专利名称：硫酸化丝素蛋白的制备方法及其在抗凝血药物上的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于有机化学领域，主要涉及一种硫酸化丝素蛋白的制备方法及其在抗凝血药物上的应用，即涉及一种硫酸化丝素蛋白为抗凝血、抗血栓剂在制备抗凝血药物与抗凝血材料上的应用。
背景技术：
现有的抗凝血药物是从动物的脏器中提取获得的肝素，已有60余年的历史，由于其在使用过程中易引起出血的副作用，从某种程度上限制了肝素的使用。
丝素是从蚕茧中提取的一种丝素蛋白，丝素蛋白作为一种天然动物蛋白具有优良的生物相容性，而且原材料广泛易得、在湿态下力学性能良好、体内容易降解、降解产物无毒，现已在人工皮肤、人造血管等多种人造器官和抗凝血物质、细胞培养基等生物材料领域有了极广泛的应用。
国内对丝素在抗凝血药物的研究中，目前还没有以蚕茧壳提取丝素为原料合成抗凝血药物的报导，这主要是制备硫酸化丝素蛋白的方法和工艺的特殊性存在着困扰。国内仅见苏州大学张雨青从家蚕丝腺体内获得的内容物抽提后得到丝素和丝胶，在丝蛋白溶液中加入硫酸处理制得硫酸化丝素或丝胶粉方法的一篇报导，题目是硫酸化丝蛋白的抗凝血活性和抗艾滋病活性[J]丝绸，2003，(5)；53。国外有关用丝素制备硫酸化丝素蛋白抗凝血药物的研究，周耀祖摘译《蚕丝之光》Vol 50，1997(4)24～29蚕からの抗血液凝固物质の开发/玉田靖，题目是蚕丝在医药领域的开发利用-抗凝血物质的研制[J].蚕桑通报，1998、29(3)62～63。
硫酸化丝素蛋白除了在抗凝血药物的应用外还有抗艾滋病作用，由日本农业生物资源研究所的昆虫新素材开发研究室玉田靖等对张雨青制备的硫酸化丝素蛋白血液抗凝剂进行了抗艾滋病病毒活性评估试验，发现它具有阻止病毒与免疫细胞表面蛋白质相结合的功能。研究结果表明，13.2mg/L硫酸化丝素就能抑制HIV感染的T细胞损伤；另一方面，加入高浓度的硫酸化丝素蛋白，并没有观察到对非感染的T细胞即正常T细胞有任何损伤；且用丝素制成的硫酸化丝素蛋白具有成本低、安全性高的特点，是一种很有开发前途的抗艾滋病药剂。此外，在抗凝血生物材料上的应用以丝素为材料制造心脏瓣膜、人工血管和其他接触血液的医用材料方面都迫切需要解决材料的抗凝血向题。抗凝血材料的研究被认为是生物材料研究关键向题。为了扩展丝素在生物材料领域的应用，必须对丝素蛋白进行改性以提高材料的抗凝血性能。现有的改善丝素抗凝血性的方法主要有丝素枝接褐藻多糖硫酸酯、川芎嗪衍生物和使用共混肝素以及丝素膜表面等离子体改性的方法来提高丝素的抗凝血性，这些方法制备的抗凝血材料要经过较复杂的工序，且受到抗凝血性能稳定性的限制。本发明提供的硫酸化丝素蛋白在制备丝素抗凝血材料的工序上较为简便，且抗凝血性能会更稳定。
发明内容
本发明的目的在于针对国内现有技术存在的问题，利用资源丰富，成本低廉，采用简单的工艺，提供硫酸化丝素蛋白的制备方法。
本发明的目的还包括提供该硫酸化丝素蛋白在制备抗凝血、抗血栓药物上的应用。
为实现上述目的，本发明硫酸化丝素蛋白的制备方法，主要包括如下步骤(1)将蚕茧壳或废蚕丝用浓度为0.3～0.5％脱胶剂进行脱胶处理，得到丝素，其中蚕茧壳或废蚕丝与脱胶剂的体积/质量(V/W)比为50-100∶1；(2)丝素经过酸处理得到丝素微晶纤维；(3)用硫酸酯化试剂对丝素微晶纤维或丝素进行硫酸化反应；(4)调节产物PH至8～8.5，经过透析和冷冻干燥得硫酸化丝素蛋白。
所述的丝素从蚕茧壳或废蚕丝中提取，用50～100倍的体积质量浓度为0.3～0.5％的Na2CO3溶液或NaHCO3中的一种，在温度98～99℃加热30min，精练两次。精练后用蒸馏水充分洗涤，然后用0.05％醋酸浸泡5min，自然干燥或烘箱干燥，即得丝素。
第(2)步取丝素用盐酸或硫酸中的一种，其体积浓度为20～60％，与丝素的体积/质量(V/W)比为10～20∶1，温度0～30℃，水解2～5h，制备获得丝素微晶纤维；丝素微晶纤维或丝素是在密闭状态下浸润于惰性溶剂中，浸润时间为20～60min。，所述的酯化试剂是氯磺酸与惰性溶剂组成，惰性溶剂是指二氯甲烷、二氯乙烷、氯仿、二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的其中一种，与氯磺酸摩尔比为1∶0.5～1.5。其制备方法在0～5℃冰盐浴中加入惰性溶剂，在氮气或干燥剂或氮气和干燥剂保护下向惰性溶剂中缓慢滴入氯磺酸，滴入速度为0.5～1ml/min。
第(3)步所述的硫酸化反应的温度调节15℃以下，硫酸酯化试剂与丝素微晶纤维或丝素的体积/质量(V/W)比为10～30∶1。为了充分完成反应，硫酸化反应过程施加机械搅拌或磁力搅拌下，硫酸酯化试剂对惰性溶剂浸润或不浸润的丝素微晶纤维或丝素进行硫酸化反应，反应时间15～90min。
第(4)步将产物中和沉淀，所用试剂是一价盐氯化钠或醋酸钠的一种与乙醇溶液共为沉淀剂，浓度为2～5％(w/v)，用量为反应体积的4-5倍洗涤沉淀，并用2～3mol/L的氢氧化钠调节产物PH至8～8.5，最后将产物置蒸馏水中透析24～48h，并将透析液冷冻干燥。
本发明根据丝素的氨基酸排列以-(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser)-重叠结构的特征，其中Ser之间的距离与肝磷脂中的抗血凝结构即硫酸基间的距离十分相近。如果在丝素中的Ser上引入硫酸基进行改性处理，就有可能增加抗凝血性能，通过对丝素进行硫酸化，制备了带有硫酸基的丝素蛋白。经UV-2100型200～330nm波长范围进行硫酸化丝素蛋白、人白蛋白、丝素酸水解液与肝素的紫外吸收峰比较，图1显示硫酸化丝素蛋白与人白蛋白的紫外吸收峰相似，二者与未经硫酸化处理的丝素酸水解液均有二个紫外吸收峰，一个在220nm附近有肽键吸收峰，另一个在280nm附近的氨基酸生色基团吸收峰，即肽键和氨基酸的吸光度。进一步在UV-VIS 8500型180～300nm波长范围检测，图2显示硫酸化丝素蛋白与带硫酸基负电荷的肝素钠紫外吸收峰几乎重叠，波长分别为196、195nm；同时将未经硫酸化处理的丝素酸水解透析液进行稀释、测定280nm波长的吸光度与硫酸化丝素蛋白相同的条件下比较显示，丝素酸水解液也有一定量的紫外吸收峰，其波长为194nm。硫酸化丝素蛋白是一种蛋白肽，带有硫酸根负电荷，与凝血酶的正电部分结合，阻止凝血酶水解纤维蛋白原转变为纤维蛋白而产生抗凝作用。
本发明与现有技术相比，具有以下技术特点和优点1本发明为国内首次提出从蚕茧壳或废蚕丝中提取丝素作为原料，与国内文献不同，国内采用从家蚕丝腺体内获取的内容物抽提后得到丝素和丝胶为原料。
2本发明所采用的硫酸酯化试剂和制备方法与国内文献不同，国内采用硫酸为酯化试剂；本发明采用氯磺酸与惰性溶剂(二氯甲烷或二氯乙烷)作为丝素的硫酸酯化试剂，制备的硫酸化丝素蛋白的抗凝血活性更强。
3本发明的产物与抗凝血药物肝素钠不同，肝素钠从猪小肠抽提，价格高昂；硫酸化丝素蛋白为有机合成药物，原料成本低，资源丰富，操作简单，条件可控。
4本发明的产物抗凝血机理有别于肝素，肝素抗凝血酶活性表达主要通过与抗凝血酶III(AT-III)结合而实现。硫酸化丝素蛋白的抗凝成分与水蛭肽相似，可抑制凝血酶水解纤维蛋白原转变为纤维蛋白的作用，其抗凝血酶活性不依赖于AT-III的性质；对结合血凝块的凝血酶有抑制作用，从而表现出优于肝素的特性，若作进一步分离纯化，则可能发展成为一类新型抗凝血、抗血栓药物，为肝素治疗无效的血栓患者开辟新的治疗方法。
5可利用硫酸化丝素蛋白作为抗凝血、抗血栓和抗艾滋病药物与医药原料，如制造心脏瓣膜、人工血管和其他接触血液的抗凝血性医用材料等，此外，还可在制备消退疤痕、生发护发、养肤美容等药物中的应用。
图1是硫酸化丝素蛋白、人白蛋白、酸水解丝素与肝素紫外光谱(200～330nm波长)比较图(按曲线顺序排列)图2是图1硫酸化丝素蛋白、肝素与酸水解丝素紫外光谱(180～300nm波长)比较图(分别③、②、①)图3是硫酸化丝素蛋白与丝素微晶纤维红外光谱重叠图(未标吸收峰波数)图4是图3硫酸化丝素蛋白与丝素微晶纤维的红外光谱比对图(标有吸收峰波数)具体实施方式
下面结合实施例，对本发明技术作进一步详述。
1丝素的制备蚕茧壳或废蚕丝用50～100倍的体积质量浓度为0.3～0.5％的Na2CO3溶液，在温度98～99℃加热30min，精练两次。精练后用蒸馏水充分洗涤，然后用0.05％醋酸浸泡5min，自然干燥或烘箱干燥，即得丝素，用氯化钡-明胶测定硫酸基含量(4.3％)。
2丝素微晶纤维的制备取丝素10g加入硫酸体积浓度为30～60％溶液中溶解，硫酸溶液与丝素的体积/质量(V/W)比为10～20∶1，温度20～30℃，在搅拌下水解2～5h，然后将水解液缓慢倒入80～100ml蒸馏水中，抽滤、水洗至中性，干燥即得丝素微晶纤维。
上述获得的丝素微晶纤维，经KBr压片后，采用红外光谱仪Nicolet 360AVATAR FT-IR测定在波数4000～400cm-1吸收光谱，图4中的(图4-2)显示，丝素微晶纤维红外光谱，在3291cm-1谱带区域产生N-H和O-H伸缩振动特征吸收峰；1631cm-1、1519cm-1处的吸收峰分别归属于丝素无规线团构象的酰胺I和酰胺II；1233cm-1、1100cm-1处的吸收，推测是丝素微晶纤维中含有硫酸基的吸收峰。
3硫酸化丝素蛋白的制备实施例1硫酸化丝素蛋白的制备先将1g干燥的丝素微晶纤维置玻璃容器中，加入少量二氯甲烷密闭浸润30～60min；再在冰浴和搅拌条件下，三颈瓶中加入二氯甲烷，在氮气和/或干燥剂保护下向二氯甲烷中缓慢滴入氯磺酸，滴入速度为0.5～1ml/min.，并调节反应温度15℃以下，然后加入上述浸润的丝素微晶纤维，使二氯甲烷与氯磺酸摩尔比为1∶0.5～1.5，硫酸酯化试剂与丝素微晶纤维的体积/质量(V/W)比为10～30∶1，反应时间15～60min。反应结束，将反应液倒入4-5倍体积的(2～5％w/v)的醋酸钠-乙醇溶液，抽滤、然后用乙醇和无水乙醇洗涤沉淀，滤饼用少量蒸馏水溶解，并用2～3mol/L的氢氧化钠调节产物PH至8.0～8.5，最后将产物置蒸馏水中透析24～48h，并将透析液冷冻干燥。
实施例2硫酸化丝素蛋白的制备先将1g干燥的丝素置玻璃容器中，加入少量二氯甲烷密闭浸润30～60min；再在冰浴和搅拌条件下，三颈瓶中加入二氯甲烷，在氮气和/或干燥剂保护下向二氯甲烷中缓慢滴入氯磺酸，滴入速度为0.5～1ml/min.，并调节反应温度15℃以下，然后加入上述浸润的丝素，使二氯甲烷与氯磺酸摩尔比为1∶0.5～1.5，硫酸酯化试剂与丝素的体积/质量(V/W)为10～30∶1，反应时间15～60min，反应结束，将反应液倒入4-5倍体积的(2～5％w/v)的醋酸钠-乙醇溶液，抽滤、然后用乙醇和无水乙醇洗涤沉淀，滤饼用少量蒸馏水溶解，并用2～3mol/L的氢氧化钠调节产物PH至8.0～8.5，最后将产物置蒸馏水中透析24～48h，并将透析液冷冻干燥。
实施例3硫酸化丝素蛋白的制备在冰浴和搅拌条件下，三颈瓶中加入二氯甲烷，在氮气和/或干燥剂保护下向二氯甲烷中缓慢滴入氯磺酸，滴入速度为0.5～1ml/min.，二氯甲烷与氯磺酸摩尔比为1∶0.5～1.5。调节反应温度15℃以下，加入1g干燥的丝素，硫酸酯化试剂与丝素的体积/质量(V/W)比为10～30∶1，反应时间15～60min。反应结束，将反应液倒入4-5倍体积的(2～5％w/v)的醋酸钠-乙醇溶液，抽滤、然后用乙醇和无水乙醇洗涤沉淀，滤饼用少量蒸馏水溶解，并用2～3mol/L的氢氧化钠调节产物PH至8～8.5，最后将产物置蒸馏水中透析24～48h，并将透析液冷冻干燥。
上述获得的硫酸化丝素蛋白，冷冻干燥后呈白色片状物，得率为60～66％；以人血清白蛋白为标准品，采用Lowry法测定蛋白质含量为99％以上；用氯化钡-明胶测定硫酸基含量为13-20％；产物经U V光谱分析图2显示，硫酸化丝素蛋白的紫外光谱在196nm处的吸收峰与含硫酸基团的肝素在195nm处的吸收峰几乎重叠；结合红外光谱分析图3与图4中的图4-1显示，硫酸化丝素蛋白除了丝素微晶纤维(图4-2)母体特征光谱带得以保留外，还增强、增宽了1231cm-1的吸收、增加了1010cm-1的吸收。参考(方波报导)肝素的红外光谱在1240cm-1处有-OSO3--基团的S＝＝O键伸缩振动，说明丝素微晶纤维经酯化后引起了丝素蛋白在红外光谱1231cm-1和1010cm-1处特征峰的变动。上述紫外、红外光谱表明该产物已形成硫酸酯。
硫酸化丝素蛋白的抗凝血药效试验1硫酸化丝素蛋白在血浆中不同质量浓度对凝血时间的影响硫酸化丝素蛋白的部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)与硫酸化丝素蛋白的浓度之间的关系(n＝3)当样品的浓度分别为0、20、100和400μg/ml时的APTT值分别为39、51、89和150s；当样品的浓度分别为0、25、50、125和250μg/ml时的TT值分别为18.5、26.0、33.0、51.0s和不产生凝丝状物质；当样品的浓度分别为0.0、0.5、1.0、2.0、4.0mg/ml，PT值分别为11.0、15.5、18.0、23.7、和48.0s。从以上结果可看出，硫酸化丝素蛋白在上述质量浓度范围内随浓度增加对APTT、TT、PT均有明显的延长作用。
2对兔全血抗凝作用当样品的浓度分别为0.5、1.0、2.0、3.0、和4.0mg/ml时的血液凝固时间分别为30min、60min、＞2h、＞24h、＞24h；将样品浓度2.0mg/ml的抗凝血液2h后置4℃过夜，16h后发现形成凝块，但继续放置48h凝块又溶解，而0.5mg/ml、1.0mg/ml凝固血液的凝块仍无变化。
3抑制纤维蛋白(Fb)形成的作用1％纤维蛋白原(Fbg)生理盐水液、兔血浆各0.2ml，分别与等体积不同浓度的硫酸化丝素蛋白混匀，加入适量100u/ml的凝血酶使其终浓度为5u/ml，室温放置2h后观察Fb凝块的形成。结果硫酸化丝素蛋白可完全抑制Fb凝块的形成，完全抑制Fb形成的最低浓度为2mg/ml，且24h仍不凝固，而阳性对照组肝素终浓度为2.5mg/ml，2h观察Fb凝块尚未形成，置4℃过夜16h形成凝块。
4硫酸化丝素蛋白的抗凝作用机理体外抗凝作用的机理检测参考朱光正和游雄的方法，以生理盐水做阴性对照，以5％肝素为阳性对照，将96孔板置于37℃水浴中，加入40μl 0.5％Fbg溶液(磷酸缓冲液，PH7.4)加入等量待测样品或对照溶液，充分混匀，再加入15U/ml的凝血酶溶液，混匀，加入凝血酶的同时计时，以1min为界判定抗凝活性。
以生理盐水作为阴性对照检测抗凝活性时，30S内便有凝丝状物质产生，并逐渐形成大的纤维蛋白凝块10min后不溶解消失，没有抗凝活性；以肝素作为阳性对照检测时1min内均不产生凝丝状物质，具有抗凝活性；测定硫酸化丝素蛋白最低抗凝浓度的抗凝活性。
抗凝活性物质的作用方式，设计5组不同的试验，按不同的顺序分别加入纤维蛋白原、硫酸化丝素蛋白和凝血酶，以1min为界检测抗凝活性，结果如表1表1硫酸化丝素蛋白的抗凝作用方式(n＝3)
上表可以看出试验组A和B先加入纤维蛋白原和硫酸化丝素蛋白，然后再加入凝血酶，这时表现为抗凝活性；试验组C先加入凝血酶和硫酸化丝素蛋白，然后再加入纤维蛋白原，这时仍表现抗凝活性。据此可初步推断硫酸化丝素蛋白是和凝血酶作用而起到抗凝作用的，而非与纤维蛋白原作用。试验组D在试验组A表现为抗凝血作用的基础上“加入过量的纤维蛋白原时”仍表现凝活性；试验组E在试验组A表现为抗凝血作用的基础上“加入过量的凝血酶时”凝丝状物质形成的时间小于1min为抗凝阴性，进一步验证了上述推断。
5水解Fb的作用1％Fbg与等体积不同浓度的硫酸化丝素蛋白混匀，加入适量100u/ml的凝血酶使其终浓度为5u/ml，置于37℃水浴16h，完全抑制Fb凝块形成的硫酸化丝素蛋白最低浓度为4mg/ml；生理盐水为阴性对照，凝块形成时间为20S。
权利要求
1 一种硫酸化丝素蛋白的制备方法，其特征在于主要包括如下步骤(1)将蚕茧壳或废蚕丝用浓度为0.3～0.5％脱胶剂进行脱胶处理，得到丝素，其中蚕茧壳或废蚕丝与脱胶剂的体积/质量(V/W)比为50-100∶1；(2)丝素经过酸处理得到丝素微晶纤维；(3)用硫酸酯化试剂对丝素微晶纤维或丝素进行硫酸化反应；(4)调节产物PH至8～8.5，经过透析和冷冻干燥得硫酸化丝素蛋白。
2 根据权利要求1所述的硫酸化丝素蛋白的制备方法，其特征在于第(1)步中所述的脱胶剂采用Na2CO3或NaHCO3中的一种，在温度80～100℃条件下脱胶。
3 根据权利要求1所述的硫酸化丝素蛋白的制备方法，其特征在于第(2)步酸处理中采用盐酸或硫酸中的一种，其体积浓度为20～60％，与丝素的体积/质量(V/W)比为10～20∶1，温度0～30℃，水解2～5h。
4 根据权利要求1所述的硫酸化丝素蛋白的制备方法，其特征在于丝素微晶纤维或丝素在密闭状态下浸润于惰性溶剂中，浸润时间为20～60min。
5 根据权利要求1所述的硫酸化丝素蛋白的制备方法，其特征在于第(3)步所述硫酸化反应的温度0～25℃，反应时间15～90min，硫酸酯化试剂与丝素微晶纤维或丝素的体积/质量(V/W)比为10～30∶1。
6 根据权利要求1或5所述的硫酸化丝素蛋白的制备方法，其特征在于所述的硫酸酯化试剂是氯磺酸与惰性溶剂组成，惰性溶剂是指二氯甲烷、二氯乙烷、氯仿、二甲基甲酰胺或二甲亚砜中的其中一种，与氯磺酸摩尔比为1∶0.5～1.5。
7 根据权利要求4所述的硫酸化丝素蛋白的制备方法，其特征在于所述的惰性溶剂是指二氯甲烷、二氯乙烷、氯仿、二甲基甲酰胺或二甲亚砜中的其中一种。
8 根据权利要求6所述的硫酸化丝素蛋白的制备方法，其特征在于所述的硫酸酯化试剂通过下述方法得到在0～5℃冰盐浴中加入惰性溶剂，在氮气或干燥剂或氮气和干燥剂保护下向惰性溶剂中缓慢滴入氯磺酸，滴入速度为0.5～1ml/min。
9 根据权利要求1所述的硫酸化丝素蛋白的制备方法，其特征在于第(4)步将产物中和沉淀，所用试剂是一价盐氯化钠或醋酸钠的一种与乙醇溶液共为沉淀剂，浓度为2～5％(w/v)，用量为反应体积的4-5倍，然后用乙醇洗涤沉淀，并用2～3mol/L的氢氧化钠调节产物PH至8～8.5，最后将产物置蒸馏水中透析24～48h，并将透析液冷冻干燥。
10 一种硫酸化丝素蛋白为抗凝血、抗血栓剂在制备抗凝血药物上的应用。
全文摘要
本发明属于有机化学领域，主要涉及一种硫酸化丝素蛋白的制备方法及其在抗凝血药物上的应用，主要包括如下步骤将蚕茧壳或废蚕丝用浓度为0.3～0.5％脱胶剂进行脱胶处理，得到丝素，其中蚕茧壳或废蚕丝与脱胶剂的体积/质量(V/W)比为50－100∶1；丝素经过酸处理得到丝素微晶纤维；用硫酸酯化试剂对丝素微晶纤维或丝素进行硫酸化反应；调节产物pH至8～8.5，经过透析和冷冻干燥得硫酸化丝素蛋白。本发明采用氯磺酸－惰性溶剂的方法制备硫酸化丝素蛋白，原料成本低，来源丰富，操作简单，条件可控；本发明的硫酸化丝素蛋白为合成药物，具有显著的抗凝血、抗血栓活性，可望开发成为抗凝血药物、抗血栓剂，还可应用于抗艾滋病药物、抗凝血生物材料等方面。
文档编号C07K4/12GK101029079SQ200610052729
公开日2007年9月5日 申请日期2006年7月31日 优先权日2006年7月31日
发明者楼兰花, 丁志山, 高承贤 申请人:浙江中医药大学