专利名称：猪软骨多糖的提取方法
技术领域：
本发明涉及多糖的提取方法，主要涉及猪软骨多糖的提取方法。
背景技术：
软骨多糖属于动物多糖类，存在于人或动物的软骨、喉骨、气管、肌腱、韧带、肌膜和血管壁等组织中。其组成为硫酸软骨素(CS)、透明质酸(HA)、硫酸角质素(KS)、硫酸皮肤素(DS)、甲壳素、肝素、低聚糖等。其中主要组成成分为硫酸软骨素，属于糖胺聚糖类(GAGs)，是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖以P -I, 3糖苷键连接形成二糖，而二糖单位之间以3 -1，4糖苷键连接而形成生物大分子，相对分子质量为5000-50000。许多研究表明上述多糖在抗癌、抗炎、抗病毒、调整血糖血脂以及增强机体免疫力等方面具有重 要的作用。一般认为多糖的抗癌原理大多是通过激活体内免疫系统来改善机体免疫力。现有的对软骨多糖的提取方法主要采用化学降解法和酶水解法。化学降解法存在软骨降解不充分，提取得到的多糖纯度低等缺点。酶水解法通常包括以下步骤软骨粉碎、碱液处理、酶解、纯化。如肖凯军等人发表的《鲨软骨粘多糖的酶法提取及组分分析》(华南理工大学学报自然科学版，2005年5月)，这种方法的缺点是酶解速度较慢，酶用量较大，反应时间长，纯化时采用多次溶解再沉淀的方法，酒精用量较大，并且产品纯度低。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供猪软骨多糖的提取方法，本方法具有酶用量少，酶解时间短，酒精用量少，生产成本低的优点。制备的猪软骨多糖纯度高、质量好。为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是猪软骨多糖的提取方法，包含以下步骤( I)猪软骨预处理将猪软骨粉碎得到猪软骨粉末；(2)碱处理将上述猪软骨粉末加入碱溶液，搅拌至猪软骨粉末完全溶解，得到猪软骨液；(3)酶解往上述猪软骨液中按1000-50000U/100g猪软骨的比例加入酶，按0. 05-0. 5g/100g猪软骨的比例加入酶激活剂进行酶解，酶解温度为50-70°C，酶解时间为60-240min ；(4)过滤将酶解后猪软骨液高温灭酶后，过滤，取滤液；(5)除杂取上述滤液过离子交换层析柱，用生理盐水溶液洗脱，收集洗脱液；(6)将洗脱液真空浓缩、乙醇沉淀、离心过滤、滤渣干燥后即得猪软骨多糖。上述步骤(2)中,所述碱溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。上述步骤(2)中，碱溶液的浓度为0. 55-0. 85mol/L，碱溶液的加入量为猪软骨体积的2-5倍。用碱溶液水解破坏细胞的膜结构，同时可使蛋白质初步降解为小肽，为下一步酶解奠定基础。上述步骤(3)中，所述酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、脂肪复合酶的一种或其任意混合物。上述步骤(3)中，所述酶激活剂为氯化钙、醋酸钙或柠檬酸钙。上述步骤(4)中，灭酶温度为90-100°C，灭酶时间为l-5min。上述步骤(6)中，所述的真空浓缩是指将洗脱液在-0. 095MPa、50°C的条件下减压浓缩至体积减少40-60%。上述步骤(6)中，乙醇沉淀是指向真空浓缩后的洗脱液中加入体积百分数95%的乙醇，并不断搅拌，直至洗脱液中酒精的体积含量为50-60%，停止搅拌，密封冷藏至猪软骨多糖充分沉淀。本发明中酶解过程中添加了酶激活剂，可减少酶的用量、缩短酶解时间，增强酶解效果。采用离子交换树脂进行吸附除杂，猪软骨多糖与树脂充分交换吸附，杂质随之分离出 来，只需一次酒精沉淀就能很好的提取出多糖，节省了酒精用量，降低了生产成本。采用本方法制得的猪软骨多糖质量好、纯度高。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明进行进一步阐述，下述说明只是示例，不对本发明进行限制。实施例II、取500g新鲜猪软骨，去肉，在95°C的温度条件下水煮lOOmin，充分去除猪软骨
中的油脂，然后将猪软骨清洗干净、粉碎至软骨颗粒、过30目筛。2、称取300g粉碎后的猪软骨粉，加入600ml浓度为0. 55mol/L的氢氧化钠，在1800r/min转速下机械搅拌350min，猪软骨粉末完全溶解，得到猪软骨液。3、往上述猪软骨液中加入3000U/g的胰蛋白酶以及0. 15g氯化钙进行酶解，酶解条件为反应温度为50°C,反应时间为60min,酶解结束后升温至90°C灭酶I分钟,过滤,取滤液。4、称取50g CM22树脂在蒸馏水中浸泡24h，使其充分溶胀。再用双蒸水反复洗涤，去除纤维素单体或碎片的悬浮颗粒。抽干，用0. 5mol/L的氢氧化钠溶液500ml浸泡30分钟，适当搅拌后，用双蒸水洗至中性，再用0. 5mol/L盐酸溶液500ml浸泡30分钟，适当搅拌后，用双蒸水洗至中性。最后用0. 5mol/L的氢氧化钠溶液500ml浸泡30分钟,适当搅拌后，用双蒸水洗至中性，抽干。取预处理好的CM22树脂50g加入适量双蒸水，搅拌，用超声脱气后，沿玻璃棒缓慢一次灌到2. 0X60cm层析柱中，同时轻敲柱壁，使填料沉降均匀，致密，柱高45cm，静态沉降24h，使层析柱达到平衡。5、将步骤3所述的滤液以2ml/min的流速过上述层析柱，用生理盐水洗脱，流速为0. 5ml/min，用苯酚-硫酸法跟踪检测洗脱液，在484nm的波长下测定吸光度，直到不再有多糖检出，停止洗脱并收集洗脱液。6、将洗脱液减压浓缩至体积减少40%后，缓慢加入体积百分数为95%的乙醇，并不断搅拌，直至洗脱液中酒精的体积含量为50%，停止搅拌，密封冷藏(4°C)48小时后，猪软骨多糖充分沉淀，离心过滤、滤渣冷冻干燥后即得猪软骨多糖，测定软骨多糖的纯度为96. 1%。实施例2I、取500g新鲜猪软骨，去肉，在95°C的温度条件下水煮lOOmin，充分去除猪软骨中的油脂，然后将猪软骨清洗干净、粉碎至软骨颗粒、过30目筛。2、称取300g粉碎后的猪软骨粉，加入1500ml浓度为0. 85mol/L氢氧化钾，在1800r/min转速下机械搅拌350min，猪软骨粉末完全溶解，得到猪软骨液。3、往上述猪软骨液中加入150000U/g的木瓜蛋白酶以及I. 5g醋酸钙进行酶解，酶解条件为反应温度为70°C，反应时间为240min，酶解结束后升温至90°C灭酶5分钟，过滤，取滤液。4、称取50g DEAE-52树脂在蒸馏水中浸泡24h，使其充分溶胀。再用双蒸水反复洗涤，去除纤维素单体或碎片的悬浮颗粒。抽干，用0. 5mol/L的氢氧化钠溶液500ml浸泡30分钟，适当搅拌后，用双蒸水洗至中性，再用0. 5mol/L盐酸溶液500ml浸泡30分钟，适当搅拌后，用双蒸水洗至中性。最后用0. 5mol/L的氢氧化钠溶液500ml浸泡30分钟,适当搅拌后，用双蒸水洗至中性，抽干。取预处理好的DEAE-52树脂50g加入适量双蒸水，搅拌，用超声脱气后，沿玻璃棒缓慢一次灌到2. 0X60cm层析柱中，同时轻敲柱壁，使填料沉降均 匀，致密，柱高45cm，静态沉降24h，使层析柱达到平衡。5、将步骤3所述的滤液以lml/min的流速过上述层析柱，用生理盐水洗脱，流速为0. 5ml/min，用苯酚-硫酸法跟踪检测洗脱液，在484nm的波长下测定吸光度，直到不再有多糖检出，停止洗脱并收集洗脱液。6、将洗脱液减压浓缩至体积减少60%后，缓慢加入体积百分数为95%的乙醇，并不断搅拌，直至洗脱液中酒精的体积含量为50%，停止搅拌，密封冷藏(4°C)48小时后，猪软骨多糖充分沉淀，离心过滤、滤渣冷冻干燥后即得猪软骨多糖，测定软骨多糖的纯度为95. 8%。实施例3I、取500g新鲜猪软骨，去肉，在95°C的温度条件下水煮lOOmin，充分去除猪软骨
中的油脂，然后将猪软骨清洗干净、粉碎至软骨颗粒、过30目筛。2、称取300g粉碎后的猪软骨粉，加入900ml浓度为0. 65mol/L氢氧化钠，在1800r/min转速下机械搅拌350min，猪软骨粉末完全溶解，得到猪软骨液。3、往上述猪软骨液中加入60000U/g的含有胰蛋白酶、脂肪蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合酶以及0. 75g柠檬酸钙进行酶解，酶解条件为反应温度为60°C，反应时间为120min，酶解结束后升温至90°C灭酶3分钟，过滤，取滤液。4、称取50g DEAE-Ol树脂在蒸馏水中浸泡24h，使其充分溶胀。再用双蒸水反复洗涤，去除纤维素单体或碎片的悬浮颗粒。抽干，用0. 5mol/L的氢氧化钠溶液500ml浸泡30分钟，适当搅拌后，用双蒸水洗至中性，再用0. 5mol/L盐酸溶液500ml浸泡30分钟，适当搅拌后，用双蒸水洗至中性。最后用0. 5mol/L的氢氧化钠溶液500ml浸泡30分钟,适当搅拌后，用双蒸水洗至中性，抽干。取预处理好的DEAE-Ol树脂50g加入适量双蒸水，搅拌，用超声脱气后，沿玻璃棒缓慢一次灌到2. 0X60cm层析柱中，同时轻敲柱壁，使填料沉降均匀，致密，柱高45cm，静态沉降24h，使层析柱达到平衡。5、将步骤3所述的滤液以lml/min的流速过上述层析柱，用生理盐水洗脱，流速为0. 5ml/min，用苯酚-硫酸法跟踪检测洗脱液，在484nm的波长下测定吸光度，直到不再有多糖检出，停止洗脱并收集洗脱液。6、将洗脱液减压浓缩至体积减少55%，缓慢加入体积百分数为95%的乙醇，并不断搅拌，直至洗脱液中酒精的体积含量为50%，停止搅拌，密封冷藏(4°C)48小时后，猪软骨多糖充分沉淀，离心过滤、滤渣冷冻干燥后即得猪软骨多糖，测定软骨多糖的纯度为97. 0%。实施例4I、取500g新鲜猪软骨，去肉，在95°C的温度条件下水煮lOOmin，充分去除猪软骨
中的油脂，然后将猪软骨清洗干净、粉碎至软骨颗粒、过30目筛。2、称取300g粉碎后的猪软骨粉，加入1200ml浓度为0. 75mol/L氢氧化钾，在1800r/min转速下机械搅拌350min，猪软骨粉末完全溶解，得到猪软骨液。3、往上述猪软骨液中加入30000U/g的脂肪蛋白酶与木瓜蛋白酶的混合酶以及0. 3g醋酸酸钙进行酶解，酶解条件为反应温度为70°C，反应时间为180min，酶解结束后升 温至90°C灭酶，过滤，取滤液。4、称取50g DEAE-Cellulose树脂在蒸馏水中浸泡24h，使其充分溶胀。再用双蒸水反复洗涤，去除纤维素单体或碎片的悬浮颗粒。抽干，用0. 5mol/L的氢氧化钠溶液500ml浸泡30分钟，适当搅拌后，用双蒸水洗至中性，再用0. 5mol/L盐酸溶液500ml浸泡30分钟，适当搅拌后，用双蒸水洗至中性。最后用0. 5mol/L的氢氧化钠溶液500ml浸泡30分钟,适当搅拌后，用双蒸水洗至中性，抽干。取预处理好的DEAE—CelIulose树脂50g加入适量双蒸水，搅拌，用超声脱气后，沿玻璃棒缓慢一次灌到2. 0X60cm层析柱中，同时轻敲柱壁，使填料沉降均匀，致密，柱高45cm，静态沉降24h，使层析柱达到平衡。5、将步骤3所述的滤液以2ml/min的流速过上述层析柱，用生理盐水洗脱，流速为0. 5ml/min，用苯酚-硫酸法跟踪检测洗脱液，在484nm的波长下测定吸光度，直到不再有多糖检出，停止洗脱并收集洗脱液。6、将洗脱液减压浓缩至体积减少50%后，缓慢加入体积百分数为95%的乙醇，并不断搅拌，直至洗脱液中酒精的体积含量为50%，停止搅拌，密封冷藏(4°C)48小时后，猪软骨多糖充分沉淀，离心过滤、滤渣冷冻干燥后即得猪软骨多糖，测定软骨多糖的纯度为96. 5%。
权利要求
1.猪软骨多糖的提取方法，其特征在于包含以下步骤 (1)猪软骨预处理将猪软骨粉碎得到猪软骨粉末； (2)碱处理将上述猪软骨粉末加入碱溶液，搅拌至猪软骨粉末完全溶解，得到猪软骨液； (3)酶解往上述猪软骨液中按1000-50000U/100g猪软骨的比例加入酶，按0.05-0. 5g/100g猪软骨的比例加入酶激活剂进行酶解，酶解温度为50-70°C，酶解时间为60_240min ； (4)过滤将酶解后猪软骨液高温灭酶后，过滤，取滤液； (5)除杂取上述滤液过离子交换层析柱，用生理盐水溶液洗脱，收集洗脱液； (6 )将洗脱液真空浓缩、乙醇沉淀、离心过滤、滤渣干燥后即得猪软骨多糖。
2.根据权利要求I所述的猪软骨多糖的提取方法，其特征在于步骤(2)中，所述碱溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
3.根据权利要求2所述的猪软骨多糖的提取方法，其特征在于步骤(2)中，碱溶液的浓度为0. 55-0. 85mol/L，碱溶液的加入量为猪软骨体积的2_5倍。
4.根据权利要求I所述的猪软骨多糖的提取方法，其特征在于步骤(3)中，所述酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、脂肪复合酶的一种或其任意混合物。
5.根据权利要求I所述的猪软骨多糖的提取方法，其特征在于步骤(3)中，所述酶激活剂为氯化钙、醋酸钙或柠檬酸钙。
6.根据权利要求I所述的猪软骨多糖的提取方法，其特征在于步骤(4)中，灭酶温度为90-100°C，灭酶时间为l-5min。
7.根据权利要求I所述的猪软骨多糖的提取方法，其特征在于步骤(6)中，所述的真空浓缩是指将洗脱液在-0. 095MPa、50°C的条件下真空浓缩至体积减少40_60%。
8.根据权利要求I所述的猪软骨多糖的提取方法，其特征在于步骤(6)中，乙醇沉淀是指向真空浓缩后的洗脱液中加入体积百分数95%的乙醇，并不断搅拌，直至洗脱液中酒精的体积含量为50-60%，停止搅拌，密封冷藏至猪软骨多糖充分沉淀。
全文摘要
本发明公开了一种猪软骨多糖的提取方法，其步骤包括猪软骨预处理、碱处理、酶解、灭酶后过滤、离子交换树脂除杂、生理盐水洗脱、真空浓缩、乙醇沉淀、离心过滤、滤渣真空干燥后即得猪软骨多糖。本发明所述的酶解过程中添加了酶激活剂，可减少酶的用量、缩短酶解时间，增强酶解效果。采用离子交换树脂法进行吸附除杂，猪软骨多糖与树脂充分交换吸附，杂质随之分离出来，避免了多次酒精沉淀，节省了酒精用量，降低了生产成本。采用本方法制得的猪软骨多糖质量好、纯度高。
文档编号C08B37/08GK102675485SQ20121017697
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者张松波 申请人:张松波