快速检测结核杆菌的电化学生物芯片传感阵列及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物电化学和生物芯片传感技术领域，涉及一种结核分枝杆菌16SrDNA(核糖体DNA)的电化学生物芯片传感阵列及其制备方法，用于检测结核分枝杆菌。
【背景技术】
[0002]结核分支杆菌是引发肺结核的病原体，每年造成约200万人死亡，同时也是诱发呼吸道感染疾病的重要因素，给人类健康带来了巨大危害，全球结核患病人数以每年2%的速度快速增加，而我国结核病的发病人数居世界第二，感染率达到50%，是22个结核病高负担国家之一。结核在低人均收入国家的发病率较高，最重要的原因之一是缺乏准确、可靠、便捷与成本低的诊断方法和技术。现今已有很多种TB检测方法:(I)如结核分枝杆菌培养法，虽然具有很高的特异性和准确性，分离培养虽然准确度及敏感度均较高，但是最少需要几周的时间才能够得到结果；(2)结核分枝杆菌快速抗酸染色法敏感性较低，而且检出率在不同感染背景人群中波动较大。(3)免疫层析检测技术的特点是操作简单，检测速度较快；但是其检测标志物种类单一，灵敏度及特异性均较低。
[0003]随着结核分枝杆菌感染问题日益严重，对该菌的控制已成为世界性难题，建立快速、简便、准确、灵敏及准确的结核分枝杆菌检测方法是快速诊断的重要基础。电化学生物传感检测技术具有检测速度快、灵敏度高及可靠性强的优点，在结核致病菌检测新技术中备受:关注。
[0004]本发明从结核分枝杆菌16S rDNA分子水平检测入手，以四氧化三铁@ 二氧化硅(Fe304iSi02)复合纳米粒子和纳米Au结构材料为媒介体，设计新颖、功能化的纳米电化学芯片生物传感界面，同时以电化学生物芯片传感阵列为依托，利用纳米DNA生物分子探针体系，构建超顺磁性纳米检测微球，对结核分枝杆菌进行双重富集提取与纯化检测，构建一种用于结核分枝杆菌快速检测的电化学生物芯片传感阵列。
【发明内容】
[0005]本发明目的是提供一种可以灵敏、快速及定量检测临床标本中结核分枝杆菌16SrDNA的电化学生物芯片传感阵列及其制备方法，其具体制备步骤如下:
[0006]步骤一:电化学生物芯片传感阵列Fe3O4OS12磁性纳米复合粒子及纳米Au标记的DNA探针生物传感层的制备；
[0007]步骤二:电化学生物芯片传感阵列辣根过氧化物酶(HRP)、过氧化氢(H2O2)及纳米Au标记的DNA检测探针构成的级联检测信号放大体系的制备。
[0008]步骤一所述的电化学生物芯片传感阵列Fe3O4OS12磁性纳米复合粒子标记的DNA探针生物传感层的制备，其特征在于:
[0009](I)取Fe3O4磁流体，用无水乙醇清洗两遍，然后用超声波细胞破碎仪超声分散均匀，移入三颈烧瓶中，加入氨水，将值调节pH在室温下以均速搅拌；
[0010](2)向Fe3O4磁流体混合液中逐滴加入适量正娃酸乙酯(TEOS)反应一定时间，反应后再次用无水乙醇清洗两遍，再用超纯水清洗两遍，得到的褐色溶液，再用浓盐酸浸泡该磁流体一周时间，将未被包裹的Fe3O4磁球除去,然后用超纯水清洗即Fe3O4OS12磁性纳米复合粒子；
[0011](3)将电化学生物芯片在双蒸水中清洗两次，烘干；将液体池覆盖在电化学生物芯片表面后，一起放入电化学生物芯片反应池中；
[0012](4)分别对应电化学生物芯片的16个反应单元中加入Fe3O4OS12-性纳米复合粒子修饰的结核分枝杆菌检测DNA探针，然后将含有电化学生物芯片的反应池放入到充满氮气的电化学生物芯片孵育盒中孵育后，取出用无水乙醇轻轻清洗，并在氮气中烘干；
[0013](5)分别对应电化学生物芯片的16个反应单元中加入结核分枝杆菌标本预处理混合液后放入电化学生物芯片孵育盒中。
[0014]步骤二所述的化学生物芯片传感器阵列辣根过氧化物酶(HRP)、过氧化氢(H2O2)、四甲基联苯安(TMB)及纳米Au标记的结核分枝杆菌DNA检测探针构成的级联检测信号放大体系的制备，其特征在于:
[0015](I)分别对应电化学生物芯片的16个反应单元中加入纳米Au标记的结核分枝杆菌DNA检测探针，孵育后取出用PBS轻轻冲洗；
[0016](2)分别对应电化学生物芯片的16个反应单元中加入辣根过氧化物酶(HRP)、过氧化氢(H2O2)、四甲基联苯安(TMB)，通过显色反应肉眼观测显色结果。
[0017]步骤三:通过差分脉冲电流图和电流时间曲线图统计数据，根据所检测不同浓度的结核分枝杆菌绘制标准曲线。
[0018]本发明检测结核分枝杆菌的原理:
[0019]将含有结核分枝杆菌的临床标本直接加入到磁性反应微孔，分别通过Fe304@Si02磁性纳米复合粒子标记的捕获探针和纳米Au标记检测探针，可对结核分枝杆菌16S rDNA特异性序列起“双重富集”和生物稳定性作用，利用纳米检测微球超顺磁性将有望获得很高的结核分枝杆菌靶分子分离效率和检测灵敏度；同时通过电化学生物芯片传感阵列特性将有望实现靶分子“on-chip”分离，不需要额外的分离步骤，大大简化操作流程，缩短检测时间。
[0020]通过辣根过氧化物酶(HRP)、过氧化氢(H2O2)和纳米Au构成的双重级联检测信号放大体系，以四甲基联苯胺(TMB)为反应基质，使结核分枝杆菌靶核酸分子检测结果可视化，同时通过电化学生物芯片将结核分枝杆菌杆菌16S rDNA靶序列杂交信息转化为可读电信号输出，该信号与待检液中的结核分枝杆菌16S rDNA靶序列浓度成正比，通过绘制标准曲线，可以对未知临床标本中的结核分枝杆菌进行检测与定量分析，结果可进行目视和机检结果双重判定。
[0021]本发明所建立的快速检测结核分枝杆菌的的电化学生物芯片传感阵列及其制备方法，其体现的特点是:
[0022](I)从核酸分子检测结核分枝杆菌无需细菌培养，可以避免因长时间细菌培养所造成的检测速度缓慢；
[0023](2)采用HRP-TMB-H2O2生物学信号放大体系，稳定性好灵敏度高，无需PCR对靶核酸分子的扩增，可进行目视结果判定，为现场大批量结核样品筛查提供了可能，且检测成本较低；
[0024](3)结核分枝杆菌