专利名称：电压门控钙通道拮抗剂和方法
技术领域：
本发明涉及一类新型的肽化合物，该化合物专一性地阻断E类电压门控钙通道，并涉及阻断该通道的方法。本发明还涉及使用所述化合物例如治疗惊厥性疾病的治疗方法。
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背景技术：
电压门控钙通道存在于神经元、及心肌、平滑肌和骨骼肌、以及其它可兴奋细胞中。已知这些通道参与膜兴奋性、肌肉收缩以及细胞分泌，如细胞排粒(exocytotic)突触传递。在神经元细胞中，根据其电生理以及生化和药理学性质来分类电压门控钙通道。最近，基于通道的分子生物学进行了进一步分类。
钙通道通常根据它们的电生理学性质分类为低电压活化(LVA)或高电压活化(HVA)通道。目前已知HVA通道包括至少三组通道，即L-、N-和P/Q-型通道。这些通道相互之间是在它们的药理学和配体结合性质的基础上通过电生理学和生物化学性质来区别的。因此，二氢吡啶、二苯基烷基胺和哌啶与L-型钙通道的α1亚基结合，阻断神经元组织中的部分HVA钙电流，所述电流称为L-型钙电流。N-型钙通道对ω-conopeptides敏感，但是对二氢吡啶化合物如尼莫地平和硝苯地平相对不敏感。另一方面，P/Q-型通道对二氢吡啶不敏感，但是对漏斗网(funnel web)蜘蛛毒素AgaⅢA敏感。
类似于L-、N-、P-和Q-型通道，R-型钙通道被大的膜去极化活化，并因此归类为高电压活化(HVA)通道。R-型通道对二氢吡啶和ω-conopeptides不敏感，但是与P/Q、L和N-型通道类似，对漏斗网蜘蛛毒素Aga ⅣA敏感。免疫细胞化学染色研究表明，这些通道遍布在脑中，特别是在深中线结构(有尾壳(caudate-putamen)、丘脑、下丘脑、扁桃体(amygdala)、小脑)中以及前中脑和脑干核中。有人认为该通道主要存在于神经元细胞体和树突中，并在此对细胞电活性发生作用。还有证据表明R-型通道可能位于突触前神经末端上。
包括神经元电压敏感性钙通道的分子复合物是由中心α1亚基、α2/6亚基、β亚基和95KD亚基组成的。分子遗传学研究已经发现至少5类编码α1亚基的mRNA，并编号为A、B、C、D和E。它们相对于电生理学研究中定义的P/Q-型(α1A)、N-型(α1B)、L-型(α1c、α1D)、和R-型(α1E)电压门控通道(Snutch等人1990,Soong等人1993,Tsien等人1991；Biel等人1990,Mikami等人1989,Perez-Reyes等人1989,Tanabe等人，Williams等人1992；Fujita等人1993,Mori等人1991,Sather等人1993,Stea等人1994,Forti等人1994,Randall和Tsien 1994)。E类电压门控钙通道包括其电生理学表征为R-型的电流和G2电流的电流。
尚未知晓对于E类或R-型神经元钙通道为专一性或选择性的配体。虽然蜘蛛肽ω-Aga ⅢA拮抗该通道(Palma等人1995),但该肽亦可强效阻断N-、P/Q-和L-型钙电流(Cohen等人1993,Ertel等人1994),并因此缺乏专一性。因此，该通道缺乏专一性配体阻碍了其在神经元功能中作用的阐明。表1概述了在此所述电压门控钙通道的各种亚型的拮抗剂。
表1
由于神经元功能中专一性钙通道的重要性，其可用于鉴别专一性阻断E类钙通道的药物。本发明基于发现了可选择性阻断该通道的新一类肽。此类化合物在此是以新型的HG肽为例的，该肽得自于原始从H.Gigas分离的肽。
发明概述本发明涉及一类新型的肽，该肽可选择性地阻断E类钙通道。更具体而言，此等肽通常称为E类电压门控钙通道阻断肽，其能够在浓度为约10-50、更优选不超过10-20倍于阻断该通道所需之HG-1肽(SEQ ID NO:1)的浓度时阻断E类电压敏感性钙通道。在其它实施方案中，该肽的进一步特征是在其摩尔浓度约10倍于半最大阻断E类电压门控钙通道所需要的浓度时，其不能至少50％阻断在此所述的L-型、T-型、P/Q型或N-型钙通道。
在优选实施方案中，所述肽的形式为V1-SEQ ID NO:19-X2X3X4-SEQ ID NO:20-X5-LGC-X6X7X8X9-S-X10-SEQ ID NO:10-X11X12-T-X13X14X15，其中V1是GVDKX1G或缺失，X1是A或P；SEQ ID NO:19是CRYMFGGC；X2是S或E,X3是V或K,X4是D或N,SEQ ID NO:20是DDCCP,X5是R或K,X6是H或K,X7是S或D,X8是I或L,X9是F或L,X10是Y或缺失，SEQ ID NO:10是YCAW,X11是D或E,X12是L或V,X13是F或G,X14是S或E或缺失，以及X15是F或D或缺失。
在另一个优选实施方案中，肽的形式为SEQ ID NO:16-X1-FGGC-X2X3X4-SEQ ID NO:17-X5X6X7X8X9X10-SEQ ID NO:18-X11-TFSD，其中，X1选自Ⅴ类，X2选自Ⅱ类，X3选自Ⅳ或Ⅴ类，X4选自Ⅲ类，X5选自Ⅲ类或Ⅳ类或缺失，X6选自Ⅳ或Ⅴ类，X7选自Ⅱ或Ⅳ类，X8选自Ⅱ或Ⅴ类，X9选自Ⅵ类，X10选自Ⅱ或Ⅲ类，以及X11选自Ⅱ、Ⅴ或Ⅵ类。在进-步优选的实施方案中，在上述复合肽的可变位置上有以下取代基X1=M或L,X2=S或T,X3=V、K或R,X4=N或D,X5=K、Q或缺失，X6=H、R或L,X7=S或K,X8=L或G,X9=F或Y,X10=S或N，以及X11=L、F或G；SEQ ID NO:16是GVDKAGCRY,SEQ ID NO:17是DDCCPRLGC，以及SEQ ID NO:18是YCAWD。在又一个优选实施方案中，所述肽是SEQ ID NO:1(HG-1)、SEQ ID NO:8(HG-8)、SEQ ID NO:13(R9)、SEQ ID NO:14(R11)和SEQ ID NO:15(SNX-629)中的任何一个。
在另一个实施方案中，本发明包括分离多核苷酸，该核苷酸包括编码肽的核苷酸序列，所述肽选自具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、以及SEQ ID NO:15所限定之序列的肽。在另一个实施方案中，所述多核苷酸选自具有SEQ IDNO:23-SEQ ID NO:43所限定之序列的核苷酸。
在进一步的实施方案中，所述分离多核苷酸包括编码具有V1-SEQID NO:19-X2X3X4-SEQ ID NO:20-X5-LGC-X6X7X8X9-S-X10-SEQ ID NO:10-X11X12-T-X13X14X15序列之肽的核苷酸序列，其中V1是GVDKX1G或缺失，X1是A或P,SEQ ID NO:19是CRYMFGGC,X2是S或E,X3是V或K,X4是D或N,SEQ ID NO:20是DDCCP,X5是R或K,X6是H或K,X7是S或D,X8是I或L,X9是F或L,X10是Y或缺失，SEQ ID NO:10是YCAW,X11是D或E,X12是L或V,X13是F或G,X14是S或E或缺失，而X15是F或D或缺失。
在又一个实施方案中，所述分离多核苷酸编码具有SEQ ID NO:16-X1FGGC-X2X3X4-SEQ ID NO:17-X5X6X7X8X9X10-SEQ ID NO:18-X11-TFSD序列的肽，其中X1选自Ⅴ类，X2选自Ⅱ类，X3选自Ⅳ或Ⅴ类，X4选自Ⅲ类，X5选自Ⅲ类或Ⅳ类或缺失，X6选自Ⅳ或Ⅴ类，X7选自Ⅱ或Ⅳ类，X8选自Ⅱ或Ⅴ类，X9选自Ⅵ类，X10选自Ⅱ或Ⅲ类，而X11选自Ⅱ、Ⅴ或Ⅵ类。
在相关方面中，本发明包括抑制患者癫痫发作的方法。该方法包括向患者给药药物学有效剂量的HG肽，该肽能够在其浓度最多约10-50倍于阻断E类电压门控钙通道所需之HG-1肽(SEQ ID NO:1)的浓度时阻断所述通道。
在相关方面中，用于抗惊厥治疗方法中的肽的进一步特征是在其浓度最多约10倍于半最大阻断所述E类电压门控钙通道所需之浓度时不能至少50％阻断L-型、T-型、A类(P/Q-型)或B类(N-型)钙通道。用于该方法的优选肽具有以下序列V1-SEQ ID NO:19-X2X3X4-SEQ ID NO:20-X5-LGC-X6X7X8X9-S-X10-SEQ IDNO:10-X11X12-T-X13X14X15，其中V1是GVDKX1G或缺失，X1是A或P,SEQ ID NO:19是CRYMFGGC,X2是S或E,X3是V或K,X4是D或N,SEQ ID NO:20是DDCCP,X5是R或K,X6是H或K,X7是S或D,X8是I或L,X9是F或L,X10是Y或缺失，SEQ IDNO:10是YCAW,X11是D或E,X12是L或V,X13是F或G,X14是S或E或缺失，而X15是F或D或缺失。
在进一步相关方面中，本发明包括抑制神经垂体激素如催产素释放至循环系统中的方法。可使用该方法来防止例如早产或者抑制射乳反应。所述方法包括给药在合适药物赋形剂中的E类通道阻断HG肽。除可阻断E类通道的HG肽外，如在此所述，该治疗法还可包括给药L-型钙通道阻断剂、N-型钙通道阻断剂或P/Q-型钙通道阻断剂。在本说明书中，有效的治疗方案是可以消除早产的方法。此等方案还可用于抑制泌乳女性的射乳反应。
本发明还包括选择用于上述治疗方法(抑制催乳激素释放、抗惊厥活性)之化合物的方法。该方法包括测试能够在神经元组织中选择性阻断E类钙通道的化合物，然后选择在其浓度不超过10-50倍于有效阻断所述E类钙通道中钙电流的HG-1肽之浓度时阻断所述电流的化合物。
在相关实施方案中，本发明包括选择用于治疗如癫痫或催产素过度分泌的疾病的化合物的方法，在所述方法中显示出E类钙通道被阻断。选择方法包括在测定E类通道活性的试验系统中测试化合物，然后选择在其浓度不超过50倍于有效阻断所述通道的HG-1肽之浓度时阻断所述通道中钙电流的化合物。示例性的筛选试验是在此所述的神经垂体末端的全细胞膜片钳。再者，选择方法可使用另外的筛选法，如N-、L-、或P/Q-型钙通道试验，以确保所选择化合物对E类通道的选择性。
在另一个方面中，本发明包括制备E类电压门控钙通道阻断肽的重组方法。具体而言，为用于该方法中，本发明包括具有序列SEQ IDNO:23-SEQ ID NO:43的核苷酸片段。
通过参考附图阅读本发明的以下详细描述，本发明的上述和其他目的以及特征将变得更明显。
附图简述
图1(A-C)显示Hysterocrates gigas的粗毒液的洗脱(A)、A图峰值的重新色谱分离(B)、和B图峰值的重新色谱分离(C)的HPLC图谱，其中各图的箭头表示HG-1峰；图2A显示HG-1(SEQ ID NO:1)、HG-2(SEQ ID NO:2)、HG-3(SEQ ID NO:3)、HG-4(SEQ ID NO:4)、HG-5(SEQ IDNO:5)、R1(SEQ ID NO:11)、R2(SEQ ID NO:12)、R9(SEQ IDNO:13)、和R11(SEQ ID NO:14)之氨基酸序列的对比，这些序列对比显示出保守区和半胱氨酸残基(黑体字)；图2B显示HG-1(SEQ ID NO:1)、HG-2(SEQ ID NO:3)、HG-6(SEQ ID NO:6)、HG-7(SEQ ID NO:7)和HG-8(SEQ IDNO:8)的序列对比，以显示出保守区；图2C显示肽HG-1(SEQ ID NO:3)、HG-2(SEQ ID NO:4)、HG-8(SEQ ID NO:21)和HG-4(SEQ ID NO:22)的序列对比，以显示保守区；图2D显示HG-1、HG-10(SEQ ID NO:10)、HG-2、HG-6、HG-7、HG-9(SEQ ID NO:9)、HG-8和HG-14的序列对比，以显示保守区；图2E显示HG-1(SEQ ID NO:1)、HG-2(SEQ ID NO:2)和HG-3(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列对比，该序列对比显示了保守区和V1-V4可变区(黑体字)；
图2F显示HG-1、R9、R11、HG-10和SNX-629(HG-1(7-41)；SEQ ID NO:15)的对比；图3显示HG-1序列与grammatoxin S1A(Lampe等人1993)和hanatoxin肽的对比，对比出以黑体字显示的半胱氨酸残基；图4A-4G显示HG-1(SEQ ID NO:23(前导区)、SEQ ID NO:24(编码)和SEQ ID NO:25(整个序列))、HG-2(SEQ ID NO:26(前导区)、SEQ ID NO:27(编码)和SEQ ID NO:28(整个序列))、HG-3(SEQ ID NO:29(前导区)、SEQ ID NO:30(编码)和SEQ IDNO:31(整个序列))、HG-4(SEQ ID NO:32(前导区)、SEQID NO:33(编码)和SEQ ID NO:34(整个序列))、HG-4′(SEQ ID NO:35(前导区)、SEQ ID NO:36(编码)和SEQ ID NO:37(整个序列))、HG-6(SEQ ID NO:38(前导区)、SEQ ID NO:39(编码)和SEQ IDNO:40(整个序列))、和HG-9(SEQ IDNO:41(前导区)、SEQ IDNO:42(编码)和SEQ ID NO:43(整个序列))的编码序列，其中，在各序列中，前导序列的开始都以一直线和字母“L”表示，成熟肽编码区以一直线和箭头表示，而编码区的结束以第三个直线表示；图5显示在有或没有33nM HG-1存在时全细胞膜片钳(192C细胞)中钙电流的波形曲线；图6显示各种HG-1浓度对稳定表达E类(192C)和B类(S-3)型α-1亚基之细胞中峰值内钙电流的影响以及AgaⅢA对表达E类α-1亚基的192C细胞的影响；图7显示尼卡地平、ω-conotoxin MⅦA(SNX-111)、ω-conotoxin MⅦC(SNX-230)和HG-1(SNX-482)对神经垂体末端中钙电流(载于钡)的影响；图8(A-C)显示各种化合物对钾去极化后内钙浓度的浓度一作用曲线，其是以经钙敏感染料INDO-1处理的细胞的荧光比来测定的(A)在表达E类通道的192C细胞上，HG-1和Aga-ⅢA的作用；(B)在具有L-型和T-型两种钙通道的GH3细胞上，HG-1、Aga-ⅢA和尼群地平的作用，其中启动显示在有或没有5μM尼群地平时在经受钾去极化的细胞中INDO-1荧光的典型时间长度；(C)在IMR-32成神经细胞瘤细胞上，该细胞主要具有N-型钙通道，HG-1、Aga-ⅢA和SNX-194(met-12至norleu-12-SNX-111)的作用；图9A和9B显示各种剂量的SNX-482(HG-1)对经受听原性刺激的DBA/2鼠中惊厥行为的作用；图10显示在有或没有HG-1肽SNX-482存在时对电刺激产生的惊厥的累积剂量-反应曲线；图11A和11B显示各种剂量的SNX-629对经受听原性刺激的DBA/2鼠中惊厥行为的作用；和图12显示0、1或5μg SNX-629对电刺激惊厥的累积剂量-反应曲线。
发明详细描述定义在此所用术语“多核苷酸”是指具有支持能够氢键结合于典型多核苷酸之碱基的骨架的聚合物分子，其中聚合物骨架中的碱基能使所述氢键为聚合物分子和典型多核苷酸(如单链DNA)之间序列特异性的。所述碱基通常为肌苷、腺苷、鸟苷、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。聚合物分子包括双和单链RNA和DNA、它们的改性骨架，例如甲基磷酸酯键。
术语“载体”是指能够同化新型核酸、并在合适宿主中传播新序列的核苷酸序列。所述载体包括但不限于重组质粒和病毒。包括本发明之核酸的载体(如质粒或重组病毒)可处在负载体中，例如与蛋白质复合的质粒、与磷脂基核酸转导系统或者其他非病毒载体系统复合的质粒。在此所用术语“多肽”是指由通过肽键键合在一起的单链氨基酸残基构成的化合物。术语“蛋白质”与术语“多肽”同意，或者另外指两个或更多的多肽的复合物。
在此所用术语“基本同源”或者“基本相同”以及类似的说法是指一个氨基酸序列与另外一个氨基酸序列或者一个多核苷酸序列与另外一个多核苷酸序列，当将这些序列以最合适的序列对比进行比较时，至少有70％、更优选80％或更大是一致的。对于核苷酸序列，该术语还意味着未确定的核苷酸序列能够在特异性多核苷酸序列之杂交探针的筛选试验中被检测出。Ⅰ、E类电压门控钙通道阻断肽此部分描述本发明的新一类肽，集中在它们的结构特性上。E类电压门控钙通道阻断肽也被称为HG肽或者HG-1衍生物或类似物，在其结构的基础上对它们进行限定，并如以下第Ⅱ部分所述进一步在其体外钙通道阻断特异性的基础上对它们进行限定。A、E类电压门控钙通道阻断肽的分离HG肽可根据许多使用现有标准技术的方法来鉴定和分离。原则上，此类方法包括天然物质的生化学纯化、核苷酸编码序列的分离和/或鉴定、以及特征分子的合成或重组制造。在以下实施例中，“天然物质”是具体舞蛛种类的毒液腺，可以理解的是在此所述的分离和/或鉴定技术通常可适用于舞蛛以及其他蜘蛛和生物。以下实施例将描述这些方法。
1、Hysterocrates gigas毒液之HG-1的纯化。本发明发现对E类钙通道有选择性的肽可在Old World和New World舞珠如H.Gigas中鉴定并分离。这些肽在中性pH下是相对酸性的，并是相对疏水性的。因此，它们通常通过利用这些性质的方法来分离。这些方法通常已由Newcomb等人(1989)描述。
实施例1提供了能够用于从H.gigas毒液中纯化HG-1的示例性方法。简而言之，根据标准“乳化(milking)”技术收集蜘蛛毒液，然后闪冷至使用。将溶化的样品放入HPLC柱中，其细节见实施例1。根据标准技术，通过220nm处的吸光度和内源性荧光检测洗脱。在125分钟内1ml/min的0-100％线性梯度的甲醇12mM磷酸钠(pH6.2)溶液可使毒液组分产生良好的分离。
图1A显示了HPLC柱洗脱产生的吸光度(A220；上曲线)和荧光(下曲线)，在该HPLC柱上装有粗H.gigas毒液，其细节见实施例1。箭头代表HG-1活性的峰值，其是用在192C细胞(用E类通道稳定转染的HEK细胞)上进行的电生理学测定来估测的，具体见实施例6。图1B显示了使用0.1％TFA缓冲水溶液对图A的峰重新进行色谱分析得到的洗脱曲线，而图1C是使用0.05％HFBA缓冲水溶液对图B的峰重新进行色谱分析得到的洗脱曲线。
那些不存在于活性且包含HG-1之组分(glu和ile)中的氨基酸的Edman降解以及氨基酸分析表明，TFA纯化的物质(图B中的活性峰)为95-99％纯(其中该峰的早期洗脱部分具有更高的纯度)。由该分离中得到的活性物质通过使用0.05％七氟丁酸(HFBA)缓冲水溶液(0-65％甲醇5分钟，然后65-85％50分钟，图1C)重新进行色谱分离。Edman降解和氨基酸分析后，该物质为99％或更高的纯度。
使用上述方法，H.gigas的毒液可重复地产生在70-80％甲醇中洗脱并拮抗E类钙电流的物质。使用0.1％TFA、然后是0.05％HFBA缓冲水溶液，在酸性pH下通过反向色谱得到进一步的纯化。1ml样品的生物测定表明，E类钙拮抗剂与在这些溶剂系统(箭头，图1B和1C)上的主要材料共同进行色谱分析；如所测定的那样，两者通过全细胞膜片钳以及去极化引起内钙浓度的变化。
2、HG-1结构的确定。经纯化的HG-1肽进行基体辅助激光解吸质谱分析。根据该过程，HG-1测得的大约分子量为4500，但内源性荧光的存在表明其中有色氨酸。根据这些结果和氨基酸分析的结果(实施例3)，确定氨基酸组成如下表2所示。在该表中，氨基酸用常规的3字母标号表示，如果分析中没有拆分两个对映体(his)，或者在氨基酸分析中没有检测到(pro和cys)，则以DL表示。
表2HG-1的氨基酸组成
0.5nmol全长度烷基化肽的Edman降解在35位产生序列信息，这表明存在6个半胱氨酸残基和1个脯氨酸残基。用胰蛋白酶在23位切割2nmol的烷基化肽，而且羧基端片段的序列在39位上产生HG-1的序列，但是在40和41位处得到的Ser和Asp产率低(约1pmol)。通过测序胰蛋白酶片段的其余部分，证实了该序列的氨基端部分，其表明除HG-1的氨基酸41外没有其他的序列。用羧肽酶A进行消化，证实了羧基端的Ser-Asp序列。羧肽酶A和Y都释放游离羧基形式的Asp。在已确定手性的氨基酸(所有除gly、pro、cys和his外)中，仅检测出L对映体。HG-1序列预测肽的分子量为4495.10道尔顿。该分子量与使用电喷射质谱测定的(4494.86±0.11道尔顿)相一致。
HG-1的氨基酸序列见图2所示，编号为SEQ ID NO:1。
3、HG肽之核苷酸编码序列的分离。根据图2所示的HG肽序列，为分离和确定编码所示的HG肽以及其他HG肽的核苷酸的编码序列，设计并合成寡核苷酸引物。分离此等序列的一种有用方法是cDNA终端的PCR快速扩增(PCR-RACE)反应(Frohman等人1988,Frohman1990)，其具体见实施例10。
以HG-1为例，根据HG-1的N-端序列(如GVDKAGC)并使用降低简并性的昆虫密码子选择，设计并制备3′寡核苷酸引物。从3-5个蜘蛛的产毒细胞中分离Poly-A mRNA，然后使用实施例10中描述的方法制备cDNA。该cDNA进行TdT加尾，并用作底物，对于PCR用作3′引物，基于HG-1之N-端序列的简并寡核苷酸引物。用琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，在该分析的基础上，制备5′简并引物，并用于得到在编码区(如编码肽的N端部分的编码区上游)的5′端的非编码区。该方法可有利于从小量的起始物得到完全的编码区。分离片段的序列根据本领域已知的标准方法进行确定。示例性的核苷酸序列示于图4A-4G中。如图中所示，前导序列后是成熟肽编码区。
所得DNA编码片段可根据本领域已知的方法来合成，插入合适的载体中，然后用于构建产肽细胞，包括但不限于酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞和细菌细胞。
4、E类电压门控钙通道阻断肽的合成。HG肽和HG-1肽衍生物可用化学方法来制备或者如下所述使用本领域已知的方法进行重组表达。
a、固相合成。根据本发明的肽可使用自动肽合成仪根据本领域已知的方法用固相合成法来合成。制备结晶形式的N-α-保护的(F-moc)氨基酸酐，然后使用侧链保护基在N-端连续增加氨基酸。所述合成法是基于常规方法，需考虑HG-1肽是酸性易变的。从树脂上将肽断裂，然后在氧化和还原谷胱甘肽(1:2)存在下于pH9.5作进一步的处理(氧化)，以形成适当构型的链内二硫键。氧化步骤的进展通过C18柱的分析用HPLC来监测。使用制备性HPLC系统(Septech环形膨胀柱，Septech,Wakefield,RI)来实现肽的制备性纯化。
通过凝胶过滤由初始分离来分离肽，以除去肽二聚物和更高的聚合物，还可除去在氧化反应中使用的非所希望的盐如盐酸胍。经部分纯化的肽通过制备性HPLC色谱作进一步的纯化，然后用氨基酸组成分析来证实肽的纯度。
相应于HG-1的合成肽编号为SNX-482(SEQ ID NO:1)。相应于HG-1(8-41)的合成肽编号为SNX-629(SEQ ID NO:15)。
b、E类电压门控钙通道阻断肽的重组表达。可在细菌、酵母或优选的昆虫细胞中根据本领域已知的重组法制备肽。根据一种常规的方法，从蜘蛛如H.gigas的产毒细胞中得到细胞DNA，然后如以上部分2的下半部分所述分离HG-1或HG-1类似物的编码区。
或者，使用HG-1的氨基酸编码序列来产生相应的DNA编码序列，其中密码子选择适用于在所选择细胞(如细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞)中的表达。根据本领域已知的方法，通过顺序添加寡核苷酸来合成构建DNA编码序列。使用常规的限制消化和连接酶将克隆寡核苷酸并合入单个多核苷酸中。
在表达重组HG-1时，该合成编码序列可放入任何众多的细菌表达载体中例如λgtll(Promega,Madison WI)、pGEX(Smith等人，1985)、pGEMEX(Promega)、和pBS(Stratagene,La JollaCA)载体。其他包含合适启动子如T7 RNA聚合酶启动子和tac启动子的细菌表达载体也可使用。在昆虫细胞(Spodoptera frugiperda)中表达时，将编码序列插入合适的杆状病毒载体中，此等病毒载体可从Invitrogen(SanDiego,CA)得到。其他合适表达系统包括但不限于哺乳动物细胞(Clontech,Palo Alto,CA；Gibco-BRL,Gaithersburg MD)和植物细胞。
重组多肽可表达成融合蛋白或天然蛋白。许多特征都可人工改造进表达载体中，如促进表达序列分泌至培养基中的前导序列。重组制造的多肽通常可从溶解细胞或培养基中分离。可用本领域已知的方法进行纯化，这包括但不限于分级盐析、离子交换色谱及亲和色谱法。如以下B部分所述，可采用免疫亲和色谱法，其使用基于HG-1产生的抗体，特别是肽的保守区。
B、E类电压门控钙通道阻断肽的结构特征本发明发现HG肽具有使它们特别适合用作E类电压门控钙通道之选择性拮抗剂(阻断剂)的药理学特征。此部分描述术语“E类电压门控钙通道阻断肽”、“HG肽和”以及“HG-1衍生物或类似物”所包括的范围。本发明说明书中所用的术语“拮抗剂”在以下部分Ⅱ中描述和阐明。
E类电压门控钙通道阻断肽以如图2A所示的HG-1(SEQ ID NO:1)为例。如以下所述，结合与不具有所希望之药理学特征的相关结构对比，复合HG肽可通过对比以图2A-2F中编号为SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:15的各种结构形成，并形成HG肽结构限制的基础。
图3显示了HG-1序列与其他具有相同或类似半胱氨酸残基模式(C-C-CC-C-C)的蜘蛛钙和钾拮抗剂肽的对比。如图所示，HG-1的初级序列显示出与grammatoxm S1A(Lampe等人1993)和hanatoxin(Swartz和MacKinnon1995)肽具有某些同源性，这两种物质都是从舞蛛Grammostola spatulata中分离的。grammotoxin S1A是N-和P/Q-型钙通道的非选择性阻断剂，对L钙通道亚型则不是(Lampe等人1993；Piser等人1995)。hanatoxin是钾通道拮抗剂(Swartz和MacKinnon 1995)。需注意的是，在本发明的范围内，上述肽都没有表现出E类钙通道拮抗剂的活性。
从以上所述可以推论出，HG-1的半胱氨酸残基模式以及相关的肽对于E类钙通道选择性是必须但不是必要的。这些肽的结构因此代表未在所述“HG肽”之定义范围内的肽序列，因而只是在本发明范围内提供“阴性选择”的指导。
例如图2E显示了HG-1(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列与HG-2(SEQ ID NO:2)和HG-3(SEQ ID NO:3)推导氨基酸序列的对比。通过叠加半胱氨酸残基进行HG-1和HG-2的序列对比，在7、14、20、21、26和34位处发现6个半胱氨酸。为进行该序列对比，在图中以波折号表示的位置处引入空格。在以下的分析中，这些空格如图2E所示仍保留编号，即使它们代表活性HG-1肽的各基团中的氨基酸缺失。“活性”是指肽化合物在阻断E类电压门控钙通道的效力上比HG-1低最多1.5个对数单位(约30倍)、优选最多1个对数单位(10倍)。
使用对比序列作为引导，可通过使用以下限制因素形成HG-1肽类似物或衍生物1、如图2E中针对HG-2、HG-2和HG-3所示，肽包括在7、14、20、21、26和34位上的Cys残基。
2、肽在中性pH时为酸性的，而且通常是疏水性的。限制因素1和2保留了E类电压门控钙通道阻断肽在生理化学特性方面的基础构象以及该类化合物特性之二硫键模式。结合该限制因素1和2，考虑以下限制因素3和4，形成如图2A-2D所示的示例性肽的保守衍生物，然后考虑以上限制因素1和2以及以下限制因素3和5，形成更普通的HG肽。
3、保留在肽HG-1、HG-2和HG-3(图2E)之间相同或者在肽HG-1、R9、R11、HG-8和SNX-629(图2F)之间相同的氨基酸位。因此，例如，除上述Cys残基外，对于HG-1/HG-2/HG-3复合肽，保留相应于1-9位的氨基酸(SEQ ID NO:16)。
4、进一步参考HG-1/HG-2/HG-3复合肽，在形成保守HG-1肽衍生物时，允许在11个非保守残基(10、15-17、27-32和38位)处发生的氨基酸变异，以在母肽HG-1、HG-2和HG-3中的氨基酸取代之间改变。也就是说，将上述保守位定位于X1-X11时，该组化合物包括具有以下形式的肽结构SEQ ID NO:16-X1-FGGC-X2X3X4-SEQ ID NO:17-X5X6X7X8X9X10-SEQ ID NO:18-X11-TFSD，其中，如图2B所示，X1=M或L,X2=S或T,X3=V、K或R,X4=N或D,X5=K、Q或缺失，X6=H、R或L、X7=S或K,X8=L或G,X9=F或Y,X10=S或N，而X11=L、F或G,SEQ ID NO:16是GVDKAGCRY,SEQ ID NO:17是DDCCPRLGC,而SEQ ID NO:18是YCAWD。
5、考虑在标准取代类(根据常规侧链性质和在天然同源蛋白质中取代的最高频率分为6类，后者是例如根据标准Dayhoff频率交换基体(Dayhoff)来确定的)基础上的取代，进一步形成衍生物。这些类是Ⅰ类Cys；Ⅱ类Ser、Thr、Pro、4Hyp、Ala和Gly，代表小的脂族侧链和OH-基团侧链；Ⅲ类Asn、Asp、Glu和Gln，代表能够形成氢键的中性和负电荷侧链；Ⅳ类His、Arg、和Lys，代表碱性极性侧链；Ⅴ类Ile、Val、和Leu，代表分枝脂族侧链，以及Met；和Ⅵ类Phe、Tyr、和Trp，代表芳香侧链。另外，各组可包括相关氨基酸类似物，如在Ⅳ类中的鸟氨酸、高精氨酸、N-甲基赖氨酸、二甲基赖氨酸或三甲基赖氨酸，以及在Ⅵ类中的环己基丙氨酸或卤化酪氨酸。而且，分类可包括L和D立体异构体，但是L-氨基酸对于取代是优选的。根据上述分类，在序列SEQ ID NO:16-X1-FGGC-X2X3X4-SEQID NO:17-X5X6X7X8X9X10-SEQ ID NO:18-X11-TFSD中各位置上的取代可从以下分类中选择X1=Ⅴ类，X2=Ⅱ类，X3=Ⅳ或Ⅴ类，X4=Ⅲ类，X5=Ⅲ类或Ⅳ类或缺失，X6=Ⅳ或Ⅴ类，X7=Ⅱ或Ⅳ类，X8=Ⅱ或Ⅴ类，X9=Ⅵ类，X10=Ⅱ或Ⅲ类，而X11=Ⅱ、Ⅴ或Ⅵ类。
进一步的例子是，也是形成部分本发明，图2F显示所选择的序列HG-1、R9、R11、HG-8、HG-10和SNX-629的序列对比。如上所述合并这些序列形成具有以下形式的复合序列V1-SEQ ID NO:19-X2X3X4-SEQ ID NO:20-X5-LGC-X6X7X8X9-S-X10-SEQ IDNO:10-X11X12-T-X13X14X15，其中，V1是GVDKX1G或缺失，X1是A或P,SEQ ID NO:19是CRYMFGGC,X2是S或E,X3是V或K,X4是D或N,SEQ ID NO:20是DDCCP,X5是R或K,X6是H或K,X7是S或D,X8是I或L,X9是F或L,X10是Y或缺失，SEQ IDNO:10是YCAW,X11是D或E,X12是L或V,X13是F或G,X14是S或E或缺失，而X15是F或D或缺失。该序列可进一步泛化，以在X1-X15位上包括上述的Dayhoff类取代。
在更普通的意义上，进一步希望的是E类阻断肽可通过由上述合适取代类产生氨基酸取代来形成。另外，还希望的是肽的C-和/或N端延伸是可接受的，只要上述半胱氨酸残基之间的空间关系保持不变即可。上述氨基酸取代规则的目的是作为E类电压敏感钙通道阻断肽范围内允许氨基酸取代的一个指导。如果进行氨基酸取代或改性，则要进一步如部分Ⅱ所述根据选择性阻断E类钙通道的能力筛选肽。
也可根据本发明以及部分Ⅱ中所述的化合物测试法来鉴定具有E类通道阻断活性的钙通道拮抗剂化合物。在筛选方法中，筛选测试肽之选择性抑制E类钙通道的能力。如果化合物(ⅰ)在其浓度不超过10-50倍于阻断E类电压门控钙通道所需之HG-1浓度时，相同程度地有效阻断该通道的钙电导率；以及(ⅱ)在其浓度为约10倍于半最大阻断E类电压门控钙通道所需之摩尔浓度时，不能至少50％阻断L-型、T-型、P/Q型钙通道，则根据本发明测试化合物可选择用于阻断E类通道。
优选的筛选方法见部分Ⅱ，其细节见实施例5-9。Ⅱ、E类电压门控钙通道的药理学特性此部分描述E类电压门控钙通道阻断肽的药理学特性。该药理学特性能够对选择根据本发明的肽，更具体而言是选择用于治疗部分Ⅲ所述病症的肽提供指导。
在部分Ⅰ中，已确定HG肽和HG-1衍生物肽与某些结构标准相符。另外，本发明认为如在重组细胞中构建或者从天然物质中分离，如以下所述，有用的肽应能够选择性地阻断E类电压门控钙通道。A、E类电压门控钙通道的阻断E类钙电流可根据本领域评估钙在可兴奋膜两侧移动的许多方法来测定，如去极化诱导钙流入细胞、或者全细胞或端膜片(电生理技术，见实施例6)。通常来说，E类拮抗剂HG肽拮抗这些电流，优选是其浓度最大为10-50倍于HG-1对其他电流产生作用的摩尔浓度。
为确定具体的测试化合物对E类通道是否为选择性的，可在几种细胞类型中测定钙通道活性，所选的细胞具有相对均一的电压敏感离子通道前垂体细胞系--GH3，具有L-型和T-型两种钙电流；IMR-32成神经细胞瘤细胞系，据报道包含明显比例的N-型钙电流(Carbone等人1990)；192C细胞系，如在此所述被稳定地转染表达E类通道；以及由后垂体得到的神经垂体末端制剂，其表达以前的“耐药性”钙电流，该电流在支持本发明的试验中被认为是E类通道。另外，在IMR-32细胞中测量钠和钾通道活性，然后如以下所述在Xenopus卵母细胞中瞬时表达所选的通道(A类钙和钾通道)用其它通道活性测量。
1、电生理学测量。使用全细胞膜片钳记录钙电流，由此常规地测量钙通道活性。为此可使用具有E类通道的一种或更多种制剂。在一种制剂中，神经垂体末端制剂，细节见实施例6B及如下所述，使用药理学鸡尾酒阻断其他类型的钙通道(如P/Q型和L-型通道)以及制剂中的钠通道。残留的高电压活化电流是HG-1敏感性的，并因此定义为E类通道。该制剂适合于实施例6B所述的标准膜片钳法。
另外，可通过在细胞中添加E类通道的各种亚基的编码序列，在哺乳动物细胞中稳定地共同表达该通道。例如，如果人α1E(WO95/04144)、鼠α2(第5,407,820号美国专利)和β钙通道亚基的编码序列共同转染在细胞中，这些亚基可形成在E类通道内。再者，根据本领域的已知方法，人α1E亚基可与其他来源的α2和β亚基相互组合，形成用于测试的电生理学功能通道。
a、全细胞试验。图4显示了在有或没有33nM HG-1存在时、由192C细胞(被α-1E亚基稳定转染的HEK细胞，Home等人，1995)的全细胞膜片钳测定钙电流的波形。根据实施例6A所述的方法，由-90mV的保持电势至0mV的脉冲引发电流。电流衰变的分析表明在有或没有33nM HG-1存在下(减去400mSec时测定的预稳态电流值后的动力学分析)在192C细胞中引发了钙电流的单指数衰变(速率常数=12.5sec-1)。
为确定浓度-作用参数，在不同的HG-1浓度下得到记录，其中如上所述，在内电流的峰值时评估肽作用。图6显示各种浓度的HG-1和AgaⅢA对192C细胞中峰值内钙电流的作用。图6还显示了各种浓度的HG-1对S-3细胞稳定表达B类α-1型亚基(S-3)的作用，其中各数据点代表各浓度下3-5个独立测量的平均值和标准偏差，一个细胞在1或2个浓度下使用。
如图所示，HG-1阻断192C细胞中表达的E类电流，其IC50为25nM，而对B类电流估计为约800nM。这些值与以下所述用INDO-1去极化引发之通道试验中所得的表观IC50值相符合。Aga-ⅢA阻断192C细胞中的E类电流，其IC50为4nM。该值也与以下的INDO-1试验一致。
HG-1对E类电流的选择性可进一步在Xenopus卵母细胞中证实，其中所述卵母细胞用于表达A类α-1亚基。Aga ⅢA和镉测定对P/Q钙通道的作用。在这些试验中，根据本领域已知的方法，为技术原因测定在钙通道中通过的钡电流(4mM钡，无添加钙，在培养基中)。在高至280nM的浓度时，HG-1对电流没有作用。相反地，60nM Aga-ⅢA部分阻断、而镉完全阻断该电流。
b、神经垂体末端试验。在其他支持本发明的试验中，已发现E类阻断HG肽阻断多数神经内分泌组织中的电压门控钙通道，而以前发现这些通道对其他已知钙通道阻断剂的鸡尾酒是耐受性的。实施例6B提供了在神经垂体末端中化合物制剂及其电生理学测试的细节。近来表明这些末端释放某些肽激素(催产素、加压素)，其方式可用在神经元中鉴定的各种钙通道差别调节(Wang)。因此，企图使电生理学参数和肽释放相关的研究已揭示出，可按照与组合L-型、N-型和P/Q型钙通道的调节相一致的方式抑制加压素(AVP)释放；相反地，在有上述通道类型之药理学阻断剂存在时，仍持续残留的经刺激的催产素释放(Wang)。
在相同的神经垂体末端制剂中，如图7所示，2.5μm尼卡地平用于阻断神经末端的L-型电流。添加高浓度的N-和P/Q-型阻断剂SNX-111(3μm)和SNX-230(144nM)组合可部分但不是全部阻断残留电流。进一步添加40nM的HG-1肽(SNX-482)可导致残留电流的完全阻断。
根据本发明，可使用类似方法来测试其他E类阻断肽的效力。
2、去极化引发钙流入。电压敏感钙通道活性也可在可兴奋细胞中通过测量应答去极化作用如电刺激、刺激性神经递质或者高浓度的细胞外钾产生的钙流入来测定。因此，一个化合物阻断去极化刺激钙流入的能力是其通道阻断活性的表示。
如果所用制剂具有单通道类型或者主要是单通道类型，该技术对于测定通道特异性是特别有效的。如以下所述，在某些情况下，可用已知的通道拮抗剂阻断离子由第二通道的流入，这样，测量是在感兴趣的主通道进行的。
为监测IMR-32细胞中的N-型钙通道活性，还加入饱和浓度的尼群地平(二羟基吡啶)来阻断该细胞中的L-型钙通道。同样，GH-3细胞暴露在饱和浓度的尼群地平中，以仅测量T-型钙通道活性。
测量三种细胞系中钙电流的具体方法见实施例5。简而言之，根据常规方法在细胞中加入钙指示剂染料INDO-1乙酰甲基酯(MolecularProbes)。如上所述，在任何第二通道阻断剂存在下，在细胞中加入测试化合物。然后将细胞暴露在去极化浓度的钾离子中。在用钾刺激时，细胞中的胞内钙通常由100-150nM的基线值增加至接近1μm的刺激值。如实施例5所述，从这些数据可计算浓度作用曲线。用对L-型电流(尼群地平)、N-型电流(SNX-111=合成ω-conopeptideMⅦA)特异性钙拮抗剂以及低选择性钙拮抗剂(SNX-230=合成ω-conopeptide MⅦC和ω-Aga-ⅢA和非洛地平)的独立试验证实不同试验信号的药理学特异性。
在全细胞上进行荧光研究，该细胞被遗传改造以表达钙通道α1E亚基，如上述的192C细胞；或者，根据本领域已知的方法此研究在神经垂体末端制剂中进行。在遗传改变细胞中去极化引发的内钙增加对ω-conopeptides MⅦC和MⅦA是耐受性的，而这两种物质分别阻断P/Q通道和N-型钙通道，所述内钙增加对二羟基吡啶(L-通道阻断剂)尼群地平也是耐受性的。在此等试验中，如Grynkiewicz等人(1985)所述，400nm和490nm处的INDO-1荧光比随时间的变化与钙浓度有关。
图8A显示了上述INDO试验中得到的浓度作用曲线。数据以百分荧光比来表示，该比例提供在对照条件(即没有通道阻断剂时钾刺激细胞中的百分钙含量)下细胞中存在的钙。如图所示，HG-1阻断钾刺激的钙向这些细胞中的流入，其表观IC50为15nM(图8A，实心方块)。
Aga-ⅢA也阻断去极化引发的钙向细胞中的流入(表观IC50为5nM，图8A，实心圆)。这些结果与E类Ca2++通道的药理学一致(Palma等人1994)。相反地，如以下所述，HG-1不阻断钙向GH-3细胞或IMR细胞中的流入。据报道，通过全细胞膜片钳记录钡电流，前垂体细胞系--GH3具有L-型和T-型两种钙电流(Lievano等人，1994)。与此一致的是，二羟基吡啶尼群地平仅阻断去极化引发之内钙增加的持续组分，而该钙增加在60秒内不失活(表观IC50为400nM)，而且即使浓度大于5μM时，也不会完全阻断内钙的瞬间增加(图8B和开始)。存留的瞬间内钙增加完全被二羟基吡啶非洛地平阻断(表观IC50为600nM)。该二羟基吡啶在4μM和以下浓度时完全阻断心肌细胞中的L-型钙通道(Cohen等人1994)。HG-1在500-600 nM浓度时对去极化后40秒时评估的总内钙增加没有作用，而且对5μM尼群地平(图8B，开始)存在时内钙峰值(去极化后10秒)也没有作用，这表明HG-1不抑制L-型或T-型电流。相反地，Aga-ⅢA对这些细胞中去极化引发的信号产生强效但是部分的阻断作用(图8B，表观IC50=1.5nM，在去极化后60秒评估)，这与其报道的心肌中L-型电流的强效阻断是一致的(Cohen等人，1994)。
如上所述，IMR-32成神经细胞瘤细胞系具有钙(钡)电流，该电流对N-通道选择性ω-conopeptide GVIA是敏感的(Carbone等人，1990)。与观察到的一致，在这些包括阻断L-通道活性的尼群地平、SNX-194(N-通道阻断ω-conopeptide，其是ω-conopeptide MⅦA的met-12至nle-12衍生物)的细胞制剂中，几乎完全抑制内钙之残留瞬间去极化引发的增加，其表观IC50为1nM(图8C)。Aga-ⅢA对IMR-32细胞中引发的内钙浓度增加具有类似的作用(表观IC50=0.1nM)。HG-1对该电流有小的作用，而且还是在高浓度(IC50＞400nM)时。
根据实施例7中所述的方法进行测定，当在40nM浓度下灌流时，HG-1对IMR-32成神经细胞瘤细胞中的钠和钾电流没有作用。如实施例9中所测定的，HG-1对Xenopus卵母细胞表达系统中单个的克隆钾通道Kv1.1、Kv1.2和Kv1.4也没有作用。B、E类钙通道的选择性上述A部分中讨论的研究还指出了HG肽的第二个重要特征，即它们相对于其他类型的钙电流阻断E类钙电流的选择性。例如，虽然蜘蛛肽ω-Aga ⅢA拮抗E类钙通道(Palma等人，1995)，但还不能将其视为选择性配体，这是因为它可强效地阻断N和L-型钙电流(Cohen等人1993,Ertel等人1994)。相反地，如以上研究所证实的，当其浓度为至少10倍于半最大阻断E类电压门控钙通道之浓度，将示例性的HG肽HG-1在N-型、L-型、P/Q型或T-型钙电流、或者对钠或钾通道上测试时，该肽实际上对这些通道没有作用。C、E类钙通道拮抗剂的选择从以上支持本发明的试验中可以看出，HG肽(如具有部分ⅠB中所述结构特征和部分Ⅱ中所述药理学特征的肽)特异性阻断E类钙通道，其证据是与阻断由其他已知类钙通道中通过的电流需要相对较高的浓度(如N-型(IC50约为800nM)、P/Q-型、T-型和L-型)相比，该化合物在相对较低的浓度(IC50为15-25nM)即可阻断E类通道中的电流。
根据本发明，对钙通道为选择性的肽符合上述部分Ⅰ中描述的结构限制和上述活性特征。因此，E类通道选择性阻断肽是符合部分Ⅰ中所述之基本结构限制的肽其如图2E所示包括在相应于7、14、20、21、26和34位的位置上的Cys残基，并优选具有三个链内二硫键。在一个普通实施方案中，HG肽符合所示的HG-1/HG-2/HG-3或者HG-1/HG-8/R9/R11/SNX-629肽复合物的普通形式，但可包括在Dayhoff取代基范围内用于链中各附加位置的取代。在另一个实施方案中，E类钙通道阻断HG肽保留用于在此所述的一个或多个或复合肽的保守区，而且变化区将包括各变化位置所限定的取代。例如，对于HG-1/HG-2/HG-3肽，该肽的形式为SEQ ID NO:16-X1-FGGC-X2X3X4-SEQ ID NO:17-X5X6X7X8X9X10-SEQ ID NO:18-X11-TFSD，其中变化位置X1-X11如下选自于Dayhoff取代分类中X1=Ⅴ类，X2=Ⅱ类，X3=Ⅳ或Ⅴ类，X4=Ⅲ类，X5=Ⅲ或Ⅳ类或缺失，X6=Ⅳ或Ⅴ类，X7=Ⅱ或Ⅳ类，X8=Ⅱ或Ⅴ类，X9=Ⅵ类，X10=Ⅱ或Ⅲ类，而X11=Ⅱ、Ⅴ或Ⅵ类。
在另一个实施方案中，在11个非保守残基(位置10、15-17、27-32和38)上发生的氨基酸变异是允许的，以在母肽中的氨基酸取代之间变化。此中，更具体地以HG-1/HG-2/HG-3为例，肽的形式为SEQ ID NO:16-X1-FGGC-X2X3X4-SEQ ID NO:17-X5X6X7X8X9X10-SEQ ID NO:18-X11-TFSD，其中如图2E所示，X1=M或L,X2=S或T,X3=V、K或R,X4=N或D,X5=K、Q或缺失，X6=H、R或L,X7=S或K,X8=L或G,X9=F或Y,X10=S或N，而X11=L、F或G,SEQ ID NO:16是GVDKAGCRY,SEQ IDNO:17是DDCCPRLGC，而SEQ ID NO:18是YCAWD。前述经取代的肽在此定义为“HG-1/HG-2/HG-3复合肽”。
根据上述标准选择的肽如果对E类钙通道是选择性的，则可用于本发明中。该段的部分B描述了可用于测定此选择性的试验方案。具体而言，如果化合物能够在比其阻断其他已知钙通道(如N-型、L-型、T-型和P/Q-型通道)或者其他在可电兴奋细胞中的重要离子通道(如钠或钾通道)的浓度低得多的浓度下阻断E类通道，则认为该化合物对E类通道是选择性的。“低得多的浓度”是指与抑制其他离子通道，特别是L-型、N-型和T-型电压门控钙通道相比，抑制E类钙通道的有效摩尔浓度(以IC50计，更优选Ki)至少相差10-50倍。
因此，使用HG-1肽(SEQ ID NO:1)为例子，HG-1符合上述Ⅰ段所限定的最保守性的结构限制(即限制因素1-4)。如果用在测试对E类钙通道的选择性，根据两个独立的通道阻断活性测量，该肽阻断E类通道的IC50在15-25nM范围内。HG-1没有阻断L-型、T-型或P/Q型通道的证据，而且阻断N-型通道的IC50为＞400-800nM。该化合物也没有在相对较高浓度下阻断钾或钠通道的证据。因此，HG-1是选择性对E类钙通道阻断的。
同样，在支持本发明的试验中，还表明截短的HG-1肽SNX-629(SEQ ID NO:15)在其浓度少于约20倍于HG-1在相同试验(抑制钙吸收)中的浓度时抑制E类钙通道；因此，根据本发明，SNX-629是有效阻断E类通道的HG-1衍生物肽的候选者。
作为相反实施例，肽Aga ⅢA也表现为E类通道阻断剂的活性，其阻断通道的IC50为0.1nM(电生理学测量)-15nM(钙流入)。但是，Aga ⅢA不在如上所述并如图2和3所示的E类钙通道阻断肽的限定结构内。而且，该肽不是R-通道选择性，因为它还阻断N-型钙通道，其IC50为约0.1nM。Ⅲ、实用性选择性拮抗E类钙通道的HG肽和HG肽衍生物可用于治疗许多神经系统疾病，特别是那些涉及在脑中线区(有尾壳、丘脑、下丘脑、扁桃体、小脑)以及在前中脑和脑干的核中非正常信号传递的疾病，包括如下所示，投射至垂体中，特别是从下丘脑。钙从E类钙通道中的进入还起到细胞内信使的作用，这涉及其他离子通道和细胞蛋白质的调节。因此，肽可在细胞和网络水平上影响信号传递。得益于E类钙通道阻断的神经疾病可包括但不限于缺血性和创伤性脑损伤、癫痫、急性和慢性疼痛、以及心理疾病。以下描述本发明的两个示例性应用。A、抗惊厥活性在支持本发明的试验中，按照标准的试验动物癫痫发作模型--DBA/2听原性癫痫发作模型测试本发明的HG肽，该模型用于评估化合物抗惊厥活性、在癫痫以及其他脑癫痫发作疾病中的潜在应用。在该模型中的测试步骤的详细内容可见实施例11。简言之，遗传性易于癫痫发作的小鼠--DBA/2小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine)当暴露于特殊频率和强度的声源时，表现出可重复的癫痫发作行为模式。在该模型中已发现具有各种结构的化合物都是活性的，该模型与温度无关。这后一点对于诱导低温的钙通道阻断剂是特别重要的，而低温在许多动物中又是抗惊厥剂。
图9A和9B显示了测试结果，其中，小鼠(18-21天，约7-10g)在声刺激前30分钟通过脑室内途径给药0.5-5μg HG-1(SNX-482)。在图9A中显示了在声刺激过程中表现四种主要行为之一的百分测试小鼠(N=10/剂量)狂奔、阵挛性癫痫发作、紧张性癫痫发作和呼吸停止。图9B显示了各种动物的总癫痫发作分数，其中，癫痫发作根据强度分为0-4级，0=无癫痫发作活动，1=仅有狂奔，2=狂奔+阵挛性癫痫发作，3=狂奔+阵挛性癫痫发作，4=狂奔+阵挛性癫痫发作+紧张性癫痫发作+呼吸停止。DBA/2小鼠中抗惊厥作用的ED50约为0.8μg/鼠i.c.v.。图10显示在有或没有SNX-482时对增加电刺激反应在小鼠中产生惊厥的累积剂量-反应曲线。
同样，图11A和11B显示了研究结果，在该研究中，DBA/2小鼠在暴露于声刺激前i.c.v.给药SNX-629。在此发现约5μg/鼠的ED50。在前述研究中，数值通常得自于在此所示的图，而且基于2-3轮、每轮各10只鼠。图12显示了用SNX-629(1或5μg)治疗小鼠对电刺激惊厥的作用。B、神经内分泌治疗在支持本发明的试验中，并如上所述，已表明在催产素分泌中涉及R-型钙通道。在孕妇生产过程中以及在泌乳母亲的射乳反应中涉及催产素。HG肽可用于抑制催产素从垂体中的释放，由此(ⅰ)防止早产，和/或(ⅱ)在泌乳女性不希望哺育婴儿或者希望停止哺乳时抑制射乳反应。
对于上述方法，所述肽可以任何途径给药，使血药浓度足以阻断所希望位置处的钙通道。例如，因为后垂体邻近一个富毛细血管床(门毛细血管丛)，而所述垂体向该毛细血管床中释放激素，使药物靶向该毛细血管床的给药方法特别有利于抑制催产素由神经垂体的释放。类似地，释放肽至脑中的给药方法有利于产生抗惊厥活性。可从在此所述的合适动物模型中外推出适当的剂量。
给药方式包括但不限于例如静脉内给药、肺部释放(鼻吸入)、使用透皮药贴等。这些方法中适用于释放肽的可接受赋形剂在本领域中是已知的(Banga)。对于肽，口服(胃，或优选颊)以及直肠给药也是可以接受的，而且可与本发明一起使用。
鼻腔给药肽的优点是避免了肝脏循环中的首过效应，并因而相对较快地使肽发挥作用，并使消除浓度最小。所述肽可在合适盐和提供等渗性及稳定pH的缓冲剂存在下制成喷雾剂。该方法对于较小的肽通常是最合适的，而且使用某些渗透增强剂如溶血磷脂酰胆碱或非离子洗涤剂可有助于HG肽跨过鼻粘膜的转运。
同样地，肺部给药也可避免肝脏首过效应。该给药方式以及在利用该方式时应坚持的谨慎措施在本领域中是已知的。通常来说，肽可配制成由一个装置产生的气雾剂，所述装置例如是计量吸入器、喷雾器或干粉吸入器。产生的气雾剂应具有所选择的质量平均气动直径(MMAD)，以沉积在肺部，所述直径是粒径、形状和密度的函数。通常情况下，MMAD为约1-6μm的颗粒对向肺部的释放是最合适的。如需要也可在制剂中添加渗透增强剂和/或蛋白酶抑制剂。
虽然可通过标准的胃肠道由口服给药肽，但如果肽的预期作用点是垂体，则颊或舌下给药是优选的。颊粘膜是覆盖脸颊内部之口腔粘膜的一部分。对于本发明的肽，使用口腔粘膜粘合剂型，如带有粘性表面(羟丙基纤维素、carbopol)的片剂，则可在长时间接触中促进药物的吸收。除肽酶抑制剂外，渗透增强剂如非离子和离子表面活性剂也可有利于肽通过该途径的吸收(Banga)。
在选择给药方法时，临床医师也可滴加患者反应所需量的抑制剂，例如治疗早产时，临床医师可监视宫缩，并相应地改变药物量。为此目的，静脉内给药是可接受的，但是也可使用任何的上述方法。优选的是，HG肽的给药量足以产生约1-200nM HG-1肽的浓度(或者相关HG肽的生理相当量)；但如上所述，实际的给药量取决于临床医师对患者反应的评估、以及其他标准因素如患者体重、循环状况等。此等决定是在本领域技术人员的知识范围之内的。
通常情况下，在治疗此等神经疾病时，如果所给剂量在作用点产生约10-100nM或更高浓度，则化合物是有效的。根据待治疗患者的重量、作用点、以及化合物的药代动力学，产生此等浓度所需的剂量和给药途径对本领域技术人员是显而易见的。
以下实施例仅用于说明本发明，而不是限制本发明的范围。材料和方法A、Hysterocrates gigas毒液通过电场刺激收集雄性品种的毒液，然后闪冻(InvertebrateBiologics,Los Gatos,CA)。B、Agelenopsis aperta毒液从Spider Pharm(Feasterville,PA)得到冻干毒液。然后将该冻干毒液(等于0.5ml初始毒液体积)悬浮于0.5ml 0.1N HCl中后直接施用在Sephadex G-50(Pharmacia,Piscataway,NJ)大小排阻层析柱上。C、细胞系从American Type Culture Collection(ATCC Accession No.CRL 1573,Rockville,MD)得到人成神经细胞瘤细胞系IMR-32、鼠垂体细胞系GH-3、以及人胚胎肾细胞系293(HEK)，并将它们保存在添加有2mM谷氨酰胺和10％胎牛血清的RPMI1640培养基中。S3和192C细胞是HEK细胞，如下所述，这两种细胞可分别稳定地表达B类和E类钙通道。D、HEK293细胞的转染如PCT公开WO95/04144中所述，在pcDNAⅢ中构建载有人α-1E(hα-1E)钙通道亚基之编码区的载体，所述专利的内容在此引入作为参考。用本领域已知的标准方法(磷酸钙或脂转染胺介导的转染)转染HEK细胞，以形成表达E类电压敏感钙通道的192C细胞。
类似地，如Ellinor等人(1994)所述，由人α-1B钙亚基转染HEK细胞，由此形成S3细胞。E、细胞培养方法S3和192C细胞保存在DMEM中，该培养基添加有10％胎牛血清(FBS)、0.4mg/ml潮霉素B和0.6mg/ml遗传霉素G418(以上两种都得自于Boeringer Mannheim,Indianapolis,IN)，然后在铺板于载玻片上后2天使用。
在电生理学研究中，IMR-32细胞在添加有10％FBS的Dulbecco最小基本培养基(DMEM,Gibco-BRL)中培养，然后在无分化的情况下使用。对于内钙浓度的测定，在带有Earle盐并添加10％FBS、2mM谷氨酰胺和抗生素/抗有丝分裂混合物(Gibco-BRL)的Eagle最小基本培养基中培养细胞。通过添加1mM二丁酰cAMP和2.5μM5-溴脱氧尿苷(都得自于Sigma,St.Louis,MO)使上述细胞分化，然后在分化后7-15天使用。
GH-3细胞在添加有15％马血清、2.5％FBS和抗生素/抗有丝分裂混合物的Ham F-10培养基中培养。
实施例1HG-1的纯化在Gilson HPLC上用Newcomb等人(1989)描述的常规方法从Hysterocrates gigas中分离HG-1。使毒液(20-150μl)溶化，然后立即施用在填充有5μm颗粒的4.5×250mm“大孔”十八烷基二氧化硅柱(Vydac)中。用Gilson Holochrome检测仪通过220nm下的吸光度、以及用Hewlett-Packard 1046A型荧光检测仪(激发260nm，发射340nm,280nm发射截止过滤器)通过内源性荧光监测洗脱。用0-100％甲醇之12mM磷酸钠(pH6.2)溶液的线性梯度在125分钟的时间内以1ml/min进行洗脱(在重新使用前，所述柱用0.1％THF-甲醇的梯度洗涤，以除去未用pH6.2缓冲液洗脱的组分)。
通过以下实施例8中描述的膜片钳电生理学方法将拮抗E类钙通道的组分定位在1ml馏分中，然后在真空离心中从活性馏分(包含HG-1)中除去甲醇。使用0-25％甲醇之0.1％三氟乙酸(TFA)溶液线性梯度5分钟、然后25-80％甲醇梯度50分钟进行进一步的分级分离。
不存在于HG-1中的那些氨基酸(glu和ile)的Edman降解、以及氨基酸分析表明，TFA纯化物质为95-99％纯(峰值的早期洗脱部分具有更高的纯度)。为证实HG-1的活性，使用0.05％七氟丁酸(HFBA)(0-65％甲醇5分钟，然后65-85％50分钟)缓冲剂水溶液对上述分离中得到的活性物质重新进行色谱分离。以Edman降解和氨基酸分析估算，该材料的纯度为99％或更高。
实施例2ω-Aga-ⅢA的纯化A.aperta毒液在Sephadex G-50上进行大小排阻色谱分离，然后进行两步反相色谱分离(与实施例1中所述的Vydac柱相同)，由此分离ω-Aga-ⅢA(Venema等人，1992)；首先使用2 mM磷酸钾pH2.8-乙腈的梯度，然后使用0.1％TFA-乙腈的梯度(两个梯度为0.75％乙腈每分钟)。特征ω-Aga-ⅢA由Dr.Mike Adams(University ofCalifomia,Riverside)提供，并用作监测肽洗脱位置的标准物。使用天然肽经过20-30个循环的Edman降解来证实主要包含Aga-ⅢA序列(通常＞95％)的馏分，使用以电喷射法的质谱分析来说明样品由Aga-ⅢA组成(与Ertel等人，1993描述的实施方案相反)。如果情况不是如此，使用0.05％HFBA-甲醇的梯度(1.675％甲醇每分钟)进一步纯化Aga-ⅢA，得到纯度为99％或更高的制剂。
实施例3结构和序列测定A、氨基酸分析在氨基酸分析前，经纯化的肽样品进行酸解或者酶降解。于110℃下使样品(50-70pmol经纯化的HG-1每小瓶)在TEFLON塞住的自动进样器小瓶中的6N HCl中进行酸解20和48小时。通过与标准物(100pmol各L-氨基酸)的对比测定酸解物的氨基酸含量，所述标准物也进行酸解。
用N-乙酰基-L-半胱氨酸和o-邻苯二甲醛(OPA)(Bruckner等人，1989)然后是反相色谱和荧光检测分析，由此进行组成和C-端分析。经稀释的水解物放置在自动进样器小瓶中的40μl二甲基甲酰胺∶水1∶9中，然后使Gilson231-401自动进样器按程序添加25μl的1mg/ml OPA和50μl的1mg/ml硫醇，这两种物质都在0.5M硼酸钾pH10中。混合(约1分钟)后，将衍生物注射至4.5×250mmPhenomonex Primesphere“HC”十八烷基二氧化硅柱(5μm颗粒；Torrance,CA)上，该柱用15mM磷酸钠pH6.2补偿，然后用至65％甲醇的梯度洗脱87分钟。用Hewlett-Packard 1046A型荧光检测仪进行检测，该检测仪设定为340nm激发和408nm发射(408nm发射截止过滤器)。该系统拆分所有主要氨基酸的D和L对映体，但组氨酸除外(脯氨酸和半胱氨酸未检测到)。
通过与L-氨基酸标准物进行对比，确定氨基酸的比例，所述标准物也经受相同的水解处理(在6N HCl中于110℃下进行20或48小时)。与L和DL标准物进行对比，由此确定手性，在20小时的水解物中外消旋化低于5％。表1中所示的分析代表了50-70pmol的TFA(两个系统)和HFBA(三个系统)纯化物质的10个独立水解物。未列出的氨基酸(glu和ile)在组合物中的量为0.05或更低。Met和Trp的手性由天然和烷基化肽的羧肽酶消化分析来确定。色氨酸的量根据羧肽酶Y消化天然HG-1所达到的苏氨酸比例来确定。B、肽的酶消化干燥天然和烷基化HG-1(250-500pmol)，然后用在100μl0.1M磷酸钠pH6.2中的0.3μg羧肽酶Y(Pierce,Rockford,IL)消化。在各个时间点取出等分样品(10μl)，并用氨基酸分析来证实HG-1中有单个的色氨酸残基存在，还证实存在的氨基酸是L-对映体。因为羧肽酶Y消化不在HG-1的羧基端产生清楚的序列信息，所以在与羧肽酶Y相同的消化条件下用琼脂糖结合的羧肽酶Y(Sigma)重复进行天然HG-1的消化。
为证实Edman降解对酶处理样品的结果，干燥1-2nmol的HG-1，然后用在50μl0.1M磷酸钾pH7.4中的1μg胰蛋白酶(Pierce或Worthington,Freehold,NJ)进行消化(37℃下4小时)。如上所述，使用0-100％梯度的甲醇0.1％TFA溶液在1小时中拆分组分。C、肽还原和烷基化HG-1(2或4nmol的TFA-纯化物质)干燥，然后根据本领域已知的方法用4-乙烯基吡啶衍生化(例如见Tarr等人，1983；Hawke和Yuank,1987)。D、Edman降解用具有120A型分析系统的应用生物系统477A型测序仪(AppliedBiosystems Model 477A Sequenator)(Perkin-Elmer,Foster City,CA)，并使用制造商推荐的化学和鉴定程序，在烷基化完整的或经消化的肽上进行Edman降解。E、肽的质谱分析用Finnigan MAT900Q向前几何杂交质谱仪(forward geometryhybrid mass spectrometer)进行正离子电喷射离子化-质谱(ESI-MS)分析。质谱获得全加速电势(5kV)和10s/十年的扫描速率。所用的电喷射离子化界面是基于加热玻璃毛细管入口。在80∶15∶5乙腈/水/乙酸(v/v/v)中制备样品溶液，然后从ESI源以1μl/min的流速灌入。分析用1nmol TFA纯化的HG-1。
在以线性模式下运行的PerSeptive Vestec Laser Tec Research飞行时间质谱仪上获得基体辅助激光解吸/离子化(MALDI)质谱。在解吸过程中使用氮激光辐射(337nm)。在样品靶上放置1μl HG-1(1-10pmol/μl，在0.1％TFA中)的水溶液和1μl合适基体溶液[c.5mg/ml3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(芥子酸)或α-氰基-4-羟基肉桂酸(4-HCCA)在1∶2乙腈/0.1％TFA(含水)(v/v)中]，由此以标准方式制备样品。样品/基体溶液在分析前于室温下空气干燥。
实施例4生物测定样品的制备体外测定中所用的样品中HG-1和Aga-ⅢA浓度由氨基酸分析来确定。通常情况下，最终馏分包含最终浓度为约10-30μM的经纯化肽。在于各种测定缓冲剂中稀释100倍或者更多倍之前，于-80℃下储存馏分。如果测定更高浓度的肽，可将HPLC馏分的等分样品(约100μl)在真空离心中放置10-15分钟，由此从样品中除去甲醇。
实施例5细胞和神经制剂中钙流入的测定细胞中内钙浓度的INDO-1测定如材料和方法部分中所述，在培养基中培养和保存细胞。通过于30℃下在包含1％BSA的测定缓冲液(10Mm HEPES pH7.4，在Hanks平衡盐溶液中，没有碳酸氢盐或苯酚红)中与0.5mM EDTA温育并添加5μM INDO-1乙酰甲酯(Molecular Probes,Eugene,OR)60分钟，使细胞解吸。有负载的细胞洗涤两次，然后重新悬浮在包含0.5％BSA的测定缓冲液中(107细胞/ml)，并储存在冰上至使用(＜3小时)。在6ml 0.5％BSA之包含约3×106负载细胞的缓冲液溶液中添加各种浓度的测试化合物或载体对照。另外，在IMR-32细胞还添加5μM的尼群地平，以阻断L-型钙通道，而且在192C细胞中添加30-45μM的真菌霉素，以降低测试膜电势并使添加的细胞外钾快速去极化。样品在30℃下温育10分钟，然后等分放入三个一次性比色杯中。用Photon Technology Intemational的RF-F3004型分光荧光计于30℃下进行荧光测量，重复3次，所述分光荧光计的激发在350nm，双发射单色计设定在400nm和490nm。得到20秒的基础发射信号，然后用计算机控制泵在搅拌的比色杯中于1.86ml温育混合物中添加180μl的刺激溶液(1M氯化钾和68mM氯化钙)。去极化后30-50秒获得发射信号。
如Grynkiewicz等人(1985)对INDO-1所述，将基础和峰值发射比(400nm/490nm)转化为细胞内钙浓度(根据式[Ca++]i=Kd*((R-Rmin)/(Rmax-R))*Sf，其中R是测定的400nm/490nm比，其余的术语是描述INDO-1的光谱性质及其与游离钙相互作用的常数)。Rmin、Rmax和Sf值在Premack等人(1995)所述的2点校正中确定。
对于192C和IMR-32细胞，计算内钙升高峰值处的钙浓度(加钾后约10秒)，而GH-3细胞的值在有5μM尼群地平存在时在峰值应答处(T-电流)或者在不添加二羟基吡啶时在加钾后40秒(L-和T-电流的组合)测定。内钙增加通常从基线的100-150nM至接近于1μM的刺激值。从添加试剂的内钙升高与没有测试化合物时所观察到的数值的比例计算浓度-作用曲线。使用最小二乘法将这些数据拟合为一个4参数逻辑函数，以确定IC50值。
用对L-型电流(尼群地平)、N-型电流(SNX-111=合成ω-conopeptide MⅦA)特异性的钙拮抗剂、以及选择性差的拮抗剂(SNX-230=合成MⅦC、ω-Aga-ⅢA和非洛地平)进行独立的试验，以证实不同试验信号的药理学特异性。
实施例6电生理学测量A、稳定转染细胞的全细胞膜片钳在全细胞中根据膜片钳法测量电流(Hamill等人，1981)。电阻范围是2-6MΩ。用与PCLMP6软件(AxonInstrument)接口的Axopatch1C或Axopatch 200A(Axon Instruments,Foster City,CA)进行记录，以获得数据并进行分析。
使用由100四乙基氯化铵、52氯化胆碱、15氯化钠、2氯化钙、0.8氯化镁、10HEPES和7葡萄糖(单位为mM)组成的外浴溶液记录钙电流；所述溶液用盐酸调节pH至7.4，且325mOsM。在包含肽的溶液中添加作为载体的细胞色素C，其浓度为0.1mg/ml。内移液管溶液由140甲磺酸铯、5 EGTA、10 HEPES和4腺苷三磷酸镁组成，并用氢氧化铯调节pH至7.2，且310mOsM。由-90mV的保持电势至0mV改变电压，阶跃脉冲为每15sec.持续30msec.，由此引发电流，并测试肽对该电流的作用。在5KHz取样数据并在1KHz过滤。在测量由22mV超极化脉冲(“P/4”方案)引发的电流后，减去漏电流和电容电流。
通常情况下，HG-1结果是以对不使用串联电阻补偿电路而得到的电流振幅峰值的作用来表示的。在80％串联电阻补偿下进行的另外试验(见结果)表明，HG-1对电路随时间的衰变过程没有作用在误差之内，抑制值在有或没有串联电阻补偿时都是相同的，而且与电压步骤后不同时间处测量的肽作用相同。对于浓度-作用研究，通过流动或灌注的浴交换给药肽溶液。灌注溶液的交换通过溶液的灌注来证实，其中改变外钾浓度以及对于膜电势作用的测定。B、E类通道在神经垂体末端中的电生理学用二氧化碳使雄性鼠镇静，然后去头杀死。然后切下神经垂体，并在包含270mM蔗糖、10mM HEPES缓冲液、0.01mM EDTA钾且pH为7的溶液中均化。在膜片钳记录后，使用逆显微镜或通过免疫印迹来鉴定分离神经垂体的神经末端。所述末端用Normal Locke盐水溶液(140mM氯化钠、5mM氯化钾、5mM碳酸钠、2.2mM氯化钙、1mM氯化镁、10mM葡萄糖、10mM HEPES、0.1％牛血清白蛋白，pH7.2)灌注。在记录前，所述末端(直径通常为5-8μm)用包含以下物质的5mM Ba2+-LS灌注145mM氯化钠、5mM氯化钡、1mM氯化镁、10mM HEPES、15mM葡萄糖、0.02％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)和1μm河豚毒素(TTX),pH7.3。为得到有孔的“全末端”膜片记录(Rae等人，1995；Hamil等人，1981)，在包含135mM谷氨酸铯、10mM HEPES、5mM葡萄糖、2mM氯化钙、1mM氯化镁和20mM三乙胺(TEA)且pH为7.3的移液管溶液中放入新制的两性霉素B(240μg/ml)溶液。
记录时仅使用具有3-5 MΩ存取电阻(access resistance)的穿孔末端，以避免停止(run-down)。被去极化激活的Ba2+电流(IBa)为-80至+10mM，并证实瞬间和持续组分在该情况下没有任何停止地保持超过1小时。IBa在3 kHz处过滤并在10 kHz处取样。pCLAMP(AxonInstrument)是用于获得数据和进行分析。
实施例7IMR-320细胞中钠和钾电流的测定如上所述(Newcomb等人，1995)，使用实施例6中描述的全细胞膜片技术测定IMR-32细胞中的钠和钾电流，但进行以下改动外浴由与以下物质组成(单位为mM)140氯化钠、5氯化钾、10HEPES、2氯化钙、1氯化镁、以及12葡萄糖，用氢氧化钠调节pH至7.4，且有305mOSm。内移液管溶液由以下物质组成(单位为mM)15氯化钠、125甲磺酸钾、10HEPES、11EGTA、1氯化钙、2氯化镁和59葡萄糖，用氢氧化钾调节pH至7.4，且有295mOSm。在肽应用时，将细胞放置在流动腔中(0.5-1ml/min)。HG-1加在盐水中，而0.1mg/ml细胞色素C由小管直接放置与细胞相邻。
实施例8Xenopus卵母细胞中A类钙通道中电流的测量根据标准方法(Goldin,1992)，在Xenopus卵母细胞中表达Mori等人(1991)描述的α-1亚基的cRNA。在表达时，α-1亚基的cRNA与兔α2和δ(Ellis等人，1988)以及人β(Williams等人，1992)亚基的cRNA一起以等摩尔比注射。每卵母细胞注射约50nl，总cRNA浓度为0.8μg/μl。
使用包含4mM氯化钡、38mM氯化钾、36mM四乙基氯化铵、5mM4-氨基吡啶、0.4mM氮氟灭酸、5mM HEPES(pH7.5)、和0.1mg/ml牛血清白蛋白的溶液，由两个电极的电压钳记录电流。使用与PCLAMP软件(Axon Instruments，FosterCity,CA)接口的OC-725B电压钳(WarnerInstruments)放大器，在5kHz对数据取样，并在1kHz处过滤，以获得数据并进行分析。使用P/4方案，在线减去漏电流和电容电流。使用由-80mV保持电势至0mV的电压脉冲，以每10s引发电流。
实施例9Xenopus卵母细胞中钾通道电流的测量以mKv1.1、0.2μg/μl，hKv1.2、0.3ng/μl，和hKv1.4、0.02μg/μl的浓度在卵母细胞中注射入Tempel等人(1988)(MKv1.1)和Ramaswami等人(1990)(hKv1.2、hKv1.4)描述的由钾通道α亚基cDNA得到的cRNA。
用于记录钾电流的外溶液是115mM氯化钠、2.5mM氯化钾、1.8mM氯化钙、10mM HEPES pH7.2、0.1mg/ml牛血清白蛋白。所有其它步骤皆与实施例8所述的钙通道相同，但测试脉冲为每5sec.由-70mV的保持电势至+50mV。
实施例10聚合酶链反应的HG-2编码序列的分离根据标准方法，以图2B中所示的HG-1的N-端6氨基序列为基础，并使用D.Melanogaster的密码子选择，合成序列特异性简并引物。基因特异性核苷酸是GGC/T GTC/G GAT/C AAG GCC/T GGC/TTGC。使用5′引物的初期PCR试验的结果，得到3′引物。
除非另有说明，在此实施例中所述的所有缓冲液和试剂都如从Gibco-BRL(目录号18373-019)购得的cDNA端快速扩增用3′RACE系统试剂盒(3′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Endskit)中所描述和/或提供的。A、Hysterocrates gigas中总RNA的分离将从3只Hysterocrates gigas蜘蛛中得到毒液囊在8ml TRIzolTM溶液中均化，然后在转移1ml等分样品至Eppendorf试管中前，在室温下温育5分钟。在各1ml样品中添加0.2ml氯仿。剧烈摇晃样品15秒，然后在4℃下10-12000×g离心15分钟前，温育2-3分钟。将所得的含水相转移至新试管中，根据制造商(BRL)所提供的比例，在每ml Trizol中加入2-丙醇。混合物在室温下温育10分钟，然后在不超过12000×g下离心10分钟。除去上清液，然后将RNA沉淀重新悬浮于75％乙醇(每1ml TRIzol溶液至少添加1ml 75％乙醇)中。在Vortex混合器中混合样品，然后在不超过7500×g、4℃下离心5分钟。将RNA空气干燥，然后溶解在100μl经DEPC处理的水中。B、总RNA中poly-A mRAN的纯化(Qiagen的OLIGOTEX旋动(spin)柱方案)通过常规方法确定RNA样品中的总RNA量。如果该量低于250μg，将总RNA溶解在250μl DEPC水中。然后在RNA中添加预热至37℃之250μl 2×结合缓冲液和15μl OLIGOTEX悬浮液。轻柔地拍打试管底部，由此使试管混合，然后在65℃下温育3分钟，以破坏二级结构。然后将试管继续在室温下温育10分钟，接着在最大转速(约12000×g)下离心2分钟。抽出上清液，并使沉淀物重新悬浮在400μl洗涤缓冲液中。所得悬浮液加至Qiagen OLIGOTEX旋动柱的顶部。该柱在最大转速下离心30秒，然后弃去流出部分。将旋动柱转移至新的无RNA酶试管中，并重复加料和离心步骤。然后根据制造商的说明书，用100μl的预热(70℃)洗脱缓冲液洗脱柱两次。C、由poly-A mRNA合成第一链cDNA所用方法是3′RACE试剂盒Gibco-BRL中提供的标准方案。上述B部分中最多至50ng的poly(A)-选择RNA与DEPC处理水合并，在0.5ml微量离心管中使最终体积为11μl。在该试管中加入1μl的10μM衔接引物溶液(3′RACE试剂盒)。混合该离心管，然后通过简单离心收集反应物。将混合物加热至70℃10分钟，接着在冰上冷却冷冻至少1分钟。通过简单离心收集离子管中的内容物，并添加如下组分10×PCR缓冲液2μl25mM氯化镁2μl10mM dNTP mix 1μl0.1M DTT 2μl轻柔地混合离心管，通过简单离心收集反应物。然后使混合物平衡至42℃-5分钟。接着加入1μl SuperScript Ⅱ RT(逆转录酶)，并在42℃下温育15分钟。在70℃下温育15分钟，由此终止反应，然后在冰上冷却冷冻。通过简单离心收集反应物，并在离心管中加入1μl的RNA酶H，混合所述试管，温育20分钟。D、3′RACE PCR在0.5ml微量离心管中加入以下物质10×PCR缓冲液(GIBCO试剂盒)5μl25mM氯化镁3μl蒸馏水36.5μl10mM dNTP mix 1μlSGP1*10μM 1μlUAP#10μM 1μlTaq DNA聚合酶(5units/μl)0.5μl在离心管中加入2μl cDNA合成反应物，然后轻柔混合。在反应混合物上层覆75μl矿物油，然后通过简单离心收集。反应混合物在94℃下温育3分钟。进行35个循环的PCR，其使用以下方案变性94℃,45秒退火55℃,45秒延伸72℃,1分30秒混合物在72℃下另外温育10分钟，然后保持在4℃下。用琼脂糖凝胶电泳分析10μl扩增产物，其余的保藏在-20℃下直至使用。E、cDNA的5′RACE玻璃MAX分离旋动柱纯化对于每个待纯化样品，将100μl无菌蒸馏水平衡至65℃，然后将结合溶液平衡至室温。将120μl结合溶液(6M碘化钠)加至第一链反应(4.5体积结合溶液每体积DNA溶液)中。cDNA/NaI溶液转移至玻璃MAX旋动柱中，然后在最大转速下离心20秒。从试管中取出柱插入物，然后将流出物转移至微量离心管中。将柱插入物重新放入试管中，在该旋动柱中加入0.4ml冷却的1×洗涤缓冲液。然后在最大转速下离心柱20秒，弃去流出物。另外重复两次该洗涤步骤，用400μl上述冷却的70％乙醇再洗涤两次。在从离心管中除去最终的70％乙醇后，在最大转速下离心试管1分钟。将旋动柱插入物转移至新的样品回收管中，然后在该旋动柱中加入50μl无菌蒸馏水(已预热至65℃)，接着在最大转速下离心20秒，以洗脱cDNA。F、cDNA的TdT加尾5×加尾缓冲液包含以下组分DEPC处理的水55μl10×反应缓冲液25μl25mM氯化镁20μl5×缓冲液包括以下最终组分50mM Tris-HCl(pH8.4)
125mM氯化钾5mM氯化镁将以下组分添加至0.5ml微量离心管中DEPC处理的水6.5μ15×加尾缓冲液5.0μl2mM dCTP 2.5μlcDNA样品10μl将离心管在94℃下温育1-2分钟，然后在冰上冷却冷冻。通过简单的离心收集管中的内容物，然后放置在冰上。加入1μl TdT，然后轻柔混合，在37℃下温育10分钟。反应物的最终组成为10mM Tris-HCl(pH8.4)25mM氯化钾1.0mM氯化镁100μM dCTP0.4units/μl TdT将TdT混合物加热至65-70℃10分钟使之失活。G、dC-加尾之cDNA的PCR扩增在放于冰上的新0.5ml微量离心管中加入以下组分
29μl无菌蒸馏水4μl 10×反应缓冲液3μl 25mM氯化镁1μl 10mM dNTP1μl嵌套GSP2(10μM)1μl锚定引物(10μM)5μl dC-加尾的cDNA(GSP1和GSP2都是根据HG1的氨基酸序列设计的简并引物。GSP1:5′CAUCAUCAUCAUGGYGTSGAYAAGGCTGGYTGC3′GSP2:5′CUACUACUACUAGAARGTSARRTCCCARGC3′)，其中，A、T、G和C代表标准的脱氧核糖核酸，而且Y=C或T,R=A或G，且S=C或G。“U”代表在C-端的脱氧尿嘧啶。上述UAP和锚定引物是在上述GIBCO-BRL3′RACE试剂盒中提供的通用引物。混合离心管中的内容物，然后用75μl矿物油层覆。简单地离心该管以收集管底部的反应组分，然后在94℃下温育5分钟，并保持在80℃下。在1×反应缓冲液中将Taq DNA聚合酶稀释至0.4units/μl。在各反应中添加5μl经稀释的酶。混合物进行35循环的PCR扩增反应，其使用于上述3′RACE相同的方案。用琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色和适当的分子尺寸标准分析10μl扩增样品。H、在pAMP1载体(GIBCO-BRL)中克隆PCR产物在放置于冰上的0.5ml微量离心管中加入以下组分
2μl PCR产物(10-50ng)2μl pAMP1载体DNA(25ng/μl)15μl1×退火缓冲液1μl尿嘧啶DNA糖基化酶(1U/μl)混合各组分，然后在37℃下温育30分钟。温育后，将反应管放置在冰上。退火后，将退火一部分反应混合物(1-5μl)用于转化。I、转化将100μl DH5α细胞(感受态细菌细胞；GIBCO-BRL)放入在冰上的试管中。在该细胞中加入1μl退火产物，然后混合并在冰上培育30分钟。混合物接着在42℃下进行热振荡45秒，并在冰上培育2分钟。在试管中加入SOB+培养基(0.9ml)，在37℃下摇晃该试管1小时。在不超过4000rpm的转速下于4℃离心试管5分钟。除去0.9ml上清液，将其余的细胞铺板在LB板+羧苄青霉素+IPTG+X-gal(作为β-半乳糖苷酶的底物)上。板在37℃下温育过夜。J、小型DNA的制备制备小型DNA，以证实克隆和正克隆序列的成功。从平板上挑出白色集落。在37℃摇瓶机中，各集落在包含5ml LB培养基的不同试管中过夜温育，所述培养基中含有羧苄青霉素。然后根据标准方法制备DNA并测序(如Maniatis等人，1982)。
实施例11抗惊厥活性DBA/2鼠癫痫发作模型由Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine得到DBA/2小鼠(18-21天龄，约7-10g)，并饲养至少3天，以使它们适应实验室条件。在测试当天时，在暴露于声刺激前30分钟，根据标准方法(Jackson)由i.c.v.向小鼠外脑室中给药载体或测试化合物(总体积5μl)。注射后，将小鼠单独饲养在观察室中，并继续观察30分钟，以观察摇晃行为(持续的全身摇晃)或任何其它不正常的行为。使所述动物暴露在高强度声刺激(14Hz下100-110dB正弦声调)中。在暴露于声中的30秒期间，观察小鼠是否有阵挛性和紧张性癫痫发作，而且后肢伸长。
虽然已参考具体的方法和实施方案对本发明进行了描述，但应认识到，在不偏离本发明的情况下还可进行各种的改进。
权利要求
1.一种在其浓度最多为10-50倍于阻断E类电压门控钙通道所需之HG-1肽(SEQ ID NO:1)的浓度时能够阻断所述通道的HG肽。
2.如权利要求1所述的肽，其进一步的特征是在其浓度最多为10倍于半最大阻断所述E类电压门控钙通道所需要的浓度时，不能至少50％阻断L-型、T-型、P/Q-型或N-型钙通道。
3.如权利要求2所述的肽，其具有以下序列V1-SEQ ID NO:19-X2X3X4-SEQ ID NO:20-X5-LGC-X6X7X8X9-S-X10-SEQ IDNO:10-X11X12-T-X13X14X15，其中V1是GVDKX1G或缺失，X1是A或P；SEQ ID NO:19是CRYMFGGC；X2是S或E,X3是V或K,X4是D或N,SEQ ID NO:20是DDCCP,X5是R或K,X6是H或K,X7是S或D,X8是I或L,X9是F或L,X10是Y或缺失，SEQ IDNO:10是YCAW,X11是D或E,X12是L或V,X13是F或G,X14是S或E或缺失，以及X15是F或D或缺失。
4.如权利要求2所述的肽，其具有以下序列SEQ ID NO:16-X1-FGGC-X2X3X4-SEQ ID NO:17-X5X6X7X8X9X10-SEQ ID NO:18-X11-TFSD，其中，X1选自Ⅴ类，X2选自Ⅱ类，X3选自Ⅳ或Ⅴ类，X4选自Ⅲ类，X5选自Ⅲ类或Ⅳ类或缺失，X6选自Ⅳ或Ⅴ类，X7选自Ⅱ或Ⅳ类，X8选自Ⅱ或Ⅴ类，X9选自Ⅵ类，X10选自Ⅱ或Ⅲ类，以及X11选自Ⅱ、Ⅴ或Ⅵ类。
5.如权利要求4所述的肽，其中，X1=M或L,X2=S或T,X3=V、K或R,X4=N或D,X5=K、Q或缺失,X6=H、R或L,X7=S或K,X8=L或G,X9=F或Y,X10=S或N,以及X11=L、F或G；SEQ ID NO:16是GVDKAGCRY,SEQ ID NO:17是DDCCPRLGC，以及SEQ ID NO:18是YCAWD。
6.一种具有选自以下组之序列的肽SEQ ID NO:1(HG-1)、SEQ ID NO:8(HG-8)、SEQ ID NO:13(R9)、SEQID NO:14(R11)和SEQ ID NO:15(SNX-629)。
7.一种具有序列SEQ ID NO:1的肽。
8.一种具有序列SEQ ID NO:15.的肽。
9.一种分离多核苷酸，其包括编码以下肽的核苷酸序列，所述肽选自具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、以及SEQ ID NO:15所限定之序列的肽。
10.如权利要求9所述的分离多核苷酸，其选自具有SEQ ID NO:23-SEQ ID NO:43所限定之序列的核苷酸。
11.一种分离多核苷酸，其包括编码具有V1-SEQ ID NO:19-X2X3X4-SEQ ID NO:20-X5-LGC-X6X7X8X9-S-X10-SEQ IDNO:10-X11X12-T-X13X14X15序列之肽的核苷酸序列，其中V1是GVDKX1G或缺失，X1是A或P,SEQ ID NO:19是CRYMFGGC,X2是S或E,X3是V或K,X4是D或N,SEQ ID NO:20是DDCCP,X5是R或K,X6是H或K,X7是S或D,X8是I或L,X9是F或L,X10是Y或缺失，SEQ ID NO:10是YCAW,X11是D或E,X12是L或V,X13是F或G,X14是S或E或缺失，而X15是F或D或缺失。
12.一种分离多核苷酸，其包括编码具有SEQ ID NO:16-X1FGGC-X2X3X4-SEQ ID NO:17-X5X6X7X8X9X10-SEQ ID NO:18-X11-TFSD序列之肽的核苷酸序列，其中X1选自V类，X2选自Ⅱ类，X3选自Ⅳ或Ⅴ类，X4选自Ⅲ类，X5选自Ⅲ类或Ⅳ类或缺失，X6选自Ⅳ或Ⅴ类，X7选自Ⅱ或Ⅳ类，X8选自Ⅱ或Ⅴ类，X9选自Ⅵ类，X10选自Ⅱ或Ⅲ类，而X11选自Ⅱ、Ⅴ或Ⅵ类。
13.一种抑制患者癫痫发作的方法，其包括向患者给药药物学有效剂量的HG肽，所述肽能够在其浓度最多约10-50倍于阻断E类电压门控钙通道所需之HG-1肽(SEQ ID NO:1)的浓度时阻断所述通道。
14.如权利要求13所述的方法，其进一步的特征是在其浓度最多约10倍于半最大阻断所述E类电压门控钙通道所需之浓度时不能至少50％阻断L-型、T-型、A类(P/Q-型)或B类(N-型)钙通道。
15.如权利要求13所述的方法，其中，所述肽具有以下序列V1-SEQ ID NO:19-X2X3X4-SEQ ID NO:20-X5-LGC-X6X7X8X9-S-X10-SEQ ID NO:10-X11X12-T-X13X14X15，其中V1是GVDKX1G或缺失，X1是A或P,SEQ ID NO:19是CRYMFGGC,X2是S或E,X3是V或K,X4是D或N,SEQ ID NO:20是DDCCP,X5是R或K,X6是H或K,X7是S或D,X8是I或L,X9是F或L,X10是Y或缺失，SEQ ID NO:10是YCAW,X11是D或E,X12是L或V,X13是F或G,X14是S或E或缺失，而X15是F或D或缺失。
16.如权利要求13所述的方法，其中，所述肽具有选自SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:15之序列的序列。
17.一种抑制催产素在宿主中释放的方法，其包括向宿主给药药物学有效剂量的HG肽，所述肽能够在其浓度最多约10-50倍于阻断E类电压门控钙通道所需之HG-1肽(SEQ ID NO:1)的浓度时阻断所述通道。
18.如权利要求17所述的方法，其进一步包括向宿主给药选自L-型钙通道阻断剂、N-型钙通道阻断剂和P/Q型钙通道阻断剂的化合物。
19.如权利要求17所述的方法，其中，所述催产素释放的抑制可有效地消除孕妇早产。
20.如权利要求17所述的方法，其中，所述催产素释放的抑制可有效地抑制人宿主中的射乳反应。
21.一种选择用于阻断催产素由后垂体中释放之化合物的方法，其包括测试能够在神经元组织中选择性阻断E类钙通道的化合物，然后选择在其浓度不超过约10-50倍于有效阻断所述E类钙通道中钙电流的HG-1肽之浓度时阻断所述电流的化合物。
全文摘要
本发明涉及一类新型的肽化合物,该化合物可选择性地阻断E类电压门控钙通道。该类型肽以HG肽如HG－1为例,其是从舞蛛Hysterocrates gigas的产毒细胞中分离出来的。本发明还涉及使用所述肽阻断E类通道的方法。HG肽例如可用于抑制催产素的释放并用于惊厥性疾病的治疗。
文档编号A61P15/06GK1226929SQ97196988
公开日1999年8月25日 申请日期1997年8月1日 优先权日1996年8月2日
发明者罗伯特·纽科姆, 安德鲁·L·帕尔玛, 巴拉日·G·索克, 卡塔琳·塔尔齐－霍尔诺奇, 威廉·F·霍普金斯, 鲁斯·L·孔, 乔治·P·米利亚尼奇, 罗宾·迪恩, 拉斯洛·纳达什迪, 拉斯洛·乌尔格, 斯蒂芬·斯科特·鲍尔索克 申请人:伊兰制药公司