专利名称：肝素或硫酸乙酰肝素与脱乙酰壳多糖结合用于预防或治疗由疱疹病毒引起的感染的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于制备可用于预防或治疗由疱疹病毒引起的感染的药物的特定硫酸化的多阴离子的葡糖氨基聚糖(glucoseaminoglycans)的用途。发明背景疱疹(Herpes)是一个通用名称，它指一个属的病毒，这些病毒在哺乳动物包括人中引起传染性疾病。与大多数传染相反，疱疹病毒常产生潜伏感染，因此它在中枢神经系统的神经根潜伏存在，从而在受到某些未知因素激活的情况下引起活动的疾病。目前还没有方法来治疗这类感染。激活该疾病的因素也几乎是未知的，但据信紧张、发烧、月经、阳光等都可以引起病毒的激活。从实践观点来看，疱疹病毒一般引起作为主要症状的皮疹。
已知有两种主要类型的单纯疱疹病毒，引起口部疱疹的HSV-1，和引起生殖器疱疹的HSV-2。在约10％的群体中，这些疾病引起反复的皮肤病痛及粘膜损伤。该病的疼痛和对外貌的影响是大多数患者主要关心的问题，于是消除疼痛及更快速康复是现有技术的主要进展方向。实质上要注意到的是在大多数患者中康复是自然发生的，因此努力的一个主要目标应当是加速康复的过程并提供止痛效果。发明简述本发明就其主要目的而言是提供一种用于预防或治疗由疱疹病毒引起的哺乳动物，包括人的传染病的新技术。
本发明的另一个目的是提供用于制备用于该治疗或预防的活性成分的新组合。
本发明的再一个目的是提供一种治疗由疱疹病毒在哺乳动物，包括人中引起的感染的方法。
从本发明下述的公开中这些和其它目的将会清楚起来，本发明提供的新技术在于使用肝素或硫酸乙酰肝素与脱乙酰壳多糖结合以制备用于预防或治疗由疱疹病毒在哺乳动物，包括人中引起的传染病的药物。
在这种应用中，优选根据肝素和脱乙酰壳多糖的结合来制备所说的药物。
肝素和硫酸乙酰肝素都是市场上可从许多生产商买到的。只要其能保持生物活性基本不被改变，那么这些成分的部分水解形式也是可以使用的。
用于预防或治疗由疱疹病毒引起的传染病的药物可以是各种物理形式的，例如粉末、软膏、糊剂、凝胶、悬浮液或溶液。所用的形式当然应当适应于所要治疗的疾病的性质。
本药剂中的一个主要成分是由β-D-氨基葡糖本体构成的线性1,4结合的多糖，即多糖脱乙酰壳多糖。脱乙酰壳多糖由几丁质N-脱乙酰化制备而来，几丁质是形成具外骨骼昆虫和贝壳的外壳的多聚物。市场上的几丁质是从组成渔业废物的蟹和虾壳回收而来。通过调节几丁质的碱处理可制备乙酰化程度各不相同的脱乙酰壳多糖。当以碱，例如氢氧化钠处理时，发生了N-脱乙酰作用，其中乙酰氨基被转换成氨基，于是就形成了脱乙酰壳多糖。
根据N-乙酰化程度、分子量及均一性，决定脱乙酰壳多糖的物理性质影响其应用的。脱乙酰壳多糖是可生物降解的，它可被来源于消化系统的几丁质酶及体液中的溶菌酶降解。
在本发明中优选使用N-乙酰化程度至多约为90％的脱乙酰壳多糖，更优选至多为50％。尤其优选N-乙酰化程度小于25％。
本发明中涉及的药物的两个主要成分，肝素或硫酸乙酰肝素及脱乙酰壳多糖适于与可药用的常规载体或赋形剂一起结合使用。更一般地优选该基质是液体基质，同时载体或赋形剂可含有增加粘度的多糖，该多糖可选自半纤维素，例如阿拉伯糖基木聚糖及葡甘露聚糖、植物胶，例如瓜耳胶、locust bean胶，纤维素及其衍生物，例如甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧基甲基纤维素、淀粉及淀粉衍生物，例如羟基乙基淀粉或交联淀粉、微生物多聚糖，例如xanthan胶、curdlan、支链淀粉、葡聚糖。还有藻多糖(algi polysaccharides)，例如琼脂糖、角叉胶、藻酸都可用来作为载体或赋形剂的成分。
在载体或赋形剂中优选使用的多糖是纤维素衍生物，例如甲基纤维素。
对所希望的药物来说，优选增稠的多糖与所说脱乙酰壳多糖的总重量不超过药物总重量的10％。
药物的优选物理形式是凝胶形式的，并且在这样凝胶形式的药物中，所说的多糖和脱乙酰壳多糖的结合量根据药物总体重量来说优选在0.5到约5％的范围内。
药物中所说的肝素和硫酸乙酰肝素优选占重量的约0,1到2％。
本发明还提供了一种方法，用于预防或治疗在哺乳动物，包括人中由疱疹病毒引起的传染病。该方法包括将活性量的含有肝素或硫酸乙酰肝素与脱乙酰壳多糖联用的药物施用于需要治疗的部位。实施例本发明将在下面的公开中与非限定性实施例一起进行描述。如果不另加说明，那么所说实施例中的部分与百分比都指的是重量。该说明是结合附图
进行的，其中对用于说明药物全部以及缺少一到两种成分的组合物5种不同组合物，以HSV-1噬斑效应对该5种不同组合物的连续样品稀释度进行了作图。实施例1-全药(Complete medicanent)制备将具有N-脱乙酰化程度为16％的脱乙酰壳多糖的盐酸盐(PronovaBiopolymers,Dramen,Norway)溶于无菌过滤的蒸馏水中以形成3％的脱乙酰壳多糖溶液。
制备含浓度为4克/升的含甲基纤维素的天然肝素的0.6％溶液。
将两种溶液进行高压灭菌并在无菌条件下以等量混合。以抗真菌的量加入山梨酸作为防腐剂。实施例2以类似方法制备实施例1的组合物，但除去山梨酸。实施例3以类似方法制备实施例1的组合物，但排除了山梨酸与肝素。实施例4以类似方法制备实施例1的组合物，但这次排除了山梨酸与脱乙酰壳多糖。实施例5
以类似方法制备实施例1的组合物，但这次除了山梨酸和肝素，还排除了脱乙酰壳多糖。实施例6-实验方法实验中所用的稀释剂是等渗NaCl(0.136摩尔/升)及伊格尔氏极限必需培养基(EMEM)。所用的病毒是HSV-1，菌株KOS321。
在24孔板上稀释样品。将1毫升的样品与1毫升的等渗NaCl混合，然后在等渗NaCl中进行连续二倍的稀释直至1∶32。每行中的最后一孔只含有等渗NaCl。以EMEM替代等渗NaCl也形成了同样的溶液。
具体步骤1．将100PEU的HSV-1的100微升等渗NaCl溶液加到连续稀释的样品中。
2．在室温下温育10分钟。
3．以2毫升的等渗NaCl或EMEM将细胞(绿猴肾细胞(Green monkeykidney cells)(GMK AH1)，铺满的单层，3天龄，6孔板)洗涤一次。
4．在细胞上加入1毫升的病毒样品混合物。
5．室温下温育1小时。
6．以2毫升的EMEM洗涤细胞两次。
7．加入3毫升的标准甲基纤维素溶液。
8．在37℃下二氧化碳恒温箱中温育3天。
9．以结晶紫(Crystal violet)溶液染色细胞并计数病毒噬菌斑。结果附图以HSV-1噬菌斑对样品稀释度(Sample dilution)(负的log2)作图方式表示。可从图中所描述的结果看出来1∶2和1∶4的稀释物导致的被各种制剂的抑制可能是由于甲基纤维素的存在而引起的。在1∶16和1∶32的稀释物中只有含肝素的制剂是有活性的。到1∶32的稀释后，含有肝素和脱乙酰壳多糖的制剂保留了抑制活性。
毒性试验表明所有组合物都是对GMK细胞无毒性的。实施例7-临床试验以凝胶形式，用根据上述实施例1组合物进行下述的临床试验。所有测试都用于治疗或预防由HSV-1病毒引起的口唇感染。
第1个病例通过预防治疗早期症状及治疗晚期感染，重复治疗15岁的男孩，以实施例1的组合物的局部施用在24小时之内消除了早期症状，并在72小时之内产生了康复效应。
第2个病例对一个48岁的男子进行了早期症状的预防治疗，结果与上述第一种情况是相同的。
第3个病例已将实施例1的药物成功地用于了一个9岁女孩的晚期疾病及预防治疗。
第4个病例用上述实施例1的组合物对患晚期舌部感染的一名3岁男孩进行了唇部治疗，在2天之内使得感染停止，并在4天之内康复。
第5个病例用实施例1所用的凝胶已成功地对一个52岁的男子进行了晚期疾病和早期症状的预防治疗。
全部上述涉及对病毒细胞生长的抑制和诊断测试的结果，确证了本发明的组合物对由疱疹病毒引起的传染病所具有的神奇疗效。用肝素与脱乙酰壳多糖的结合治疗该感染的成功实际上是未预料到的和令人惊奇的。虽然发明不限于任何特定的作用理论或机制，但可能是组合物中所用的基质提供了肝素以活性的形式的缓释而产生的。可以认为包括脱乙酰壳多糖的基质通过离子键与肝素结合，从而在治疗条件下存在的酶不会使其失活，这些酶例如有肝素酶(enzyme heparinas)。就肝素对酶降解和失活的敏感性这一点看来，这明显是难以预料的。
应该注意到上述以例子说明的本发明并不限于所说的具体实施方案，这是由于改进对本领域技术人员而言见相当简单的。因此，本发明的范围仅仅通过附加权利要求书来进行限制。
权利要求
1．用肝素或硫酸乙酸肝素与脱乙酰壳多糖结合以制备用来预防或治疗由疱疹病毒在哺乳动物包括人中引起的感染的药物的用途。
2．根据权利要求1的用途，其中的制备基于肝素和脱乙酰壳多糖的结合。
3．根据权利要求1或2的用途，其中脱乙酰壳多糖的N-乙酰化程度至多为约90％，优选至多为50％。
4．根据权利要求3的用途，其中脱乙酰壳多糖的N-乙酰化程度少于约25％。
5．根据上述权利要求任一项的用途，其中的药物形式为粉末、软膏、糊剂、凝胶、悬浮液、溶液或膜剂。
7．根据权利要求5或6的用途，其中所说的载体或赋形剂包括增加粘度的多糖。
8．根据权利要求7的用途，其中所说的增加粘度的多糖由纤维素衍生物组成。
9．根据上述权利要求任一项的用途，其中所说的药物包括液体基质。
10．根据权利要求6到8中任一项的用途，其中所说的增加粘度的多糖与所说脱乙酰壳多糖在所说药物中的总量来说少于10％重量。
11．根据权利要求10的用途，其中所说的药物形式为凝胶。
12．根据权利要求11的用途，其中所说的增加粘度的多糖与所说脱乙酰壳多糖在所说药物中的总重量从约0.5到约5％重量。
13．根据上述权利要求中任一项的用途，其中所说的肝素或硫酸乙酰肝素在药物中的重量从约0.1到约2％重量。
14．一种用于预防或治疗在哺乳动物包括人的由疱疹病毒引起的感染的方法，包括将活性量的含肝素或硫酸乙酰肝素和脱乙酰壳多糖的药物施加到需要治疗的部位上的步骤。
15．根据权利要求14的方法，其中所说的药物包含肝素及脱乙酰壳多糖。
16．根据权利要求14或15的方法，其中所说的药物为粉末、软膏、糊剂、凝胶、悬浮液、溶液或膜剂。
全文摘要
将肝素或硫酸乙酰肝素与脱乙酰壳多糖结合制备用于预防或治疗在哺乳动物包括人中由疱疹病毒引起的感染的药剂的用途；以及一种用于治疗由疱疹病毒引起的传染病的方法。
文档编号A61K31/722GK1227493SQ97197038
公开日1999年9月1日 申请日期1997年8月1日 优先权日1996年8月6日
发明者奥勒·拉姆, 马库斯·巴克, 托马斯·伯格斯特龙姆 申请人:梅迪卡布公司