专利名称：快速检测大肠杆菌和大肠菌群试剂盒及其底物的合成方法
技术领域：
本发明涉及一种生物检测方法，尤其是一种大肠杆菌和大肠菌群的快速检测方法。
大肠杆菌和大肠菌群是国际上公认的药品，食品、临床检验、环境监测、卫生防疫等领域中通用的指标。其检测方法多采用传统的发酵、分离生化检验及多管发酵和膜过滤法。这些方法的主要缺点是操作繁琐、耗时长、成本高，一般需3～5天时间，有可能导致病情的延误，以及物品、食品迟销造成经济损失。
本发明所述试剂盒的底物本发明的目的在于提供一种能够准确、简便、快速、低成本的检测大肠杆菌及大肠菌群试剂盒，并提供该试剂盒所用底物PNP-β-D-葡糖苷酸钠盐技术路线合理、工艺稳定、收率高、成本低的合成方法。
本发明PNP-葡糖苷酸(盐)快速检测大肠杆菌及大肠菌群试剂盒属酶学检测大肠杆菌及大肠菌群。其原理是根据大肠杆菌及大肠菌群中特异性含有β-葡糖苷酸酶(B-G)，在适宜的环境下，与底物PNP-葡糖苷酸(盐)反应，将底物分解成色团(PNP)形成黄色，反应式如下 依据以上原理，以底物PNP-β-D葡糖苷酸钠盐制成底物片，以胆盐乳糖增菌液制成培养基片，以磷酸盐配制0.2mol/L pH＝7.5缓冲液。将分别装有底物片、培养基片及缓冲液的3个瓶子装入一个盒内，组装成两片一水的试剂盒。
本发明所述的试剂盒是以如下方法制成的1、底物、培养基均以纸片为载体，选用0.48mm厚滤纸，三种规格分别为直径6mm圆片，6.25mm×25mm条形，62.5mm×12.5mm条形。
2、底物片的制备称取计算量的PNP-Glucu Na溶解，在无菌操作下浸吸备好的纸片，脱水后于40℃烘干，装入灭菌的棕色小瓶中，2-8℃避光密封保存。含底物分别约为100μg/片，1mg/片，5mg/片。
3、培养基片的制备参考95年版药典培养基浓度半量计算，称取胆盐乳糖增菌液溶，高压灭菌，浸吸备好的纸片，脱水后60℃烘干，装入包装瓶内2-8℃密封保存。培养基约为4mg/片，20mg/片，200mg/片。
4、缓冲液的配制按有关生化书籍，取一定量的磷酸二氢钾和磷酸氢二钠，制成0.2mol/L，pH＝7.5的(PBS)缓冲液，高压灭菌后封口2-8℃保存。
5、组盒装分别装有底物片、培养基片及缓冲液的3个瓶子装入一个盒内，就组成了试剂盒。
根据被测样品不同，试剂盒分为两种规格。
(1)适合医院临床、药检、水检增菌后浓集后等微量取样的试剂盒，见表1。
表1 I型试剂盒(适合100μl取样)
(2)适合环保检测的试剂盒，见表2。
表2 II型试剂盒
该试剂盒中关键的底物是以如下路线合成的。
其具体操作方法步骤如下(1)四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖醛酸甲酯的制备取葡糖醛酸内酯87.5g(0.5mol)，加入1mol/L甲醇钠15ml和无水甲醇485ml混合物，搅拌2h。减压蒸去甲醇，得糖浆。加入醋酸酐330ml，冰浴下滴加吡啶110ml，滴加温度在20℃以下，放冷，过滤粗品，用95％乙醇洗涤，再用95％乙醇重结晶脱色，得针状结晶四-O-乙酰基-β-D吡喃葡糖醛酸甲酯63.8g，产率35％，mp178-179℃。
(2)三-O-乙酰基-α-D-溴代吡喃葡糖醛酸甲酯的制备取红磷9g，加90mL冰醋酸，冰浴搅拌下滴加54g(18ml)溴，维持20℃滴加，静止30min，过滤得橙黄色溴试剂，冰箱密封备用。
取四-O-乙酰基-D-葡糖醛酸甲酯20g，加入溴试剂80ml，室温搅拌溶解，冰箱过夜，次日在15毫米汞柱下，减压浓缩残留物用80ml氯仿溶解，先用水洗，再用饱和的碳酸氢钠溶液洗，分离氯仿层，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸去氯仿，得糖浆。加少量无水甲醇溶解，放入冰箱冻室过夜，次日析出块状结晶三-O-乙酰基-α-D-溴代葡糖醛酸甲酯12.8g，产率62％，mp104-106℃(文献106-107℃)(冰箱密封保存)。
(3)对-硝基苯-三-O-乙酰基-β-D-葡糖苷酸甲酯的合成取三-O-乙酰基-α-D-溴代吡喃葡糖醛酸甲酯11.4g对-硝基苯8g，乙腈50ml，搅拌下缓缓加入新鲜的氧化银7.2g，搅拌2-3小时，过滤银盐，并用乙腈洗涤，合并滤液。减压蒸去乙腈，得糖浆，加无水乙醇，活性碳脱色，过滤，于冰箱内过夜，析晶，得闪亮结晶对-硝基苯-三-O-乙酰基-β-D-葡糖苷酸甲酯6g，产率46.3％，mp154-155℃(文献154℃)。
(4)对硝基苯-β-D-葡糖苷酸钠盐的制备取对-硝基苯-三-O-乙酰基-β-D-葡萄糖苷酸甲酯6g，加入0.2mol/L氢氧化钠20倍量(v/w)，4倍量95％乙醇，搅拌反应，不断补加氢氧化钠溶液，反应物溶解，共8小时，减压浓缩，得到对-硝基苯-β-D-葡糖苷酸钠盐固体。水-乙醇精制后得3.7g，收率81％，220℃(分解)(文献220℃分解)。
分子式C12H12NO9Na·H2O，分子量355.2元素分析理论值C 40.50％，H 3.38％，N 3.94％实测值C 40.16％，H 3.68％，N 3.93％IRKBrmax(cm-1)3200，3368(-OH)，1618(-COOH)，1239(C-O)1537，1394(C-NO2)HNMR(200MC，TMS内标，P2O溶剂)δ3.62(m，3H)，3.91(m，1H)，5.25(d，1H)，7.22(d，2H)，8.23(d，2H)本发明所述的试剂盒的检测方法如下将试剂盒中的内容物缓冲液、培养基片、底物片，加入到水样或各领域经预处理的样品中，37℃恒温箱孵育2-16小时，分解显现黄色的为阳性，以无菌样作空白。通过查MPN表也可定量地检测样品中大肠杆菌及菌群。
表3 检测大肠杆菌步骤
根据需要加空白对照。
应用本发明所述的试剂盒进行了如下检测实例。
1、检测医院临床标本的尿液，分泌物脓汁等的大肠杆菌，取感染尿液4-5ml，置小管中，离心30分钟(300转/分)，倾去上清尿，使用I型盒，加入100μl缓冲液与尿沉淀物混均，加入培养基片一片，再加底物1片，37℃，恒温水浴2-4小时，出现黄色为阳性(以空白菌样对照)，表示大肠杆菌存在数量大于104/ml，可直接诊断为大肠杆菌感染。
2、检测药品中的大肠杆菌按常规进行予处理，取供试品10g，加入灭菌生理盐水，使之成为1∶1均匀供试液，取10ml供试液，加入100ml胆盐乳糖增菌液中置36±1℃培养18-24h，取此增菌培养物5ml，于灭菌的离心管中以3500r/min离心30min，弃去上清液，保留管底残液，加I型试剂盒内容物缓冲液100μl，培养基片及底物片各一片，36±1℃培养2-4小时，观察结果，离心管内与空白管相比形成明显黄色，则为阳性，否则为阴性。本法同时与药典方法比较，40个样品，符合率为100％，可省时44小时。
3、检测地表水总大肠菌群数普通地表水按环保监测法分四管取样即10ml、lml、0.1ml、0.01ml(后三管均稀释至1mL)，加入II型检测盒内容物，分别在各管内加入缓冲液2ml、0.2ml、0.2ml、0.2ml，再分别加入底物片及培养基片大条、小条、小条、小条。37℃温育8-10h，含菌管与空白管相比呈明显黄色，经MPN表得到每升水中的大肠菌群数目，同时与环保常规法对照，符合率100％，只需10小时。
4、检定食品、饮料中的大肠菌群数取食品样品19个，经GB 4789初发酵的阳性样品2ml，离心、弃上清液后加入缓冲液0.1mL分别加入底物片及培养片(I型盒)各一片，37℃保温2-16小时，与空白比产生黄色为阳性，查表MPN得出原始被检样品大肠菌群数。同时用GB 4789方法与之对照，此法符合率为92.8％，操作简便，可省时24-46小时。
5、检测生活饮用水及合成水样的大肠菌群取经预处理的水样100μl于试管内，加入I型试剂盒内容物，100μl缓冲液，培养基片及底物片各一片，37℃温育2h，与空白对照比较呈明显黄色，经查MPN表计算菌数。本法与国标GB5750-85和国际标准IS 09308-2进行比较，符合率为100％，对于接种菌水样1.5-2h出现阳性，省时达24倍。
本发明所述的试剂盒测定的性能实验。
1、灵敏度及最小检出度取标准菌株浊液以10-1递减，各管取1ml，共10管。按前述步骤加入缓冲液，底物片及培养基片37℃孵育，观察各数量级的菌液显色时间和强度(表4)。结果表明，当菌浓4×107时只需0.5小时即呈色，4×100时需12小时，优于文献报道的其它底物法(菌浓108需3小时，100时需16小时)。
表4各菌液的显色时间与强度
注±弱阳性+阳性++弱强阳性+++强阳性-阴性2、特异性取生长菌落142株，用园型底物片及培养基片，如前述步骤操作，37℃温育10-30分钟，出现黄色为阳性。菌总数为142株，已知大肠埃希菌阳性为60株，本法检出阳性58株，其敏感性为96.7％，其它阴性菌为82株，共有5株不符，特异性为96.4％，见表5。
表5本法检测大肠埃希菌的特异性试验
3、底物片含量的稳定性考查冰箱2-8℃避光干燥保存的底物片，存放一年，在一年内定期取样，测定其含量，每次取10份样品，每份10片，定溶测定，求平均值和标准差，并与对照组(0时)比较，做t检验，见表6。
表6存放一年内的底物片含量
2-8℃、避光、干燥条件下保存底物片，存放一年，其底物含量无明显变化。
4、对比实验用本法与环保常规法进行对比实验，见表7。结果本法检测6小时全部显出鲜明黄色(++)，而常规法6小时只见两管(10ml管、1ml管)显色(+)，直至18小时才全部显色。本法与常规法相比，符合率100％，而且显色速度快，操作简便，价格便宜。
表7本法与常规法比较实验
注±弱阳性+阳性++弱强阳性+++强阳性-阴性本发明底物PNP-β-D-葡糖苷酸钠盐的合成方法，简化了操作，缩短了时间，三步分别提高收率15％、10％和16％。本发明的合成技术路线合理，工艺稳定，合成的底物收率高，成本低廉，并在溶解性方面、纯度方面、稳定性方面、价格方面均优于美国Sigma公司的PNP-β-D-葡糖苷酸。本发明为该底物的国产化、商品化奠定了基础。
本发明所述的试剂盒用来检测大肠杆菌，当菌浓4×107时，只需0.5小时；当菌浓4×100时，需12小时，较常规法可省时2-3天，其检测速度优于文献报道的底物4-mu-β-D-半乳糖苷酸(当菌浓108时需要3小时，100时需17小时)；检查60株阳性菌和82析其它菌；其敏感性96.7％，特异性96.4％；由于本试剂盒对肠出血性肠类O157显示阴性，则有利于对肠出血性大肠杆菌(EHEC)的鉴别；本发明所述的试剂盒操作简便，不需特殊仪器和设备，而且成本特别低廉，如取微量100μl菌样，完成一个样品的检验，需成本费(除人工、水电)还不足一分钱；稳定性考查显示，底物片2-8℃密封避光保存数月至一年，稳定性良好。综上所述本发明所述的试剂盒的研究成功表示一种能快速、准确、方便、特异性强、成本低廉的检测大肠杆菌的新物质的出现，为大肠杆菌及大肠菌群检测提供了一个新手段。
本发明所述的试剂盒用于医院临床、药品检验、食品检验、环保及卫生防病等五个领域进行应用实验。医院系统有天津一中心检验学部、天津中医学院一附院检验科、天津胸科医院，用于检验从尿液、分泌物中分出的大肠杆菌及非大肠菌，2-4小时内均得到了100％的符合率。药品检验所用此试剂盒对染菌及非染菌样品进行检测符合率100％，省时44小时，节约了费用。食品检验所用此试剂盒检测初发酵样品，69支阳性管符合率为92.8％，操作简单，省时24-26小时。天津环境监测中心应用本发明所述的试剂盒检测地面水与环保常规法对照，结果完全一致，在8-10小时内便可确认，且操作简便。天津卫生防病中心用此盒检测生活饮用水及合成水样与国标GB 5750-85和国际标准IS 09308-2进行比较，三种方法所测结果一致，说明本试剂盒对定性滤膜法测定大肠菌群十分可靠，定性耗时1.5-2h，比传统法节约时间24小时，特异性强，技术指标达到了国际标准。
权利要求
1.一种用于快速检测大肠杆菌和菌群的试剂盒，包括以底物PNP-β-D-葡糖苷酸钠盐制成底物片，以胆盐乳糖增菌液制成培养基片，以磷酸盐配制0.2mol/L pH＝7.5缓冲液，将分别装有底物片、培养基片及缓冲液的3个瓶子装入一个盒内，组装成两片一水的试剂盒。
2.权利要求1所述快速检测大肠杆菌和大肠菌群的试剂盒，其特征在于制造方法a.底物、培养基均以纸片为载体，选用0.48mm厚滤纸，三种规格分别为直径6mm圆片，6.25mm×25mm条形，62.5mm×12.5mm条形；b.底物片的制备称取计算量的PNP-Glucu Na溶解，在无菌操作下浸吸备好的纸片，脱水后于40℃烘干，装入灭菌的棕色小瓶中，2-8℃避光密封保存。含底物分别约为100μg/片，1mg/片，5mg/片；c.培养基片的制备参考95年版药典培养基浓度半量计算，称取胆盐乳糖增菌溶液，高压灭菌，浸吸备好的纸片，脱水后60℃烘干，装入包装瓶内2-8℃密封保存。培养基约为4mg/片，20mg/片，200mg/片；d.缓冲液的配制按有关生化书籍，取一定量的磷酸二氢钾和磷酸氢二钠，制成0.2mol/L，pH＝7.5(PBS)缓冲液，高压灭菌后封口2-8℃保存。e.组盒将分别装有底物片、培养基片及缓冲液的3个瓶子装入一个盒内，就组成了试剂盒。
3.权利要求1所述的用于快速检测大肠杆菌和大肠菌群的试剂盒，其特征是检测方法为将试剂盒中的内容物缓冲液、底物片加入到被测的水样中，或各领域中经予处理的样品中，经37℃恒温箱孵育12-16小时，分解显现黄色为阳性，以无菌样作空白。
4.权利要求1所述的用于快速检测大肠杆菌和大肠菌群的试剂盒，其特征是底物PNP-β-D-葡糖苷酸钠盐的合成法如下a.四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖醛酸甲酯的制备取葡糖醛酸内酯87.5g(0.5mol)，加入1mol/L甲醇钠15ml和无水甲醇485ml混合物，搅拌2h。减压蒸去甲醇，得糖浆。加入醋酸酐330ml，冰浴下滴加吡啶110ml，滴加温度在20℃以下，放冷，过滤粗品，用95％乙醇洗涤，再用95％乙醇重结晶脱色，得针状结晶四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡糖醛酸甲酯63.8g，产率35％，mp178-179℃。b.三-O-乙酰基-α-D-溴代吡喃葡糖醛酸甲酯的制备取红磷9g，加90ml冰醋酸，冰浴搅拌下滴加54g(18ml)溴，维持20℃滴加，静止30min，过滤得橙黄色溴试剂，冰箱密封备用。取四-O-乙酰基-D-葡糖醛酸甲酯20g，加入溴试剂80ml，室温搅拌溶解，冰箱过夜，次日在15毫米汞柱下，减压浓缩残留物用80ml氯仿溶解，先用水洗，再用饱和的碳酸氢钠溶液洗，分离氯仿层，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸去氯仿，得糖浆。加少量无水甲醇溶解，放入冰箱冻室过夜，次日析出结晶三-O-乙酰基-α-D-溴代葡糖醛酸甲酯12.8g，产率62％，mp104-106℃(文献106-107℃)(冰箱密封保存)。c.对-硝基苯-三-O-乙酰基-β-D-葡糖苷酸甲酯的合成取三-O-乙酰基-α-D-溴代吡喃葡糖醛酸甲酯11.4g对-硝基苯8g，乙腈50ml，搅拌下缓缓加入新鲜的氧化银7.2g，搅拌2-3小时，过滤银盐，并用乙腈洗涤，合并滤液。减压蒸去乙腈，得糖浆，加无水乙醇，活性碳脱色，过滤，于冰箱内过夜，析晶，得闪亮结晶对-硝基苯-三-O-乙酰基-β-D-葡糖苷酸甲酯6g，产率46.3％，mp154-155℃(文献154℃)。d.对硝基苯-β-D-葡糖苷酸钠盐的制备取对-硝基苯-三-O-乙酰基-β-D-葡糖苷酸甲酯6g，加入0.2mol/L氢氧化钠20倍量(v/w)，4倍量95％乙醇，搅拌反应，不断补加氢氧化钠溶液，反应物溶解，共8小时，减压浓缩，得到对-硝基苯-β-D-葡糖苷酸钠盐固体。水-乙醇精制后得3.7g，收率81％，220℃(分解)(文献220℃分解)。分子式C2H12NO9Na·H2O，分子量355.2元素分析理论值C 40.50％，H 3.38％，N 3.94％实测值C 40.16％，H 3.68％，N 3.93％IRKBrmax(cm-1)3200，3368(-OH)，1618(-COOH)，1239(C-O)1537，1394(C-NO2)HNMR(200MC，TMS内标，P20溶剂)δ3.62(m，3H)，3.91(m，1H)，5.25(d，1H)，7.22(d，2H)，8.23(d，2H)
全文摘要
本发明是一种大肠杆菌和大肠菌群试剂盒及底物的合成方法。它是以底物PNP－β－D－葡糖苷酸钠制成底物片,以胆盐乳糖增菌液制成培养基片,以磷酸盐配制成0.2mol/L pH缓冲液。组成两片一水的试剂盒。为快速、准确、方便地检测提供了一个新的手段。
文档编号C12Q1/10GK1361288SQ0013677
公开日2002年7月31日 申请日期2000年12月29日 优先权日2000年12月29日
发明者孙家莉, 米沙, 王金良 申请人:天津市医药科学研究所, 天津市公安医院