MHC，等等)，这可能是有 利的。在若干实施方式中，该结合分子为蛋白，比如抗体，凝集素，Fc受体，MHC，蛋白A/ G，和技术人员可以确认的其它蛋白。 特别地，在一些实施方式中，该结合分子为抗体。特别地，在这些实施方式中，该抗 体可以被生成为与期望的靶标特异性结合.该靶标可以是在混合物中或者细胞表面上要 被检测的生物标记物(参见，例如⑶4，⑶8，和⑶幻。在后者情形下，这些抗体还可以被用 作被用于检测和/或分类细胞靶标的模块化多核苷酸编码捕获剂的结合分子(见实施例 13)。在一些实施方式中，该蛋白可以是MHC复合物。本文所用的术语“MHC”或者“ρ/ MHC”指肽主要组织相容性复合体分子(p/MHC)，并且，更特别地指异源三聚体蛋白结合剂， 其为发现于T细胞上的对T细胞受体的同源结合剂。特别地，p/MHC合成物是抗原递呈细 胞的细胞表面发现的异源-三聚蛋白，并且其包括MHC类别I，MHC类别II和MHC类别III 蛋白。MHC类别I蛋白包含肽，α链和β 2-微-球蛋白。表达MHC类别I蛋白的APCs向 细胞毒T细胞呈递抗原片段，其被表面分子CD8稳定。MHC类别II包括异源二聚体肽-结 合蛋白和在溶酶体小泡中调整在MHC类别II蛋白上的抗原载荷的蛋白，如MHC II DM,MHC II DQ,MHC II DRjPMHC II DP。在抗原呈递细胞上，MHC类别II蛋白包含α禾Π β链，并 且它们通过结合至T-辅助细胞上的TCR和⑶4受体向T-辅助细胞呈递抗原片段。MHC类 别III包括其它免疫组分，比如补体组分(例如，C2，C4，B因子)和一些编码细胞因子(例 如TNF-α)的组分以及hsp。典型的MHC的受体/靶标是发现于T细胞上的T细胞受体，其对于在该MHC复合 物中存在的各种抗原(例如MART-1，巨细胞病毒，酪氨酸酶等等)可以是特异性的。基于所 感兴趣的靶标并考虑MHC候选分子的结合特异性，技术人员可以确定对于特定靶标合适的 MHC。在一些实施方式中，MHC单体提供此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂的结合 分子。在这些实施方式中，靶标优选由不被包括于受测细胞内的状态或者形式的分子生物 标记物或者其它分子提供。在一些实施方式中，MHC 二聚物和三聚物可以通过流细胞计数法 被用于检测溶液中的抗原-特异性T细胞。在一些实施方式中，具有高亲合力相互作用的 MHC 二聚物和三聚物(例如TCR-p/MHC)可期望检测同样在复合环境中的抗原特异性T细 胞，如实施例5和图9a所示(左下的面板)，其中表达抗酪氨酸酶抗原的TCR的Jurkat细 胞用次优的捕获剂(参见图8的二聚物和三聚物混合)进行分类。在一些实施方式中，MHC 四聚物与多核苷酸编码支架联合使用，其可以有利地用于涉及细胞检测和/或分类的应用 中。(例如，参见实施例9和10以及附图5，6，9，10，11，12，和13-14，15，16，19，22。)特别地，在一些实施方式中，抗原-呈递MHC的四聚物提供此处描述的模块化多核 苷酸编码捕获剂的结合分子。MHC四聚物对于所感兴趣的T细胞呈现比MHC单体或者二聚 物高得多的亲合力的，其即为良好的用于通过流细胞计数法检测抗原-特异性T细胞的试剂。当在此处公开的模块化捕获剂中和支架结合时，和本领域已知的方法相比，MHC四聚物 容许增加灵敏度和特异性的靶标检测和/或分类。在以下包括附图和实施例的公开内容中，每当论述与此处公开的模块化多核苷酸 编码分子有关的结合分子的性能和用途时，将经常用MHC作为参考。技术人员将能够使此 种说明适用于制造和使用蛋白及其它非MHC的分子。特别地，技术人员将能理解，在使用非 p/MHC分子的结合蛋白时，选择的主要决定因素是要被检测的靶标。例如，如果需要检测小 分子(例如咖啡因)，且存在对于咖啡因特异性的适配体，则技术人员将选择该适配体作为 结合部分并将其用于支架构造。(见实施例13)本文所用的术语“支架”或者“支架分子”指捕获剂的分子结构，其用于组成对编 码多核苷酸(例如ssDNA tags)的亲合剂(例如MHC)。此结构可以源自于蛋白(比如链霉 亲和素或者SA)，其它生物聚合物(比如多核苷酸，如RNA和DNA，肽核酸等等)，或者是可以 与该亲合剂和该编码多核苷酸在聚合物的不同和分开的部分相结合的其它聚合物。在此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂中，支架分子被设置为以支架结合区域 结合至少一个结合分子和编码多核苷酸。本文所用的术语“域”指由区别性的结构和功能特征标记的区域。特别地，支架结 合域是支架中被设置为结合另一个分子的区域。在本文公开内容的意义上，支架结合域包 括用于结合另一个分子的官能团，以及在该支架上被另一个结合于支架的分子占据的支架 结合区域。官能团一经确定，相关的支架结合区域可以用适合确定尺寸的技术加以确定，特 别是用所选择的要附着的另一个分子的最大直径。在若干实施方式中，对于根据本文公开 内容的蛋白，取决于所选取的蛋白，最大直径平均值介于约10人和约:5θΛ之间，对于小分 子介于约3Α和约IOA之间，对于多核苷酸介于约IOA和约20Α之间。适于确定分子尺寸的 技术但不限于，用于可结晶分子的X射线晶体照相法(见例如参考文献39-41)，以及用于不 能结晶的分子(比如聚合物)的持续长度的技术(见例如参考文献42-43)。这些用于检测 分子尺寸的技术是技术人员依据对本文公开内容的理解可以确认的。在此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂中，支架结合域彼此之间是位置可区分 的，并因此不重叠。本文所用的词语“位置可区分的”指分子或者其域，指基于该分子或者域占据的点 或者区域可区分的分子或者其域。相应地，位置可区分的支架结合区域是在支架上占据不 同点的或者区域的结合域，因此它们是位置可区分的。特别地，在此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂中，该支架分子包括被设置为 附着至少一个结合分子的第一支架结合区域和被设置为附着该编码多核苷酸的第二支架 结合区域。在该模块化多核苷酸编码捕获剂中，可以通过标记位置可区分的官能团和相关支 架结合区域对第一支架结合域和第二支架结合域进行选择，其被设置为在附着后使该附着 分子呈现于该支架上。本文所用的涉及具有化学反应性并被包括于结构中的分子或者其部分(例如，官 能团或者限制位点)的术语“呈现”指该结构中的分子或者官能团的构造，其中该分子或者 其部分保持这种化学反应性的可检测水平。相应地，呈现在支架上的分子或者官能团是包 含在该支架中的分子或者其部分，其构造容许在适当的条件下进行或者检测可化学地或生物学地表征所讨论的该分子或者其部分的一个或多个化学反应。因此，在本文公开内容的模块化多核苷酸编码捕获剂中，结合分子以及编码多核 苷酸附着支架后，该结合分子被呈现为用于和靶标结合，该编码多核苷酸被呈现为用于和 基质多核苷酸结合。在此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂中，结合分子和编码多核苷酸在支架上 的呈现是通过选择具有适当的第一和第二支架结合域的支架实现的。可以被包括于第一支架结合区域的用于结合结合分子的官能团依赖于该结合分 子的化学性质，并且是技术人员依据对本文公开内容的理解可以确认的。例如，用于结合结 合分子的官能团包括但不限于，BirA联接酶(将生物素基团联接到预定肽序列的酶)，其它 酶，比如甲酰甘氨酸-生成酶(位点特异性地将醛基引入例如参考文献44所述的重组蛋白 质)。可以被包括于第二支架结合区域的用于结合多核苷酸的官能团也是技术人员依 据对本文公开内容的理解可以确认的。示范性的呈现于支架上的用于结合多核苷酸的官能 团包括官能团，比如硫氢基(例如，在半胱氨酸残基中)，伯胺及其它通过常规结合策略附 带衍生DNA的官能团，熟悉技术的读者应能确认。这些官能团可以是该支架上的内源性基团(例如支架蛋白上的天然赖氨酸残 基)，或者通过比如基因克隆的方法(例如蛋白)，合成技术(聚合物，小分子)，及其它方法 而被引入。可以依附至该支架的多核苷酸或者结合分子的拷贝数目将和该支架上可用的官 能团数目成正比。该特异性的第一和第二官能团和相关的支架结合域是考虑试验设计而加以选择。 通常，该支架经过选择以使得第一和第二支架结合区域的官能团允许用正交的化学过程附 着结合分子和编码多核苷酸。如果在进行任何特定的化学过程时，这些在该特定化学过程 中参加和/或经历化学反应的官能团不和该正交系中的任何其它化学过程反应，则该组化 学过程是正交的。当支架为蛋白时，示范性的正交化学过程包括半胱氨酸-马来酰亚胺结 合，胺-NHS结合，和链霉亲和素-生物素结合，在支架为多糖时，具有NaI04的不同的支架 结合区域中的OH官能团受控氧化。在一些实施方式中，除包含区分的支架结合域以容纳亲合剂和编码DNA之外，该 支架还经过选择以和所感兴趣的靶标的环境相适应(例如，如果该靶标是细胞表面标记 物，其应当可溶于水性溶液)。在若干实施方式中，该支架包括高分子支架，其通过多配位体相互作用而形成，用 于和特定细胞类型的高亲合力结合，随之可用于这些不同细胞类型的空间导向的多重分 类。特别地，在一些实施方式中，该支架由非天然产生的分子提供，其被表达为具有模 块设计特性。在这些实施方式中，该蛋白支架经过设计，以使得多重和受控数目的特异性结 合分子和编码多核苷酸的拷贝可以在特异性的支架多核苷酸结合域附着于该支架。在一些实施方式中，该支架可以被设置为在多重第二支架结合域中可启动或者减 弱单股编码多核苷酸(例如DNA低聚物)的附着。在这些实施方式中，第二支架结合域可 以经过选择，以允许以编码多核苷酸杂化，用于将该支架空间导向至覆盖有该基质多核苷 酸的表面上的特定点。
在模块化多核苷酸编码捕获剂被用于特定细胞类型的空间选择性分类的实施方 式中，这样设置的支架可能是有用的。例如，各自包含不同套亲合剂，并以结合可区分的 ssDNA低聚物独特标记的多重支架可以被采用，同时将许多细胞类型的混合物分离为单一 组分，借鉴本文公开的内容，对于技术人员这是显而易见的。例如，在一些实施方式中，可以 用具有生物素化抗体与ρ/MHC蛋白作为亲合试剂的模块化捕获剂，其各自被编码为结合可 区分的ssDNA低聚物。这些抗体可被用于根据细胞表面标记物如⑶4，⑶8，⑶3，等等对细 胞进行分类，而ρ/MHC蛋白将根据由TCRs测定的抗原特异性对细胞进行分类。在一些实施方式中，支架，特别是支架蛋白的所期望的构造，可以通过用技术人员 已知技术修饰的候选支架的修饰实现，比如传统克隆技术或者技术人员可以确认的其它技 术。在一些实施方式中，该支架可以针对特定的捕获剂进行优化。特别地，在特定的捕 获剂中，优化的支架具有明确定义的用于和结合分子与编码多核苷酸单独结合的支架结合 区域，以使得该结合分子和该编码多核苷酸结合后，在该多核苷酸和该结合分子的组件之 间可能的干涉被最小化。对于靶标和基质多核苷酸具有期望的结合亲合力的捕获剂，这通 常由最小化一个或多个该结合分子和附着于该支架的编码多核苷酸之间的结构重叠，而保 持该捕获剂对于该靶标和该基质多核苷酸所期望的结合亲合力而加以实现。参照图1和2，其显示了根据本文公开内容的模块化捕获剂的不同构造。特别地， 在图1和2的图例中，支架域，结合分子域(蛋白结合域)和多核苷酸域(DNA域)被图解 示出。如前所述，本文所用的术语“域”指由区别性的结构和功能特征标记的区域。相应地， 涉及该支架分子，该结合分子和该编码多核苷酸的该术语“域”指由在某些温度结合于捕获 剂众的该分子(支架分子，结合分子，多核苷酸)的构型变化定义的专门区域。某个分子的 域可以用任何适于确定尺寸，特别是分子的三维结构的技术进行测定，其包括X射线晶体 照相术，筛析色谱法，质谱法，凝胶电泳及其它技术人员可以确认的技术。在对于某捕获剂优化的支架中，该支架的结合域经过选择以最小化该支架上的结 合分子域和多核苷酸域的重叠，以使该捕获剂具有所期望的结合亲合力。在若干实施方式中，优化的支架呈现结合分子和编码多核苷酸，其与在该支架上 所有可用的位置可区分的支架结合区域上形成的捕获剂所期望的结合亲合力相关。另一 方面，在若干实施方式中，在非优化支架中，附着的结合分子和编码多核苷酸的数目不匹配 该支架上可用位点的总数目。例如，如果该支架具有4个附着结合蛋白的位点以及3个附 着DNA的位点，该非优化的支架将很可能每支架可包含<4个结合蛋白和<3个DNA，不管 摩尔量如何过剩。此种每支架的结合分子和/或多核苷酸的存在(或者缺乏)是可测量的 (见例如图8)。该捕获剂还可以用传统的分析方法测试，如ELISA，流细胞计数法，SPR，等 等，以测量该捕获剂的效能。在特异性的捕获剂中，该支架还可以经过修改，以最佳化该支架作为两个部分 (即结合分子和编码多核苷酸)的整合点的功能，而最小化在结合这些部分的支架域之间， 可能导致附着的部分功能效能降低的任何可能的相互作用。该被降低的功能效能可以是由 于空间位阻(在结合分子和编码多核苷酸的重叠区域之间)，由于所应用的结合化学过程 的性质而在该支架上的附着区域的不可逆修饰，等等。实施例4-6和图7-9显示了未优化 的支架(天然SA)和优化的支架(半胱氨酸-SA)的T细胞俘获效率的比较。
相应地，通过标记结合结合分子和编码多核苷酸的支架结合区域，以及改变支架 分子的剩余部分以布置该支架上的支架结合域，使结合分子和编码多核苷酸之间的相互作 用最小化，可以针对那些结合分子和编码多核苷酸优化结合某个结合分子和编码多核苷酸 的某支架分子。通过这样的方式，可以衍生出某支架分子的优化变体。在一些实施方式中，支架是蛋白。特别地，在一些实施方式中，蛋白支架已经包含 对于结合分子允许特异性结合的官能团。例如，链霉亲和素由于其对于生物素的天然亲合 力使其对于生物素化的P/MHC分子具有特异性，是优良的支架蛋白。另一个实例可以是蛋 白A/G。这些蛋白对于抗体的Fc区域具有天然的亲合力，其中后者可以被用作结合蛋白。 这比没有固有特异性存在的蛋白支架更加有利，在没有固有特异性存在的情况下，需要引 入两个化学正交的处理手段，用于结合结合蛋白和编码多核苷酸。由于大多数的蛋白具有 窄范围的尺寸和序列长度(即性能，比如溶解度，可用于修饰的位点数量)，可以预期任何 蛋白均可被用作支架分子。特别地，在用于生物结合的条件下稳定的蛋白特别有望适用作 为支架。在若干实施方式中，支架蛋白由链霉亲和素(SA或者SA)形成。链霉亲和素是来 自链霉菌属avidinii的四聚物蛋白，其具有序列HMGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVG NAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTffSGQYVGGAEARINTQffLLTSGTTEANAffKSTLV GHDTFTKVKPSAAS(SEQ ID NO 1)。SA具有出众的亲合力以及四个独特的结合位点，其对于天 然的配位体生物素(Kd 10-15mol/L)四面体式布置。链霉亲和素对于生物素的摩尔结合 量是4 1生物素SA。而SA无需和结合分子特异性结合(例如通过生物素相互作用)， 用其它结合方法将结合单元结合至SA的实施方式没有利用SA对于生物素的4倍化合价和 强相互作用。特别地，在若干SA为支架的实施方式中，着眼于该蛋白的N末端部分上的生 物素的结合孔位置，C末端部分被选择作为编码多核苷酸附着位点。相应地，在若干支架蛋白是链霉亲和素的实施方式中，结合分子(例如MHC分子) 可以是生物素化的，以实现具有蛋白-配位体对SA的四聚物组件。在一些实施方式中，结 合分子还可以通过共价键(比如酰胺结合)结合至SA，并因此不必通过生物素-SA相互作 用结合。技术人员将能够根据选择的试验设计确定最适当的结合。在本文公开内容的若干 实施方式中，SA作为标准支架被用于将p/MHC单体组装入四聚物中。在支架是SA的实施方式中，可以使用修饰的SA，以及从其中衍生的分子(特别是 SA-藻胆色素蛋白(PE或APC)结合物)。在一些实施方式中，可以使用的支架为用于荧光 性p/MHC四聚物制备的SA重组体突变株。在一些这类实施方式中，可以使用SA变体，例如 在从生物素结合孔去除的位点中，在羧基末端[参考文献25，26，27]结合半胱氨酸残基的 变体。在这些实施方式中，半胱氨酸-反应性马来酰亚胺衍生物的结合可以只限于C末端， 因为在天然的SA中不存在半胱氨酸残基。更特别地，在一些实施方式中，可以使用名为链霉亲和素-半胱氨酸(SAC)的优化 链霉亲和素，其在c末端包含若干外源性的氨基酸。这些残基包括半胱氨酸氨基酸，衍生 DNA(或者任何其它马来酰亚胺衍生分子)可以由其结合。该SAC支架具有序列HMGITGTWY NQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGG AEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVGGSGCP(SEQ ID NO :2)。在本文公开的内容中，经常以SA和SAC支架作为参照。技术人员将能够将说明内
20容用于非SA和和SAC的支架和优化支架，也可以参考实施例部分提供的教导。特别地，其 它支架蛋白包括但不限于蛋白A/G，支链肽，小分子，如MBester PEG-马来酰胺及其优化 变体。采用以下方法可以衍生给定预定靶标和预选结合分子的其它支架和优化支架。 (a)选择第一结合化学过程，以将预选的结合分子附着于支架，以及选择第二结合化学过 程，以将多核苷酸附着于支架(例如NHS-胺和硫醇-马来酰亚胺化学过程)。(b)考虑形成 的捕获剂的化合价和极性(例如支链肽增加化合价的应用，甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-丝 氨酸延伸物在结合蛋白之间产生间距的应用)，选择候选的支架结构。(c)用候选的支架结 构进行多核苷酸以及结合分子的结合，由此提供候选捕获剂。(d)实验性地以及任选地测试 候选的捕获剂和预定靶标的特异性结合。(e)如有必要或者需要，重复一些或者全部步骤， 以增加该捕获剂对于该预定靶标的结合亲合力和/或特异性。如果期望优化，可以执行选 择候选支架的步骤，或者该步骤可以包括修饰该支架以减少，特别是最小化预选的结合分 子和多核苷酸之间重叠的步骤。本文所用的术语“编码多核苷酸”指附着于此处描述的模块化捕获剂的支架，并且 和附着于基质的基质多核苷酸互补的多核苷酸。在若干实施方式中，编码对于第一靶标特 异性的模块化捕获剂的编码多核苷酸和编码对于第二靶标特异性的捕获剂的编码多核苷 酸是结合可区分的，特别是在第一靶标与第二靶标不同时。本文所用关于分子的词语“结合可区分的”指基于其和特定分子特异性结合，并由 此被定义为与特定分子互补的能力而可区分的分子。相应地，如果第一分子可特异性结合 第三分子并由此被定义为与第三分子互补，并且第二分子可特异性结合第四分子并由此被 定义为和第四分子互补，而第四分子不同于第三分子，则第一分子和第二分子是结合可区 分的。相应地，如果第一编码多核苷酸可特异性结合(并由此被定义为互补)于第一基质 多核苷酸，并且第二编码多核苷酸可特异性结合(并由此被定义为互补)于第二基质多核 苷酸，而第一基质多核苷酸不同于第二基质多核苷酸，则第一和第二编码多核苷酸是结合 可区分的。在此处描述的阵列基质，方法和系统的若干实施方式中，各基质多核苷酸和编码 多核苷酸之间是结合可区分的。在此处公开的方法和系统的一些实施方式中，基质的各基 质多核苷酸彼此之间是序列特异性的以及位置可区分的。如上所述，本文所用的关于分子词语“位置可区分的”指根据分子占据的点或者区 域，该分子是可区分的。相应地，位置可区分的基质多核苷酸是在基质上占据不同的点或者 区域并且由此为位置可区分的基质多核苷酸。在若干实施方式中，编码多核苷酸可以包括一个或多个限制性内切酶的限制位 点。词语“限制位点”指可以由限制性内切酶识别的特定核苷酸序列。词语“限制性内切酶” 指可在已知为限制性位点的特异性识别核苷酸序列处切割双股或者单股DNA的任何酶。此 处描述的可以被包括于编码多核苷酸中的示范性的限制位点包括6个碱基限制位点，比如 对于EcoRI BamHI，NdeI及其它可以由技术人员确认的酶的位点。其它示范性的限制位点 包括但不限于Aval，BglII, DraI, EcoRV和参考文献45中公布的进一步的限制位点，其以 参考方式被全文合并于此。在若干实施方式中，支架本身在结合可区分的捕获剂之间是可互换的，并且单种支架可被用于构造不同的模块化捕获剂。另外该支架可以经受改善和优化。在若干实施方 式中，该支架和至少一个结合分子亦为结合可区分的。在一些实施方式中，支架可以被设置为提供极性捕获剂，没有图1(上面板)的示 意图所示的径向对称，图1 (底面板)和图2 (右上面板)的示意图所示的对称捕获剂，或者 图2(左上面板)的示意图所示的准极性捕获剂。特别地，极性捕获剂是结合分子域，支架域和编码多核苷酸的重叠被最小化的捕 获剂。准极性捕获剂是少数结合分子域和编码多核苷酸域在彼此之间以及和该支架域重叠 的分子。在对称捕获剂中，所有的结合分子和编码多核苷酸域在一定程度上重叠。在每一 种极性捕获剂，准极性捕获剂和对称捕获剂中，该支架可以被优化，以最小化该一个或多个 结合分子域，支架分子域和一个或多个多核苷酸域之间的特定捕获剂中的重叠。对于极性 捕获剂，这种最小化被最大化。相应地，在若干实施方式中，充分组合的极性多核苷酸编码捕获剂有望具备相对 于非极性捕获剂更高的能力，因为在极性捕获剂中该结合分子可自由地与所感兴趣的靶标 相互作用，并且该编码多核苷酸可自由地与该基质上的cDNA相互作用。申请人已经通过流 细胞计数法证明此种“反面(about-face) ”构造的近似物导致更高的细胞表面标记物染色 (参见图2，下面板)。特别地，申请人生产了 SAC-DNA构造，使每SAC附着IDNA链(经荧光标记)。这 个部分是准极性的，因为该MHC捕获蛋白(结合域)沿支架径向分布，而该DNA域是单一的 (因此和该构造的其余部分相比是极性的)(见下文)。与径向对称的构造直接对比，此构 造结合细胞表面受体更好(平均强度178对比15 (参见图2下面板)。在若干实施方式中，通过用将结合结构库和单一的支架配对，可以将具有相关编 码多核苷酸的单个支架重复用于产生结合结构库。这些实施方式被示范于实施例5，8，9和 10，以及图 5,6,9,12A, B，13B，15AB，16，19，22 中，其中相同的支架(SAC-A')被用作 NACS 捕获剂，其具有对MART-I，OVA, Riiel，酪氨酸酶，和CMV的特异性。在这些实施方式中该系 统的模块化和互换能力。在一些实施方式中，此处描述的多核苷酸编码捕获剂，特别是此处描述的模块化 的多核苷酸编码捕获剂包括用于将结合分子连接到支架的可变长度的连结物。本文所用的 术语“连结物”指包含在模块化多核苷酸编码捕获剂中用于结合或者连接支架与结合分子 的分子。该连结物可以源自于可以与包括其的捕获剂的支架和结合分子反应任何化学分 子。示范性的连接物包括但不限于肽(例如10肽)，核酸，聚合物(聚乙二醇)，和碳链。连结 物的长度可以由常规化学方法控制，对于具有技术专长的读者这应当是显而易见的。该连结 物可以用常规的生物结合策略进行附着，这对于熟习技术的读者而言也应当是显而易见的。在这些实施方式中，对于和所感兴趣靶标的适当相互作用而言，包含连结物有望 增加结合蛋白的自由度。当该靶标被固定/限制在适当空间定向对于高亲合力相互作用为 决定性的特定域(例如靶细胞表面蛋白被限制于细胞膜)中时，这有望增加该相互作用。在一些实施方式中，该连结物还可以作为介于所包括的结合分子和编码多核苷酸 之间的间隔团，以使得该结合分子域和多核苷酸域彼此不会干涉。示范性的连接物包括尺 寸在50Da和5000Da之间的分子。在以下进一步讨论的一些实施方式中，连结物可以是条件性的连结物，其由于受控的刺激改变其构造。在一些实施方式中，可以通过将多重结合单元结合至单个支架增加捕获剂对于靶 标的亲合力。该捕获剂的化合价的提升增加了该组合复合物的亲合力，因为每一个相邻单 元均参与结合进程，所以净效果是该靶标与多核苷酸编码捕获剂的总体联合增加，如实施 例5和图7，8和9所示。这对于结合分子(如MHC)特别相关，其特征是作为单体对于靶细 胞的亲合力弱，但是以多体形式被束在一起时增加亲合力。在结合分子由低亲合力结合蛋白形成的实施方式中，捕获剂对于靶标被增加的化 合价可能需要有效结合至靶标。可以开发与分子构象的修饰有关的亲合力变化，以即时控 制多核苷酸编码分子对相应的互补靶标的相互作用。例如，一些依据对互补配位体(该受 体对其特异性的分子)的结合控制细胞活动的细胞表面受体功能。当配位体不再与该受体 结合时，该活动可以被逆转或者恢复。因此，通过开发结合分子对支架的分离和多价特性， 有可能可以用条件性连接物来控制结合。条件性连接物响应外源性的外部刺激经历一些构 象变化而导致化合价减少，因此该捕获剂的结合亲合力以及相应的该多核苷酸编码捕获剂 无法保持与该靶标继续结合。条件性连接物的实例为含有紫外线不稳定碱的肽或者核酸， 紫外线不稳定碱在暴露于紫外线灯时断开。这种实施例在实践中将用ρ/MHC蛋白通过紫外 线不稳定的肽连接物结合至SAC-DNA支架。该捕获剂将在结合于T细胞受体后激活靶细胞。 该多核苷酸编码Ρ/MHC捕获剂即可在暴露于紫外线灯所期望的时间后被去除。在若干实施方式中，此处描述的多核苷酸编码捕获剂包括彼此结合可区分的多重 结合分子。在这些实施方式中，多配位体编码捕获剂可被用于同时应答多重目标。当这些 靶标被组合于域中，如被组合于细胞表面上时，这可能是最有利的，因为亲合力的增加(如 上面所指出)可以等同地作用于此系统，其中该复合物的亲合力可能大于独立的结合蛋白 各自的亲合力。多配位体编码捕获剂的实施例可以包括Ρ/MHC复合物，其中各蛋白可以由 不同肽序列组成。其它组合也是可能的，如Ab Ab，Ab肽，Ab适配体，肽适配体，和技术人员 依据对本文公开内容的理解可以确认的其它分子。此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂可以着眼于根据技术人员可以确认的方 法的特异性的捕获和试验设计通过结合这些单元加以制造。例如，在结合分子特异性地结 合支架的实施方式中，编码多核苷酸(例如DNA)可以在组装该结合分子(例如MHC)之前 先结合至支架(例如SAC)。在其它的结合分子不是特异性结合至支架的实施方式中，结合 单元需要以共价形式被附着。这既可以发生在多核苷酸附着于支架前，也可以发生在之后。 将此处描述的模块化捕获剂与其它支架和结合分子进行组装的其它方法对于熟习技术的 读者将是易于确认的。不管试剂以何种次序组合，这些方法将适于组装此处公开的捕获剂， 只要该结合蛋白单元的特异性需要由该多核苷酸序列独特编码。在一些支架是链霉亲和素的实施方式中，模块化多核苷酸编码蛋白可以通过酶促 混合生物素化的MHC分子和链霉亲和素(SA)的商业制剂进行制备，通常比例为4 1，该链 霉亲和素通常连接荧光染料分子。技术人员将可确认在此步骤上致力于改进MHC四聚物对 于流细胞计数法的细胞分类的变化。例如，在一些实施方式中，结合蛋白的附着可以通过蛋白-配位体相互作用(链霉 亲和素生物素)，蛋白-蛋白相互作用(Fe域和蛋白A/G)，或者生物结合策略(胺结合，氢 硫基结合等等)。在一些结合分子是MHC的实施方式中，MHC可以在C末端被生物素化。在一
23些支架是SAC的实施方式中，SAC在该C末端以DNA修饰。在一些实施方式中，整个单元通过将 联合生物素-MHC和SAC-DNA进行组装，其中SAC通过生物素特异性结合至4个MHC蛋白分子。此处公开的模块化多核苷酸编码捕获剂的编码多核苷酸与支架蛋白的结合可以 用普通的生物结合方法形成，比如化学交联，其包括依赖于蛋白中可被结合的伯胺(通常 发现于赖氨酸残基)存在的技术。特别地，多核苷酸编码蛋白可以通过共价结合策略生成， 比如PCT申请W02008/016680中所述的策略，其以参考方式被全文合并于此。特别地，化学 结合被用于产生支架蛋白和多核苷酸之间的共价键，其包括NHS-胺结合，硫醇-硫醇结合， 硫醇-马来酰亚胺结合，酰胼-醛结合等等。这些生物结合策略对于本领域技术人员应当 是显而易见的。要和特定多核苷酸编码捕获剂结合的编码多核苷酸的数目可以变化。特别地，附 着于该蛋白组分的多核苷酸的数目可以被调整，以最小化尺寸，并由此最小化该待定部分 的空间位阻，而仍然保持结合特异性。该优化可以通过PCT申请WO 2008/016680中所示方 法进行，其以参考方式被全文合并于此。(见图3和实施例3)在这些实施方式中，捕获剂的 优化可以化学方式进行(即不同化学计量的反应性小分子与捕获剂(例如抗体))。在一些实施方式中，要附着于各蛋白的编码多核苷酸的数目可以是1至6，甚至大 于6的任何一个数字。在一些实施方式中，比如细胞分类，每支架附着1到4个编码多核苷 酸，其提供进一步的优点在于，可以最小化标记的空间效应，并因此允许为了与互补基质多 核苷酸的高亲合力杂化用复数个编码多核苷酸标记多核苷酸编码捕获剂。形成该待定部分的多核苷酸的长度还可以被控制，以优化多核苷酸编码捕获剂与 基质的结合。特别地，该编码多核苷酸的长度可以为了正交化目的而被优化。在这些实施 方式中，编码区域包含20mer识别序列。这些是根据PCT申请WO 2008/016680示范的方法 以计算机产生的，其以参考方式被全文合并于此。特别地，包含实施例中提及的限制位点的 这些序列是通过将6个碱基切割位点附加至原本根据PCT申请WO 2008/016680示范的方 法产生的序列而产生的，其以参考方式被全文合并于此。该基质多核苷酸可以通过本领域已知的技术生产。例如，首先多核苷酸可以被化 学合成。这些核苷酸即可以是根据I^t Brown在斯坦福[参考文献46]所列范例定点标示。 然后技术人员可以根据对本文公开内容的理解将这样生成的基质多核苷酸附着于基质。特 别地，适合于生产基质多核苷酸的多核苷酸在聚赖氨酸基质上包括至少75mers长度。在一些实施方式中，编码多核苷酸和/或基质多核苷酸被正交化，以最小化编码 多核苷酸和基质多核苷酸的非特异性结合。相应地，正交化的多核苷酸包括序列为计算机生 成以最小化残缺碱基对，亚稳状态和/或其它二级结构的多核苷酸，以最小化多核苷酸之间 的非特异性相互作用和通常与相关序列的随机生成有关的在多核苷酸中的非线性二次干扰。本文所用的术语“正交化”指由计算生成一组多核苷酸的进程，其中残缺碱基对， 亚稳状态及其它二级结构被最小化，以使得多核苷酸只结合互补链而不结合其它。用于此 公开内容的示范性的正交化技术包括根据Dirks等人所列范例[参考文献47]进行的正交 化，其以参考方式被全文合并于此。特别地，在一些实施方式中，编码多核苷酸和相应的互补基质多核苷酸为正交化 的多核苷酸，比如多核苷酸A，B，和C，其被详细描述于实施例6和图5，6，9-13，15，17，19， 22，以及多核苷酸AEcoRI，BBamHI，其被描述于实施例7和图16。
其它正交化的多核苷酸可以通过一些方法和步骤进一步加以确定，比如根据技术 人员基于对本文公开内容的理解显而易见的方法的计算正交化(即电脑化的正交化)。此处描述的用MHC作为结合分子的模块化多核苷酸编码捕获剂可以使用[参考文 献33]中广泛描述的步骤进行制造，其以参考方式被全文合并于此。依据这种步骤，可以首 先合成通过受控刺激可修饰的牺牲肽，来产生ρ/MHC蛋白分子的库。例如，在若干实施方式 中，此牺牲肽包含非天然氨基酸，其含有硝基-苯基侧链。此官能团是紫外线不稳定的；因 此在紫外线存在下，该牺牲肽被断裂为两个较小的肽。因此可以产生呈递该牺牲肽的P/MHC 复合物，将全部复合物暴露于紫外线，而在包含摩尔过量交换肽的溶液中实行后者。接触紫 外线后，该牺牲肽将被断裂为两部分，并将为全长的交换肽置换，MHC因其将具有更高的亲 合力。通过使用肽库，将可以在一个紫外线交换步骤中产生巨大的Ρ/MHC库。此处公开的方法和系统可以被用于进行靶标的检测分析，包括单参数分析，和多 参数分析，其全部可以作为多重分析被进行。本文所用的术语“单参数分析”指为测定一个靶标的存在，缺乏，或者数量所进行 的分析。术语“多参数分析”指为了测定复数个靶标的存在，缺乏，或者数量所进行的分析。 术语“多重的”或者“多重化的”分析指在单个反应室中进行多重分析反应的分析，例如多 重被分析物的同时分析，和/或以单一的分隔及检测形式进行的分析。在一些实施方式中，此处公开的方法和系统可以有利地被用于进行诊断分析，其 中要被检测的一个或多个靶标是与预定疾病有关的预定生物标记物。在从通常不均质的组 织样品的不同区域各自测量不同类别的生物材料和生物分子，因此会引入不可避免且难以 测定的干扰源的诊断方法中，这些实施方式特别有利。在一些此处公开的方法和系统的实施方式中，多核苷酸编码捕获剂和基质多核苷 酸被用于组合物中，如图3，4，21所示。在图3，4，21所示的实施方式中，此处公开的多核苷酸编码捕获剂形成蛋白阵列， 其可以接触样品以检测该样品中的靶标。图3，4，21的实施方式对于检测和/或分类蛋白 靶标特别有利。在其它特别适于检测和/或分类细胞靶标的实施方式中，一些或者全部模块化多 核苷酸编码捕获剂在用互补的基质多核苷酸接触模块化的多核苷酸编码抗体之前接触样 品。在这些其它实施方式中，该抗体和一个或多个相应的靶标可以在不存在基质的情况下 结合，例如在液相中，其中两个分子均具有完全的定向自由度并且该靶标对该亲合剂的结 合部位的接入不会被该基质削弱。另外，与现有技术的相应方法和系统相比，所进行的分析 的灵敏度和特异性，以及结合至该基质的模块化多核苷酸编码的靶标复合物的探测能力可 以被改进。显示以上一些优点的示范性的实施方式被示意于实施例12和图17中。在一些实施方式中，多重细胞类型可以在阵列上通过使用蛋白结合剂库进行分 类，在该库中它们结合的支架用不同的多核苷酸进行编码，以使得各个不同的蛋白结合体 的特异性由不同的DNA序列编码。此方法的在实践中实施例示意于实施例8-11和图5b， 12b, 15b, 16 中。在此处公开的方法和系统的一些实施方式中，结合至基质的模块化多核苷酸编码 靶标复合物最后从该基质被检测。在一些实施方式中，通过提供标记分子进行复合物的检测，其包括可以特异性结合要检测的模块化多核苷酸编码蛋白靶标复合物(例如抗体，适配子，肽等等)的任何分 子，以及提供标记信号的标记，附着于该分子的标记化合物。将该标记分子与该多核苷酸编 码捕获剂-靶标复合物接触，则技术人员依据对本文公开内容，特别是实施例部分的理解， 即可检测来自该基质上结合于多核苷酸编码捕获剂-靶标复合物的标记化合物的标记信号。在如下更详细叙述的一个或多个靶标和/或复数个靶标被检测的实施方式中，标 记分子可以由复数个标记分子形成。各标记分子包括特异性结合一个或多个靶标/复数个 靶标中一个靶标的分子，以及附着于该分子的标记化合物，该标记化合物提供标记信号，各 标记分子之间是检测可区分的。本文所用的关于标记分子的词语“检测可区分的”指基于附着于该分子的标记化 合物提供的标记信号可区分的分子。可以被用于提供检测可区分的标记分子的示范性标记 化合物包括但不限于放射性同位素，荧光发生团，化学发光染料，发色团，酶，酶基质，酶协 同因子，酶抑制剂，染料，金属离子，纳米微粒，金属溶胶，配位体(比如生物素，抗生物素蛋 白，链霉亲和素或者半抗原)以及技术人员依据对本文公开内容的理解可以确认的其它化 合物。在一些实施方式中，将复数个标记分子和复数个模块化多核苷酸编码捕获剂-靶 标复合物在允许该复数个多核苷酸编码捕获剂靶标复合物与该复数个标记分子结合的条 件下接触一段时间。然后在该基质上从结合于该复数个模块化多核苷酸编码捕获剂-靶标 复合物的复数个标记分子检测标记信号。在一些实施方式中，检测方法可以通过荧光读数方法进行，其中被标记的抗体是 用荧光发色团进行标记，其包括但不限于小分子染料，蛋白发色团，量子点，和金纳米微粒。 特别地，在一些此处公开的任何方法和系统的实施方式中，可以在金纳米微粒标记的第二 检测系统中进行检测，其中普通的照相显影溶液可以放大金纳米微粒，进一步内容如下所 述。而且，如果读数来自金颗粒的暗视野散射，则启动单个分子数字式蛋白组学方法。技术 人员依据对本文公开内容的理解可以确认的其它技术将不作详细讨论。本文所用的作为复合物或者分子的组分的术语“标记”和“标记分子”指能检测的 分子，其包括但不限于放射性同位素，荧光发生团，化学发光染料，发色团，酶，酶底物，酶协 同因子，酶抑制剂，染料，金属离子，纳米微粒，金属溶胶，配位体(比如生物素，抗生物素蛋 白，链霉亲和素或者半抗原)等等。术语“荧光发生团”指在可检测的图像中能够显现荧光 的物质或者其一部分。因此本文所用的词语“标记信号”指容许该标记检测的标记发射出 的信号，其包括但不限于放射能，荧光，化学发光，酶促反应产物中化合物的产生等等。特别 地，金纳米微粒可被用于三明治形式的检测分析，其中检测复合物被连接至金纳米微粒。这 在小分子类蛋白，肽等等的检测最为相关，因为检测细胞可以简单采用传统的显微技术进 行。在一些实施方式中，检测一种特定靶标。在这些实施方式中，可以在将该多核苷酸 编码捕获剂与基质接触之前或者之后将模块化多核苷酸编码捕获剂与该靶标接触。特别 地，形成该模块化捕获剂的单元可以在单一的反应混合物中被接触。然而，此种方法将要求 支架和结合分子之间，以及支架和编码多核苷酸之间具有特异性(其通常已经为特异性)。模块化多核苷酸编码捕获剂与靶标的接触在模块化多核苷酸编码蛋白与基质接触之前进行的实施方式特别适合于细胞分类或者检测。此方法被示范于实施例12和图17 中。模块化多核苷酸编码捕获剂与靶标的接触在模块化多核苷酸编码蛋白与基质接 触之后进行的实施方式特别适合于高灵敏度的蛋白分类或者检测。此处公开的多核苷酸编码捕获剂与靶标的接触在多核苷酸编码捕获剂与基质 接触之后进行的方法和系统的实施方式被示范于实施例3，7，8，9，10，11和图5-6，9-13， 15-16，19，22中。在这些实施方式中，结合于靶标的多核苷酸编码蛋白和非结合于该靶标的 多核苷酸编码蛋白之间对于相同的特定基质的竞争可以被去除，并且分析的灵敏度因此被 增加。进一步地，在这些实施方式中，基质上的多核苷酸的浓度可以被优化，以使得高浓度 的多核苷酸编码捕获剂可以结合至该基质，根据调节各结合的热力学平衡法则，这将接着 使正确组装的复合物的浓度更高，随之增加总体检测灵敏度。可以用图5&，6，9-11，12六(；，1313，15&(1，1713，19，22和实施例 1,7-10 中示范的方法
和系统进行的单参数分析包括但不限于，用于血清中单一标记物检测，生物样品中单一蛋 白检测，根据表面标记物的细胞分类，以及技术人员依据对本文公开内容的理解可以确认 的其它分析中的任何分析方法。特别地，可以在样品CD8细胞，CD4细胞或者抗原特异性T-细胞(即在T细胞受 体(TCRs)上彼此区别的细胞，这给予它们抗原特异性)中进行单参数分析检测。在一些实施方式中，根据实施例3，8，10和11，以及图3-6，12b，15b，16，22所示的 策略，进行了复数个靶标的检测。在一些实施方式中，可以生产由复数个结合可区分的并且位置可区分的模块化多 核苷酸编码捕获剂组成的蛋白阵列。这些实施方式特别有利于不同蛋白-靶标的高灵敏度 分类和/或检测。在其它实施方式中，复数个模块化多核苷酸编码捕获剂在接触基质多核苷酸之前 和样品接触，以检测相关靶标。在这些实施方式中，此处公开的方法和系统可被用于进行多 重的多参数分析，其中由于和结合蛋白与靶标在无基质时的结合有关的改进的灵敏度和选 择性，并虑及被减少的生物淤积和蛋白变性，许多生物标记物可以有效地被定量和/或定 性检测。可以用实施例3，8-11和图3-6，12b，15b，16，22所示方法和系统进行的多参数 分析包括但不限于任何蛋白组分析，组织分析，血清诊断，生物标记物，血清描绘(serum profiling)，多参数细胞分类，单细胞研究，和本领域技术人员依据对本文公开内容的理解 可以确认的其它分析方法。在一些这类实施方式中，可以进行多参数分析，以多重检测方式在样品⑶8细胞， CD4细胞和抗原特异性T细胞中进行检测。复数个靶标由不同类型的细胞组成的方法和系统的实施方式相比于现有技术的 相应的方法和系统(比如细胞与印在基础基质上的表面标记物-特异性抗体相互作用的淘 选[参考文献48])特别有利。特别地，相对于现有技术方法和系统，由于捕获抗体的淘洗 和三级结构通过吸收/共价附着于普通衍生基质而有害地和不可逆地被损坏，基质上的细 胞捕获效率可以被改进。和实施例7和图10和11所示的NACS比较，这导致较低反应性的 表面。
在若干实施方式中，此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂被用于细胞分类方法。用实施例1-11和图3-13，15-17，19，21，22所示的方法和系统可实施的分类靶标 的分析方法包括需要检测混合物中的特定靶标(包括但不限于细胞靶标，蛋白-靶标或者 基因靶标)的任何分析方法，这是技术人员依据对本文公开内容的理解可以确认的。特别地，此处描述的方法和系统允许从细胞类型复合混合物中至少1 1000稀度 进行特定细胞类型的多重分类。即使在细胞特异性亲合剂呈现相对弱的结合亲合力时，这 种稀少细胞的分类也被证实。在一些实施方式中，用于编码捕获剂的多核苷酸(“例如DNA低聚物”)被设计成 包括不同的限制性内切酶位点，其可以被互补的限制性核酸内切酶裂开(此处也称可释放 的多核苷酸捕获剂)。特别地，这些限制位点被包括，以使得不同的限制性内切酶识别结合可区分捕获 剂上不同的DNA序列。因此通过使用复数个不同限制性内切酶，不同群体的捕获剂的粘着， 以及由此而来的不同群体的靶标，特别是细胞，可以通过添加对用于分类该细胞类型的序 列特异性的互补限制性内切酶而被独立地控制。释放的细胞可以通过细胞富集培养在体内 扩张，或者可以用本文公开内容所述的单参数或者多参数分析方法进行基因组或者蛋白生 物学分析(例如PCR，蛋白质印迹等等)。采用多核苷酸编码捕获剂的任何捕获靶标的控制释放将允许用其它常规的生物 分析技术进一步分析该靶标，如PCR，质谱，蛋白质印迹等等，以及技术人员可以确认的其它 技术。相应地，在一些实施方式中，此处描述的可释放的多核苷酸编码捕获剂可被用于 相关的方法，其中提供靶标，特别是复数个靶标，该多核苷酸编码捕获剂和靶标以及附着有 基质多核苷酸的基质在允许多核苷酸-编码捕获剂-靶标复合物形成于基质上的条件下接 触一段时间。然后将针对可释放的多核苷酸编码捕获剂的限制位点的限制性内切酶和可释 放的多核苷酸-编码捕获剂-靶标复合物接触，以允许该互补限制位点裂开，由此允许包括 该与限制性内切酶互补限制位点的可释放的多核苷酸-编码捕获剂-靶标复合物的选择性 释放。在一些实施方式中，用此处描述的方法进行的释放可以被选择性控制，以通过受控方 式(例如在不同的时间)释放不同的可释放多核苷酸-编码捕获剂-靶标复合物。在一些实施方式中，可释放的多核苷酸-编码捕获剂是此处描述的模块化多核苷 酸编码捕获剂。特别地，在一些实施方式中，根据此方法的可释放的模块化多核苷酸编码捕 获剂进一步包括连结物分子，以允许此处描述的模块化多核苷酸编码捕获剂的控制释放， 由此允许缺少该捕获剂时对靶标的其它分析。在若干实施方式中，在阵列中捕获的靶标，特别是在阵列上捕获的细胞也将接受 进一步的分析。特别地，可以使用免疫-PCR以描绘细胞表面受体。此外或者另外，可以采 用一组多核苷酸编码捕获剂，比如以参考方式被全文合并于此的WO 2008/016680所述的 捕获剂进行这种分析，其可以根据实施例16和图20-22所示方法进行。特别地，在图20-22 的实施例中，抗靶标表面生物标记物的抗体被独特的DNA序列标记。然后这些多核苷酸编 码抗体被用于染色在该阵列上被捕获的细胞。该编码抗体上的DNA标记即可被分析，且这 些靶标细胞生物标记物的存在或者缺乏将和该细胞生物标记物相关的DNA标记的存在或者缺乏相关联。这些DNA标记可以用常规方法检测，如PCR，测序，微阵列，以及技术人员可 以确认的其它技术。相应地，在一些实施方式中，此处描述的多核苷酸编码捕获剂和模块化多核苷酸 编码捕获剂可被组合用于检测，特别是分析靶标的方法中，其中至少一个模块化多核苷酸 编码捕获剂和多核苷酸编码捕获剂和靶标和/或附着在基质上的基质多核苷酸接触，以形 成模块化多核苷酸编码捕获剂-靶标复合物和/或多核苷酸编码捕获剂靶标复合物。其它 多核苷酸-编码捕获剂和/或模块化多核苷酸编码捕获剂可以进一步和这些复合物接触， 以允许和该靶标和/或该靶标上呈现的其它靶标结合，以形成其它多核苷酸-编码捕获剂 复合物。因此可以检测其它多核苷酸-编码捕获剂和/或模块化多核苷酸编码捕获剂与其 它靶标的复合物。基于使用可释放的多核苷酸捕获剂和/或含有连结物，特别是条件性连 结物的多核苷酸-编码捕获剂，其它变体对于技术人员将是显而易见的。在其它实施方式中，此处公开的任何方法和系统的基质可以和微流组分有关，因 此允许基于分析的微流操作。基于分析的微流具有各种优点，比如减少样品和试剂体积，缩 短分析时间[参考文献49]。例如，在某些操作条件下，表面结合分析动力学主要通过被分 析物(蛋白)浓度和被分析物/抗原结合亲合力被测定，而不是通过扩散测定[参考文献 50] ο本文所用的术语“微流”指具有微流特征的组分或者系统，如通常以微米或者亚微 米尺度制造的通道和/或腔室。例如，代表性的通道或者腔室至少具有一个横截面的尺寸 在约0. 1微米至约1500微米范围内，更具有代表性地为约0.2微米至约1000微米，更具有 代表性为约0. 4微米至约500微米。个别的微流特征通常容纳非常小量的流体，例如约10 纳升至约5毫升，更具有代表性地为约100纳升至约2毫升，更具有代表性地为约200纳升 至约500微升，或者更具有代表性地为约500纳升至约200微升。微流组分可以被包括于集成器件中。在此应用时，“集成器件”指具有两个(或以 上)彼此物理式或者操作式联合的器件。这些组分可以(全部或者部分)被彼此分离地制 造并在它们的(完全或者部分)制造后被联合，或者该集成器件可以被制造为将不同组分 包括于该集成器件中。集成的微流阵列装置包括被联合至微流组分的阵列组件，其中该微 流组分和该阵列组件彼此成可操作的联合，以使得该阵列组件的阵列基质和该微流组分的 微流特征呈流体连通。微流组分是包括微流特征，并且适合于和阵列组件成可操作联合的 组分。阵列组件是包括基质，并且适合于和微流组分成可操作联合的组分。该微流系统还可以为模块化的形式。“模块化的”表示系统或装置具有多个一起应 用的标准化组分，其中一类组分的多个不同实施例之一可以被另一个同类组分代替，以改 变该系统或装置的功能或者性能；在这种系统或装置中，每一个标准化组分即为“模块”。在此处公开的方法和系统的微流实施方式中，在极小的样本体积和非常紧缩的基 础/生物淤积中进行大面板蛋白生物标记物的测量是可能的。在此处公开的方法和系统的微流实施方式中，还可以提升分析的灵敏度。另外，此处公开的微流方法和系统允许进行(i)单步骤分析(其中多核苷酸编码 捕获剂一个或多个靶标和标记抗体在单一步骤中接触)和(ii)减少时间内的多步骤分析 (其中基质被连续地暴露于模块化多核苷酸编码捕获剂，一个或多个靶标，然后是第二抗 体)，和现有技术的相应微流方法和系统以及其它用于分子检测的非微流方法和系统相比，
29其样品尺寸减少，灵敏度更高。其它与此处公开的微流方法和系统有关的优点包括，可以在微流环境中进行任何 涉及基质支持抗体的分析，而用现有技术不可能有微流芯片组件可以继续存在。与此处公开的方法和系统有关的进一步的优点为可以用低成本试剂进行灵敏的 测量，比如用玻璃，塑料；以及可以将基质与其它组分组合应用与样品预处理和提纯。此处公开的方法和系统允许多重的多参数检测，分类，和所感兴趣的生物标记物 以及相关的诊断分析。此处公开的用于诊断分析的方法和系统的应用示范描述于实施例 9-10和图13-15,21-22中，以及技术人员依据对本文公开内容的理解可以确认的任何其它 分析方法。特别地，在图13-15的示范性的诊断分析中，用来自人PBMCs的NACS导向检测抗 原特异性T细胞群体。这些T细胞的检测对于诊断目的很重要，因为它们参与抗癌和病毒 病原体的免疫反应。治疗学分析的实施例作为替代提供于图13中。在此人PBMCs用对于 癌症有关抗原特异性的TCR进行转染。这些T细胞在随后注入患者之前在NACS阵列上被 检测。此处公开的系统可以为阵列或者部分试剂盒的形式。阵列有时候被称为“微阵 列”，其包括可寻址区域的任一种一维，二维或者三维空间布置，该可寻址区域带有和该区 域有关的特定分子。通常该特征尺寸是微米。实施例3-11，图3-6,9-13，15-17，19,21-22 提供了示范性的微阵列。在部分试剂盒中，该模块化多核苷酸编码捕获剂和/或任何有关的组分独立地和 基质一起被包含于该试剂盒中。特别地，该模块化多核苷酸编码捕获剂可以被包括于一种 或多种组合物中，并且每一种模块化多核苷酸编码捕获剂均可以和适宜的媒介载体或者助 剂一起被包含于组合物中。提供于该系统的基质可以具有附着其上的基质多核苷酸。在一些实施方式中，该 基质多核苷酸可以进一步被提供为该试剂盒的其它组分。其它组分可以包括标记了的多核 苷酸，标记了的抗体，标签，微流芯片，参照标准，和技术人员依据对本文公开内容的理解可 以确认的其它组分。特别地，该试剂盒的组分可以被提供为具有适宜的说明及其它必要的 试剂，以实行此处公开的方法。该试剂盒通常将在单独的容器中包含所述组合物。用于实 施该分析方法的说明，例如书面或者声音的在纸上或者电子载体(比如磁带或者CD-ROMs) 上的说明，将通常被包含于该试剂盒中。根据使用的特定方法，该试剂盒还可以包含其它封 装的试剂和材料(即洗涤缓冲剂及类似物)。本领域技术人员依据对本文公开内容的理解可以确定关于所述组合物的适宜的 载体或者助剂的识别的更详细资料，通常是该试剂盒的制造和包装。
具体实施例方式此处公开的方法和系统被进一步示范于下列实施例中，其用于示例而不是限制。 ^mm ι sac支奥g白的牛产SaC的表达根据在先出版的规程[参考文献36]进行。简而言之，克隆入pET_3a 质粒的链霉亲和素-半胱氨酸6aC)基因是来自TakeshiSano博士(Harvard Medical School)的慷慨礼物。克隆选择和整夜开始培养后，包含该质粒的BI21 (DE;3)-pLysE通过在LB媒介中振动在37°C下生长，并对于pET-3a-SaC选择抗生素氨苄西林(501tg/ml)，对于 PLysE选择氯霉素Q51tg/ml)。当A600达到0. 6时发生细胞诱导，在该处加入b_D_硫代 半乳糖苷(IPTG)至0. 4mM的最终浓度。接着在37°C保持诱导细胞4小时。然后在1600g 离心培养物10分钟，并用IOOmM NaCl,lmM EDTA, IOmM Tris-HCl, pH 8. 0洗涤。然后用溶 胞缓冲液溶化细胞(2mM EDTA, 30mM Tris-HCl, 0. 1% Triton X-100, pH 8.0)。为了减少该溶液的粘性，该溶胞产物随后用去氧核糖核酸酶和核糖核酸酶(各 101tg/ml, J2mM MgS04)在室温下处理20分钟。然后通过在39，OOOg离心15分钟将不可 溶的包含体与该溶胞产物分离，之后用溶胞缓冲液再次洗涤沉淀物。将该沉淀物溶解于6M 胍-HCl，pH 1. 5至原始培养体积。为了去除细胞生物素，将IOOml的溶解沉淀物溶液在IL 的pH 1. 5的6M胍-HCl中进行渗析。然后将渗析液转移至pH 6. 0的0. 2M醋酸钠，以去除 胍并重折叠&iC。这里关键之处是去掉搅拌棒缓慢进行渗析。然后在3000g旋转渗析液10 分钟，以去除沉淀析出物，并将其过滤通过0.2 ！ -LmtllteH次微粒)。最后以的50mM碳 酸氢盐，500mM NaCl, pH 11对重折叠的SaC进行渗析。如下对&iC进行提纯。将重折叠的SaC和结合缓冲液(50mM碳酸氢钠，500mM NaCl, IOmM b-Me, pH 11)1 1混合。用10毫升结合缓冲液洗涤装有1. 5毫升亚氨基生物素琼 胶糖树脂(Pierce)的重力柱。然后将该重折叠混合物添加至该柱，收集流出部分并再次 添加至该柱，以最大化回收。用20毫升结合缓冲液洗涤该柱后，用pH4的洗脱缓冲液 (50mM乙酸钠，IOmM -Me)洗出&iC。以0D280监视，收集包含的部分，缓冲液更换为 包含IOmM -Me的PBS，并用IOK mwco过滤器(Millipore)浓缩至1毫克/毫升的最终浓 度。如下进行SaC低聚核苷酸结合。在使用之前，用脱盐柱(Pierce)将原料SaC缓冲 液更换为含有5mM TCEP的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(TBS)。TCEP是含还原剂的nonthiol， 其在结合期间保持SaC的还原形式。将MHPH(3-N-马来酰亚胺基-6-胼吡啶盐酸盐， Solulink)的DMF溶液在300 1摩尔过量下加入&iC。同时将SFB的DMF溶液(琥珀酰 亚胺基4-甲酰苯甲酸酯，Solulink)以40 1摩尔过量添加至5'胺化低聚物(IDT)。该混合物在室温下反应3-4小时。用脱盐旋转柱(Pierce)去除过量MHPH和SFB， 缓冲液更换为柠檬酸盐缓冲液(50mM柠檬酸钠，150mM NaCl, pH 6.0)。然后将该SFB标记 的低聚物以20 1摩尔过量和该衍生的SaC结合，并在转移至4°C培育整夜之前在室温下 使其反应2-3小时。用Wiarmacia Superdex 200凝胶过滤柱以0. 5毫升/分钟等浓度PBS 流去除未反应的低聚物。用10K mwco浓度过滤器(Millipore)浓缩包含该MC-低聚物轭 合物的部分。用非还原的8% Tris-HCI SDS-PAGE检验&iC-低聚物构造的合成。实施例 2 制造微阵列DNA微阵列是通过标准方法用系统生物学研究所(ISB-西雅图，WA)的微阵列设 备印在胺涂覆玻片上。代表性的点尺寸是600f. lm(SMPXB 15针，Arrayit)。全部DNA链为 购买的集成DNA工艺，并且全部补体均为5'胺化。全部六个3D-mers的序列及其相应的标 识给出于下表1和下表2中。表1.序列标识
权利要求
1.一种模块化多核苷酸编码捕获剂，其被设置为与靶标特异性结合，该模块化多核苷 酸编码捕获剂含有至少一个被设置为与靶标特异性结合的结合分子，被设置为与附着于基质的基质多核苷酸特异性结合的编码多核苷酸，和被设置为以位置可区分的支架结合区域与该至少一个结合分子和该编码多核苷酸结 合的支架分子，该位置可区分的支架结合区域被布置在支架分子上，以在该至少一个结合分子以及该 编码多核苷酸附着后，呈现至少一个用于特异性结合靶标的结合分子和呈现用于特异性结 合该基质多核苷酸的编码多核苷酸。
2.如权利要求1所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，其中该支架结合域包括用于结合该至少一个结合分子的第一支架结合区域，以及用于结合 该编码多核苷酸的第二支架结合区域，和其中该第一支架结合域和该第二支架结合域通过正交化学过程结合该至少一个结合 分子和该编码多核苷酸。
3.如权利要求2所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，其中该第一支架结合域和该第二 支架结合域被布置在该支架结合分子上，以最小化结合于该支架分子的该至少一个结合分 子和结合于该支架分子的该编码多核苷酸之间的相互作用。
4.如权利要求1至3任一项所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，其中该支架分子包括 多个第一支架结合域和/或多个第二支架结合域。
5.如权利要求4所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，其中该支架分子上的每一个多重 第一支架结合域结合至该至少一个结合分子，并且该支架分子上的每一个多重第二支架结 合域结合至该编码多核苷酸。
6.如权利要求2至5任一项所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，其中该第一支架结合 域用连结物分子结合至该至少一个结合分子，该连结物分子用至少一个结合分子连接第一 支架结合域。
7.如权利要求6所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，其中该连结物分子是条件性连结物。
8.如权利要求1至7任一项所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，其中该至少一个结合 分子包括用于结合靶细胞的多个相同的或者不同的结合分子。
9.如权利要求1至8任一项所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，其中该编码多核苷酸 包括至少一个布置限制性内切酶位点，其被布置在该编码多核苷酸中，以用于通过相应的 限制性内切酶裂解。
10.如权利要求1至9任一项所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，其中至少一个该支架 分子和该至少一个结合分子是蛋白。
11.如权利要求10所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，其中该支架分子是链霉亲和 素，SAC, SAC3，抗体或者其优化变体。
12.如权利要求10或11所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，其中至少一个结合分子是 MHC 二聚物，MHC三聚物，或者MHC四聚物，适配体，小分子或者抗体。
13.如权利要求1至12任一项所述的模块化多核苷酸编码捕获剂，其中该模块化多核苷酸编码捕获剂是极性的模块化多核苷酸编码捕获剂。
14.一种在样品中检测靶标的方法，该方法包括将附着于基质的基质多核苷酸和模块化多核苷酸编码捕获剂结合，该模块化多核苷酸 编码捕获剂包括结合至少一个结合分子和编码多核苷酸的支架分子，其中该至少一个结合 分子特异性结合至该靶标，并且该编码多核苷酸特异性结合至附着于该基质的该基质多核 苷酸；和检测与附着于该基质的基质多核苷酸结合的模块化多核苷酸编码捕获剂-靶标复合物。
15.如权利要求14所述的方法，其中将附着于基质的基质多核苷酸和模块化多核苷酸 编码捕获剂进行结合是通过提供附着于该基质的基质多核苷酸；提供包括附着有至少一个结合分子和编码多核苷酸的支架分子的模块化多核苷酸编 码捕获剂，其中该至少一个结合分子特异性结合至该靶标，并且该编码多核苷酸特异性结 合至该基质多核苷酸；和将该模块化多核苷酸编码捕获剂和样品并且和基质在允许该结合分子和模块化多核 苷酸编码捕获剂-靶标复合物中的靶标结合的条件下接触一段时间；和将该编码多核苷酸与该基质多核苷酸结合。
16.如权利要求14所述的方法，其中该模块化的多核苷酸捕获剂是权利要求1至13任 一项所述的模块化的多核苷酸捕获剂。
17.一种用于在样品中检测靶分子的系统，该系统包括具有附着于该基质的基质多核苷酸的基质；至少一个特异性结合靶标的结合分子，特异性结合附着于该基质的该基质多核苷酸的编码多核苷酸，和被设置为以位置可区分的支架结合区域与该至少一个结合分子和该编码多核苷酸结 合的支架分子，该位置可区分的支架结合区域被布置在该支架分子上，以在和该至少一个结合分子和 该编码多核苷酸结合后，呈现至少一个用于特异性结合靶标的结合分子和呈现用于特异性 结合该基质多核苷酸的编码多核苷酸。
18.如权利要求17所述的系统，其中该支架结合域包括用于结合该至少一个结合分子 的第一支架结合区域和用于结合该编码多核苷酸的第二支架结合区域，和其中该第一支架结合域和该第二支架结合域通过正交化学过程结合该至少一个结合 分子和该编码多核苷酸。
19.如权利要求18所述的系统，其中该第一支架结合域和该第二支架结合域被布置在 该支架结合分子上，以最小化结合于该支架分子的该至少一个结合分子和结合于该支架分 子的该编码多核苷酸之间的相互作用。
20.一种用于分类复数个靶标中的靶标的方法，该方法包括将复数个附着于基质的基质多核苷酸和复数个模块化多核苷酸编码捕获剂结合，各基 质多核苷酸是序列特异性和彼此位置可区分的，并且该复数个模块化多核苷酸编码捕获剂 中每一个模块化多核苷酸编码捕获剂包括附着有至少一个结合分子和编码多核苷酸的支架分子，其中该至少一个结合分子特异性结合每一个该复数个靶标，并且该编码多核苷酸 特异性结合该复数个基质多核苷酸中序列特异性和位置可区分的基质多核苷酸，每一个结 合分子和编码多核苷酸彼此是结合可区分的；和在复数个结合至基质的模块化多核苷酸编码捕获剂-靶标-复合物中分类该复数个靶标。
21.如权利要求20所述的方法，其中该复数个模块化多核苷酸编码捕获剂包括权利要 求1至13任一项所述的模块化多核苷酸编码捕获剂。
22.一种用于在样品中分类复数个靶标中的靶标的方法，该方法包括提供复数个附着于基质的基质多核苷酸，各基质多核苷酸是序列特异性和彼此位置可 区分的；提供复数个模块化多核苷酸编码捕获剂，各模块化多核苷酸编码捕获剂包括附着至少 一个结合分子和编码多核苷酸的支架分子，其中该至少一个结合分子特异性结合该复数个 靶标中的预定靶标，并且该编码多核苷酸特异性结合该复数个基质多核苷酸中序列特异性 和位置可区分的基质多核苷酸，各结合分子和编码多核苷酸是彼此结合可区分的；将该复数个模块化多核苷酸编码捕获剂和该样品在允许该至少一个结合分子和该靶 标结合的条件下接触一段时间，由此提供复数个模块化多核苷酸编码捕获剂-目标体系； 和将该复数个模块化多核苷酸编码捕获剂-目标体系和该复数个基质多核苷酸在允许 该编码多核苷酸结合至附着于该基质的该基质多核苷酸条件下接触一段时间，由此在复数个结合至基质的多核苷酸-编码蛋白-靶标-复合物中分类该复数个靶标。
23.如权利要求22所述的方法，其中该复数个模块化多核苷酸编码捕获剂包括权利要 求1至13任一项所述的模块化多核苷酸编码捕获剂。
24. 一种用于分类复数个靶标的系统，该系统包括具有复数个附着于基质的基质多核苷酸的基质，附着于该基质的该复数个基质多核苷 酸的各多核苷酸是序列特异性和彼此位置可区分的；复数个结合分子，各结合分子特异性结合该复数个靶标中的互补靶标， 复数个编码多核苷酸，各编码多核苷酸特异性结合附着于该基质的该复数个基质多核 苷酸的每个多核苷酸，至少一个支架分子，其被设置为用位置可区分的支架结合区域结合该复数个结合分子 中每个结合分子，以及该复数个编码多核苷酸中每个编码多核苷酸，该位置可区分的支架结合区域被布置在该支架分子上，以在和该至少一个结合分子和 该编码多核苷酸结合后，呈现至少一个用于特异性结合靶标的结合分子和呈现用于特异性 结合该基质多核苷酸的编码多核苷酸。
25.一种支架分子，包括被设置为附着至少一个结合分子的第一支架结合区域和 被设置为附着编码多核苷酸的第二支架结合区域，其中该至少一个结合分子被设置为与靶标特异性结合，并且该编码多核苷酸被设置为 与附着于基质的基质多核苷酸特异性结合；和其中该第一支架结合域和该第二支架结合域是位置可区分的，并被布置于该支架分子 中，以在该至少一个结合分子和该第一结合域结合，并且该编码多核苷酸和该第二结合域 结合后，最小化该至少一个结合分子和该编码多核苷酸之间的相互作用。
26.如权利要求25所述的支架分子，其中该支架分子是SAC或者SAC3。
27.一种多核苷酸编码捕获剂，包括 特异性结合靶标的结合分子和附着于该结合分子的编码多核苷酸，其中该编码多核苷酸包括特异性结合至基质多核苷酸的序列，并且该序列包括至少一 个布置限制性内切酶位点，其被布置在该编码多核苷酸中，以用于通过相应的限制性内切 酶裂解。
全文摘要
用于靶标检测的多核苷酸-编码捕获剂，特别是模块化的多核苷酸-捕获剂，以及相关的组合物方法和系统。该多核苷酸-捕获剂包括靶标结合组分，支架组分，和由能够以受控方式结合和分离的标准化分子单元形成的编码组分。
文档编号C12Q1/68GK102112626SQ200980121611
公开日2011年6月29日 申请日期2009年4月9日 优先权日2008年4月9日
发明者凯厄斯·G·拉度, 安东尼·里巴斯, 欧文·威特, 盖布里埃尔·A·古昂, 詹姆士·赫斯 申请人:加利福尼亚大学董事会, 加州理工学院