专利名称：大肠菌群和大肠杆菌快速检测法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物检测方法，尤其是一种大肠菌群和大肠杆菌的快速检测方法。
大肠菌群(Total coliform简称TC)和埃希氏大肠杆菌(简记E.coli)是国际上公认的检验各种水质和食物流行病学上安全性的通用指标。其检验方法一般应用传统的多管发酵法(MTF)和滤膜过滤法(MF)。我国以MTF法定为标准检测方法。上述检测方法的不足之处是操作烦琐，耗时冗长。为达到确认和定量检测。至少需72小时，而且容易受到非大肠菌群以及杂菌的干扰。
本发明的目的在于提供一种能够简便、快速、灵敏地检测水和食物中大肠菌群和大肠杆菌的方法。
本发明提出的检测水和食物中TC和E.coli的方法，其基本原理是被检测样品液中加入特定的培养基和底物，如果存在细菌，细菌在培养基中繁殖，生成与细菌相应的酶，该酶能与相应底物反应，将底物中的有色物质或荧光物质释放出来。经直接观察和对照分析，即可定性或定量地检测出样品中的TC和E.coli。
本发明提出的检测方法如下按常规方法对被测样品进行预处理，加入培养基和底物，放入恒温箱反应，通常温度为37℃，时间16-24小时，就可观察分析有无有色物质或荧光物质释放出来。本发明中，培养基的组份配方如下(NH4)2SO420-25g；Na2HPO420-23g；KH2PO45-6g；NaCl 15-16g；乳糖 10-15g；精解蛋白胨 2-3g；脱氧胆酸钠 1-3g；十二烷基磺酸钠 2-3g；MgSO4.7H2O 2-5g；Na2SO30.5-1g；Mn(SO4)25-10mg；ZnSO45-10mg；CaCl20.5-1g。加入量为上述剂量的500-3000分之一。
对应于不同的检测对象，底物的组份配方有3种用于检测TC的底物4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷1-2g，加入量为该配制剂量的1000-2000分之一。
用于检测E.coli的底物4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷酸1-2g，加入量为该配制剂量的1000-2000分之一。
用于同时检测TC和E.coli的底物间-硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷0.1-0.3g，4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷酸0.07-0.12g，加入量为该配制剂量的100-200分之一。
为了方便检测使用，上述培养基和底物可预先制成吸附相应剂量的固体形状的试剂片。使用时，把培养物试剂片和相应底物的试剂片加入被测样品液即可。
上述作为试剂片的载体可用硅胶片，也可用滤纸条。其制备步骤如下将上述组份剂量的培养基溶于水中，将一定量的载体浸润于该溶液中，在真空下将水抽去并烘干即可。每条试剂片吸附有上述培养基剂量的500-3000分之一。底物试剂片制备步骤如下将上述三种组份的底物分别溶于75-100％乙醇中，真空下抽干即得每片含上述底物剂量的1500分之一的底物试剂片(即为G片)。
本发明提示的检测TC和E.coli的方法简便、快速、灵敏。只要将预先制备的培养基和底物试剂片按剂量加入水样中或经预处理的食物样品液中，放入37℃恒温箱反应，即可定性或定量地检测样品中的TC和E.coli，操作简便，时间只要16-24小时，而且，样品中只要有一个细菌，即可被检出。与MTF法等相比，操作程序大为简化，检测时间大为缩短。
本发明提出的检测方法，还可用于检验筛选致病型大肠杆菌E.coli 0157。
实施例先配置试剂片。称取培养基配方组份(NH4)2SO422g；Na2HPO420g；KH2PO45g；NaCl 15g；乳糖 12g；精解蛋白胨 2g；脱氧胆酸钠 2g；十二烷基磺酸钠 3g；MgSO4.7H2O 4g；Na2SO30.5g；Mn(SO4)28mg；ZnSO48mg；CaCl21g。溶于1升水中，试剂片基片采用6×1cm滤纸条。将2000条滤纸条浸润于上述溶液中，真空抽水，再烘干，即得每片含上述培养基剂量的2000分之一的培养基试剂片(记为L片)。称取4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷1.5g，溶于75％乙醇中，同样取1500条6×1cm滤纸条浸润于溶液中，真空抽水，再烘干，即得每片含上述底物剂量的1500分之一的底物试剂片(记为G片)。称取甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷酸1.5g，溶于100％乙醇中，取6×1cm滤纸条1500条，同样步骤制得该底物的试剂片(记为M片)。称取间-硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷0.2g，4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷酸0.1g，溶于0.1升100％乙醇中，取6×1cm滤纸条100条，同样步骤制得该底物试剂片。1、检测水中TC(或E.coli)在125 ml实验瓶中放入2条L片和2条G片(或M片)，加入100 ml检测水样，加入20 ml磷酸缓冲液(PH=7.4)，摇匀，盖好瓶子，放入37℃恒温箱中培养16-24小时，然后取出检样在暗处用365nm荧光灯照射，并观察。有荧光者为阳性，无荧光者为阴性。2、定量检测水中TC(或E.coli)用5个125 ml的试验瓶，各个瓶中各放入1条L片和1条G片(或M片)，各瓶中各加入10 ml磷酸缓冲液。再各加入60 ml水样，放入恒温箱培养24小时。取出在暗处用365nm荧光灯照射并观察。根据5个瓶中呈现的荧光数即可按表查得每升水中所含TC(或E.coli)的MPN。表TC或E.coli MPN(最可能数)检索表(5瓶×60 ml)呈现荧光的样品数1L水中TC或E.coli的MPN值0 ＜31 42 93 164 305 ＞2883、检测食品中TC或E.coli样品制备预处理对于液体食品，吸取25 ml样品放入有225 ml稀释剂的玻璃瓶内，摇匀，制成1∶100样品匀液。对于固体或半固体食品，取25g样品放入有225 ml稀释剂的玻璃瓶内，于8000r/min均匀1-2min，制成1∶10样品匀液。然后对样品匀液，用稀释剂配成一系列10倍递增的样品稀释液，如10-2、10-3、10-4，上述过程不得超过15min。TC(或E.coli)的MPN值的测定对每个样品，选择适宜的连续三个稀释度的(如10-1、10-2、10-3)样品稀释液，每个稀释度接种三管加有半条L片和半条G片(或M片)的磷酸缓冲液9ml，每管接种1ml。然后，将接种管放于37℃恒温箱内，培养16-24小时。取出试管在荧光灯下观察，根据呈现荧光的试管数，查阅相应的MPN表，即可得到每克(1毫升)样品中TC(或E.coli)的MPN值。
权利要求
1.一种检测大肠菌群的方法，在经预处理的被测样品中加入培养基和相应底物，放入恒温箱培养16-24小时，观察有无有色物质或荧光物质释放，测定大肠菌群，其特征在于(1)培养基的组份配方为(NH4)2SO420-25g；Na2HPO420-23g；KH2PO45-6g；NaCl 15-16g；乳糖 10-15g；精解蛋白胨 2-3g；脱氧胆酸钠 1-3g；十二烷基磺酸钠 2-3g；MgSO4.7H2O 2-5g；Na2SO30.5-1g；Mn(SO4)25-10mg；ZnSO45-10mg；CaCl20.5-1g加入量为上述剂量的500-3000分之一；(2)底物的组份配方为4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷1-2g，加入量为上述剂量的1000-2000分之一。
2.一种检测大肠杆菌的方法，在经预处理的被测样品中加入培养基和相应的底物，放入恒温箱培养16-24小时。观察有无有色物质或荧光物质释放，测定大肠菌群，其特征在于(1)培养基的组份配方和加入量同权利要求1；(2)底物的组份配方为4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷酸1-2g，加入量为该剂量的1000-2000分之一。
3.一种检测大肠菌群和大肠杆菌的方法，在经预处理的被测样品中加入培养基和相应的底物，放入恒温箱培养16-24小时。观察有无有色物质或荧光物质释放，测定大肠菌群和大肠杆菌，其特征在于(1)培养基的组份配方加入同权利要求1；(2)底物的组份配方为间-硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷0.1-0.3g，4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷酸0.07-0.12g，加入量为上述剂量的100-200分之一。
4.根据权利要求1或2或3所述的检测方法，其特征在于培养基和底物预先制成吸附有一定剂量的固体形状的试剂片，使用时加入相应数量的试剂片。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于所述的试剂片的载体为滤纸条。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于所说的培养基和底物的滤纸条试剂片制备步骤如下将培养基和底物按所说组份剂量分别溶于水中和75％-100％的乙醇中再将滤纸条若干浸润于溶液中，然后，真空抽干。
全文摘要
一种检测大肠菌群和大肠杆菌的方法。在被测样品中加入培养基和相应底物,放入恒温箱培养16—24小时,然后观察有无有色物质或荧光物质释放出来,从而定性或定量检测水或食物中大肠菌群和大肠杆菌。上述培养基和底物预先制成固体试剂片形式。本方法检测简便、快速、灵敏。并可用于检验筛选致病E.coli0157。
文档编号C12Q1/10GK1209456SQ9811103
公开日1999年3月3日 申请日期1998年8月31日 优先权日1998年8月31日
发明者陈楚良, 卢纯惠, 俞顺章 申请人:上海医科大学