可以看出：寡糖分子量分布 峰尖而对称，说明寡糖分子量分布范围较窄，同时分子量分布从十二糖到四糖逐渐降低，说 明寡糖质量符合要求。
[0095] 肝素寡糖的结构利用UPLC-MS等方式进行了表征确认，例如，图3为本发明得到的 肝素十糖的UPLC-MS的总离子流质谱图，图4为肝素十糖的总离子流图中对应峰的归属图， 其中，AUx，y,z(图中已经给出了具体的x、y、z的值）中X代表寡糖链中糖单元数，y代表寡糖 链中总的磺酸基数目，z表示寡糖链中总的乙酰基数目；LR代表结合区域。由图4结构归属可 以看出，其中肝素十糖中绝大多数寡糖都是肝素十糖，仅有少部分是高度硫酸化的肝素八 糖。以上表征结果说明寡糖制备是成功的，纯度满足要求。
[0096]实施例2 20%~80%硫酸化的肝素八糖的制备
[0097]称取0.54g肝素八糖原料，转移至反应瓶中，加入25mL无水DMF，搅拌溶解。称取 0.86g (CH3) 3N · SO3，在搅拌下逐渐加入上述溶液中，搅拌IOmin。塞好瓶盖，将反应瓶置于80 °(3油浴中搅拌反应4h。停止反应后，自然冷却至室温。将固体以90mL纯水溶解，用2M NaOH调 节pH至接近中性。将溶液转移至截留分子量为100~500Da的透析袋中，透析三天后，以 BaCl2检验透析液中是否存在大量硫酸根。若没有，则先以2M NaOH调节pH至中性，在旋转蒸 发仪上浓缩至IOmL左右。上P2柱，以纯水洗脱，以部分收集器收集洗脱液。测定232nm吸光 度，确定肝素八糖衍生物的位置，以BaCl2检验收集液是否存在大量硫酸根，收集无盐部分 的肝素八糖硫酸化衍生物。浓缩至IOmL左右，上Dowex阳离子交换柱，纯水洗脱，以部分收集 器收集洗脱液测定232nm吸光度，确定肝素八糖衍生物的位置，收集含肝素八糖衍生物组 分，小心的用0.1 M的高纯NaOH溶液调节pH至7.0后，浓缩冻干即可得到20%硫酸化的肝素八 糖。
[0098]相对于0.54g肝素八糖原料，通过如表1中所示调节反应原料中（CH3)3N · SO3的投 料量以及反应温度和反应时间可以控制得到所述硫酸化程度的肝素寡糖。
[0099]表 1
[0101] 例如可以通过以下反应条件以及投料量的调整获得相应硫酸化程度的肝素寡糖：
[0102] 将(CH3)3N · SO3的量调整为1.67g，反应温度调整为90°C，反应时间调整为4h，其余 操作均相同，可制得40%硫酸化的肝素八糖。
[0103] 将(CH3)3N · SO3的量调整为3.34g，反应温度调整为90°C，反应时间调整为6h，其余 操作均相同，可制得60%硫酸化的肝素八糖。
[0104] 将(CH3)3N · SO3的量调整为5.01g，反应温度调整为100°C，反应时间调整为8h，其 余操作均相同，可制得80%硫酸化的肝素八糖。
[0105] 图5为肝素八糖(A)与40%硫酸化的肝素八糖(B)的HSQ C谱及对应的一维氢谱图 (δΗ ppm 6.1~3·165/δ[ ppm 112~52.6)，由图可以看出，硫酸化反应后，肝素八糖的信号 峰发生了显著变化，出现了很多的新信号，说明出现了天然肝素不存在的结构，与硫酸化衍 生的预期是一致的。
[0106] 实施例3 40%和60%硫酸化的肝素八糖的乙酰肝素酶抑制活性
[0107] 米用文南犬[Hammond E,Li CP,Ferro V.Development of a colorimetric assay for heparanase activity suitable for kinetic analysis and inhibitor screening.Anal .Biochem. 2011; 396:112-116]中所述方法，测定硫酸化肝素寡糖的乙酰肝 素酶抑制活性，即具体实验操作如下：
[0108] 实验组的反应液由40mM的乙酸钠缓冲液(pH 5.0)和IOOmM的磺达肝癸钠，以及特 定浓度的硫酸化肝素八糖组成，对照组的反应液中以与硫酸化肝素八糖同样浓度的 SST0001对照品替代硫酸化肝素八糖。向96孔板中各孔加入IOOyL实验组或对照组的反应 液，然后分别加入乙酰肝素酶开始反应，乙酰肝素酶的终浓度为140pM。将96孔板用胶带密 封后在37°C下孵育2-24h，完成反应后，加入IOOyL含有1.69mM WST-I的0.1 M NaOH溶液终止 反应。将96孔板再次密封后于60°C孵育60min。冷却至室温后，测定584nm吸光度值。按照如 下方法计算药物的抑制率：
[0109] 抑制率=(1-样品吸光度值/对照组吸光度值）X 100%
[0110] 根据以上方法，测得硫酸化肝素寡糖的对乙酰肝素酶的抑制活性如图6所示，由图 可见，40%硫酸化的肝素八糖(!16。8-40%)对乙酰肝素酶的半抑制浓度（1050)为431^/1111^， 60%硫酸化的肝素八糖(Hep8-60%)对乙酰肝素酶的半抑制浓度（IC50)为57ng/mL。
[0111] 实施例4 20%和60%硫酸化的肝素八糖的细胞粘附测定
[0112] 在本实施例中，应用以下方法测定20%和60%硫酸化的肝素八糖的细胞粘附性：
[0113] (1)包被基底膜：用灭菌二蒸水分别配制2种溶液：10g/L BSA(1%)，50mg/L Matrigel，1:8稀释液;Matrigel以50yL/孔分别加入96孔培养板，4°C过夜；
[0114] (2)水化基底膜:吸出培养板中残余液体，每孔加入50yL含10g/L BSA的无血清培 养液，37°C，30min;
[0115] (3)细胞的准备：取正常培养的HeLa细胞，PBS清洗三次后，将细胞分对照组（不添 加药物，仅添加相应体积的PBS)和实验组(添加肝素和硫酸化肝素八糖，浓度均为62.5yg/ 11^)，培养2411。
[0116] (4)接种细胞：取正常培养或步骤（3)中肝素/HS寡糖的衍生物处理24h的肿瘤细 胞，PBS清洗三次后加入0.5mL胰酶消化。严密关注消化情况，消化完成后，加5mL培养基充分 吹打，使细胞分散成单细胞悬液。计数，根据计数结果调整细胞悬液浓度，使细胞密度为IO5 个细胞/mL，每孔IOOyL细胞悬液接种于包被Matrigel的96孔培养板中，每组平行3个样本； [0117] (5)培养细胞:37°C二氧化碳培养箱培养Ih，弃去各孔培养液，用PBS冲洗1次，之后 每孔加入200yL新鲜培养基，观察并照相；
[0118] (6)检测:每孔加入10yLCCK-8染料溶液，37°C二氧化碳培养箱培养3h后，多功能酶 标仪读数，以肝素对照组为参照，按下述公式计算抑制率。
[0119] 抑制率=(1_处理组吸光值/对照组吸光）X 100%
[0120] 根据以上方法，测得肝素(Heparin)对HeLa细胞粘附的抑制率为8.3%，20%硫酸 化的肝素八糖（Hep8-20% )对HeLa细胞粘附的抑制率为45.3%，60%硫酸化的肝素八糖 (Hep8-60 % )对HeLa细胞粘附的抑制率为37 · 9 %。
[0121] 实施例5 40%和60%硫酸化的肝素八糖的细胞迀移测定
[0122] 在本实施例中，通过以下方法测定40%和60%硫酸化的肝素八糖的细胞迀移：
[0123] (1)实验前将Transwell小室放置于24孔板中，下室加入600ul的DMEM液体培养基， 上室加入IOOul的DMEM液体培养基，培养箱过夜待用；
[0124] (2)细胞的准备:取对数生长期的HeLa细胞，胰酶消化，计数细胞浓度，将细胞分对 照组(不添加肝素或肝素寡糖，仅添加相应体积的PBS)和实验组(添加肝素和硫酸化肝素八 糖，浓度均为62.5yg/mL)。分别用无血清、含2.5%BSA的DMEM培养基和无血清、含相应肝素 寡糖的2.5%BSA DMEM培养基稀释细胞，调整细胞浓