一种硫酸化肝素寡糖及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于抗肿瘤药物领域，涉及一种硫酸化肝素寡糖及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是人类健康的重大威胁，更严重的是，肝癌、肺癌等恶性肿瘤易发生转移，目 前尚无抑制肿瘤转移的药物，导致肿瘤转移治疗困难，使肿瘤转移成为肿瘤患者死亡的最 重要原因。肿瘤细胞要实现侵袭和迀移，有两个过程非常关键：一是突破由细胞外基质 (extracellular matrix，ECM)和基膜(basement membrane，BM)构成的屏障，二是形成新生 血管。ECM和BM是肿瘤细胞侵袭及转移的屏障，恶性肿瘤细胞要实现扩散和转移，必须穿过 ECM及BM进入循环。在这个过程中ECM各种成分和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans，HSPGs)的降解必不可少。乙酰肝素酶(heparanase，ΗΡΑ)是目前发现的哺乳 动物体内唯一能切割硫酸乙酰肝素 (heparan sulfate ,HS)的内切-β-D-葡萄糖醛酸酶。HPA 识别HS的特异结构，不完全切割HS侧链，只在某些位点切割HS侧链的糖苷键，将其降解为 10-15个糖单位大小的短糖链。另外，HS侧链可以结合很多生物活性分子如生长因子、细胞 因子、趋化因子、成形素和凝血蛋白等。HPA通过降解HS释放活性生长因子，这些生长因子能 促进肿瘤血管生成、肿瘤生长、侵袭和转移。因此，HPA对肿瘤细胞的侵袭和转移具有重要作 用，而HPA抑制剂的研究和筛选已成为人类寻找癌症治疗潜在药物的新方向。
[0003] 长期以来的临床证据显示肝素具有抗肿瘤功能，且近年来低分子肝素辅助抗肿瘤 正在开展临床试验。经过长期的研究，肝素的抗肿瘤作用在业界已得到普遍的认识和认可， 肝素的抗肿瘤可能主要是通过抑制肿瘤转移进行体现，更进一步体现为抑制体内乙酰肝素 酶的活性。
[0004] 肝素作为传统抗凝血药，其抗凝血活性是主要用途，但其结构的多样性导致其具 有多种生物活性。在肝素的非抗凝应用中，其抗凝血活性是常见的和中药的副作用。因此， 肝素的抗凝活性是其抗肿瘤转移方面应用的一个重大不利因素，容易引起出血等副作用。 肝素的非抗凝活性应用中一个重要的研究方面就是在保留肝素基本结构的基础上，破坏其 抗凝血活性。在抗肿瘤转移方面，肝素的乙酰肝素酶抑制活性较高高，但细胞层次上对肿瘤 生长抑制、肿瘤细胞侵袭和粘附的抑制活性都不显著，在抗肿瘤转移小鼠实验中结果较差， 不能显著的抑制肿瘤转移的发生。其中主要的原因可能是肝素的特异性不高，可以和多种 内源性物质发生作用，降低了与乙酰肝素酶结合的能力。
[0005] CN101824100A公开了具有如下结构式的肝素寡糖十二聚体：
[0006]
该 肝素寡糖时十二聚体具有抗血管平滑肌细胞增殖的用途。但是该发明的寡糖并不具有显著 的抑制肿瘤细胞粘附和迀移的能力。
[0007] CN 104764847A公开了含N-乙酰化结构肝素寡糖的制备方法，在该对比文件中公 开了以下4种六糖和3种八糖片段：
[0015] 该发明仅是解决了含N-乙酰化结构肝素寡糖难制备以及结构测定问题，在抑制体 内乙酰肝素酶的活性方面并无显著改善。
[0016] 因此，在本领域中，期望能够得到一种具有抑制体内乙酰肝素酶活性，并能降低其 抗凝血活性的肝素寡糖。
【发明内容】
[0017] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种硫酸化肝素寡糖及其制备方法 和应用。
[0018] 为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
[0019] 第一方面，本发明提供一种硫酸化肝素寡糖，所述硫酸化肝素寡糖分子的非还原 端含有由肝素酶酶解产生的不饱和双键，含有糖醛酸衍生物和糖胺衍生物，其具有式I所示 结构：
[0021 ]其中，R1、R2、R3、R4、R5、R 6、R7、R8、R9、Ra、Rb、Rc和Rd独立地为S0 3-或H; R/、R/ 和R/ 独 立地为COCH3或S03-，η为1 -3。
[0022]在本发明中η为1-3,即为1、2或3,当η = 1时，所述硫酸化肝素寡糖为硫酸肝素六 糖，当η = 2时，所述硫酸化肝素寡糖为硫酸肝素八糖，当η = 3时，所述硫酸化肝素寡糖为硫 酸肝素十糖。
[0023]在本发明硫酸化肝素寡糖的结构中有双键，所以该硫酸化肝素寡糖在紫外区 232nm附近有较强的吸收峰，可以非常方便的用于肝素寡糖的定性和定量检测。
[0024]本发明的硫酸肝素寡糖具有良好的乙酰肝素酶抑制活性和抑制肿瘤转移活性，其 糖链较短，分子量小，完全没有抗凝血活性，同时硫酸化肝素寡糖具有较高的特异性，能特 异性的抑制乙酰肝素酶，抑制肿瘤转移。
[0025]在本发明所述的硫酸化肝素寡糖中，式I中平均每个双糖单元中磺酸基个数不少 于2个，例如平均每个双糖单元中磺酸基个数可以为2个、3个、4个或5个，平均每个双糖单元 中乙酰基不多于0.5个，例如可以是0.5个或0.4个，平均每个双糖单元的葡萄糖胺6-位和3-位磺酸基都不少于0.5个，例如可以是0.5个、0.8个、1个、1.5个或2个。
[0026]所述每个双糖单元中基团（例如磺酸基、乙酰基或葡萄糖胺6-位和3-位磺酸基）的 个数是指以整个肝素寡糖中磺酸基的个数平均到每个双糖单元所得到的个数，例如如果硫 酸化肝素八糖中有共有2个乙酰基，则平均到每个双糖单元中乙酰基的数量为0.5个。
[0027]优选地，式I中糖醛酸为葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸。
[0028]优选地，与式I中所含羧基和/或磺酸基成盐的阳离子选自Na+、K+或Ca2+。
[0029] 上述结构式中，葡萄糖醛酸中的羧基或者磺酸基都带有负电荷，因此一般要与一 些阳离子成盐，通常是Na+、K+和Ca 2+。
[0030] 优选地，所述硫酸化肝素寡糖为具有以下结构的化合物中的任意一种或至少两种 的组合：
[0031] DP6肝素六糖衍生物：
[0038] DP8肝素八糖衍生物：
[0045] DPlO肝素十糖衍生物：
[0052]以上结构中，
I表示α-L-艾杜糖醛酸，G代表β-D-葡萄糖 醛酸，A代表α-D-葡萄糖胺。NS表示氨基上的磺酸基，2S、3S、6S等表示糖环的2-0,3-0和6-0 位置的磺酸基。
[0053] 第二方面，本发明提供了如第一方面所述的硫酸化肝素寡糖的制备方法，所述方 法包括以下步骤：
[0054] (1)利用肝素酶降解肝素，分离、纯化得到肝素寡糖；
[0055] (2)利用硫酸化试剂对步骤(1)得到的肝素寡糖进行硫酸化，得到所述硫酸化肝素 寡糖。
[0056] 在本发明所述硫酸化肝素寡糖的制备方法中，步骤(1)所述肝素酶为肝素酶I。
[0057] 在本发明所述硫酸化肝素寡糖的制备方法中，步骤（1)所述利用肝素酶降解肝素 时需加入缓冲液，优选为pH 7.0的Tris-HCl缓冲液。
[0058]优选地，步骤（1)所述肝素酶的加酶量为15~25IU/g肝素，例如16IU/g肝素、 16.5IU/g 肝素、17IU/g 肝素、17.5IU/g 肝素、18IU/g 肝素、18.5IU/g 肝素、19IU/g 肝素、 19.5IU/g 肝素、20IU/g 肝素、21.5IU/g 肝素、22IU/g 肝素、23IU/g 肝素或 24IU/g 肝素，优选 18 ~23IU/g肝素。
[0059] 优选地，步骤(1)所述利用肝素酶降解肝素的温度为4~37°C，例如5°C、8°C、10°C、 12°C、15°C、18°C、20°C、22°C、25°C、28°C、30°C、32°C、35°C 或 37°C，优选为 8 ~25°C。
[0060] 优选地，步骤（I)所述降解的时间为8~24小时，例如9小时、10小时、11小时、12小 时、13小时、