一种利用东方醋杆菌生产黄芪多糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及黄芪多糖的生产方法领域，具体涉及一种利用东方醋杆菌生产黄芪多糖的方法。
【背景技术】
[0002]黄芪来自于豆科植物膜荚黄芪或蒙古黄芪的干燥根，是临床常用的中药，其主要成分黄芪多糖具有提高免疫力、抗病毒、抗菌、抗氧化、调节血糖、护肝保肾等多种药效作用。现有技术中常用的黄芪多糖的提取方法主要有:水提醇沉法、微波提取法、碱浸提法、酶法提取法、超滤法和超声提取等，其中水提醇沉法应用最广，然而这些从黄芪中直接提取黄芪多糖的方法存在提取率低、稳定性差、纯化难度大、操作步骤复杂、周期长等问题。通过微生物发酵黄芪，不仅可以提高黄芪多糖的得率，同时在发酵过程中伴随的某些成分的分解或转化可能生成影响黄芪药理作用的新药有效成分，达到增效减毒的功能。
[0003]微生物转化法生产黄芪多糖的其中一个关键问题是菌种的选择，本发明利用了一种全新的东方醋杆菌，通过优化得出其最佳的生产条件及发酵产生黄芪多糖的最佳条件。
【发明内容】
[0004]为了解决上述问题，本发明提供一种利用东方醋杆菌生产黄芪多糖的方法。
[0005]本发明采用的技术方案为:
一种利用东方醋杆菌生产黄芪多糖的方法，包括以下步骤:
(1)黄芪多糖的发酵培养基的制备:称量鱼肉蛋白胨5份、乳糖10份、酵母浸膏5份、磷酸氢二钾2.5份、磷酸二氢钾2.5份、黄芪粉80份和水1000份，加入500ml的三角瓶中，用棉塞塞住三角瓶后放入杀菌锅中灭菌，杀菌锅温度为121°C，灭菌20min ;
(2)MRS肉汤培养基的制备:称量酪蛋白酶消化物10份，牛肉膏粉10份，酵母膏粉4份，柠檬酸三铵2份，乙酸钠5份，七水合硫酸镁0.2份，四水合硫酸锰0.05份，磷酸二氢钾2份，葡萄糖2份，吐温-80 1份，水1000份，将上述成分加入水中，加热溶解，校正pH为5.7±0.2，分装在500ml的三角瓶中，用棉塞塞住三角瓶后放入杀菌锅中，杀菌锅温度为121 °C，灭菌 20min ；
(3)东方醋杆菌的扩大培养:将东方醋杆菌接入MRS肉汤培养基进行扩大培养；
(4)发酵反应:将扩大培养后的东方醋杆菌接入黄芪多糖的发酵培养基中，接种量占发酵总体积的1%_3%，黄芪用量为8%，将盛有发酵培养基和东方醋杆菌的三角瓶放入摇床中发酵，反应48h-96h，初始pH为6.5 ;
(5 )分离与测定:发酵完毕后，将三角瓶中的混合液倒入离心杯，然后放入离心机中离心，离心结束后，取上清液置于4°C冰箱保存备用，沉淀部分水煮后再离心，将两次离心的上清液合并、浓缩后测量黄芪多糖的含量。
[0006]所述步骤(1)中黄芪粉是将洁净的黄芪片粉碎后过5号药筛制备而成的。
[0007]所述步骤(3)中扩大培养的的温度为37°C，初始pH为5.7±0.2，生长周期为24-32ho
[0008]所述步骤(4)中东方醋杆菌的菌液浓度为2X 109-3X 109个/ml。
[0009]所述步骤(4)中摇床的温度为27°C -37°C，转速为80_100r/min。
[0010]所述步骤(5)中离心机的转速为1500r/min。
[0011]所述步骤(5)中测量黄芪多糖的含量的方法是采用硫酸锌和亚铁氰化钾处理发酵产物，用苯酸-硫酸法在490nm波长下测定。
[0012]东方醋杆菌的保藏名称为Acetobacter orientalis，编号为T1-1，于2015年7月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: Μ2015455。东方醋杆菌来自于青藏高原特有的一种酸奶，菌落颜色呈乳白色培养后期菌落颜色变黄，菌落呈圆点状中间凸起边缘整齐，表面光滑湿润，有特殊的酸味；革兰氏反应呈阳性；光学显微镜下观察，呈短杆状。
[0013]本发明的有益效果是:本发明提供一种经济、高效的生产黄芪多糖的方法，本方法所用发酵原料价格低廉、易采购，发酵过程简单易控，对发酵设备及生产条件无特殊要求，常规发酵工厂的设备及生产条件即可生产，较易实现工业化大生产，本发明采用的生产黄芪多糖的方法比水提法得到的黄芪多糖的含量高约10%。
【具体实施方式】
[0014]一种利用东方醋杆菌生产黄芪多糖的方法，包括以下步骤:
(1)黄芪多糖的发酵培养基的制备:称量鱼肉蛋白胨5份、乳糖10份、酵母浸膏5份、磷酸氢二钾2.5份、磷酸二氢钾2.5份、黄芪粉80份和水1000份，加入500ml的三角瓶中，用棉塞塞住三角瓶后放入杀菌锅中灭菌，杀菌锅温度为121°C，灭菌20min ;
(2)MRS肉汤培养基的制备:称量酪蛋白酶消化物10份，牛肉膏粉10份，酵母膏粉4份，柠檬酸三铵2份，乙酸钠5份，七水合硫酸镁0.2份，四水合硫酸锰0.05份，磷酸二氢钾2份，葡萄糖2份，吐温-80 1份，水1000份，将上述成分加入水中，加热溶解，校正pH为5.7±0.2，分装在500ml的三角瓶中，用棉塞塞住三角瓶后放入杀菌锅中，杀菌锅温度为121 °C，灭菌 20min ；
(3)东方醋杆菌的扩大培养:将东方醋杆菌接入MRS肉汤培养基进行扩大培养；
(4)发酵反应:将扩大培养后的东方醋杆菌接入黄芪多糖的发酵培养基中，接种量占发酵总体积的1%_3%，黄芪用量为8%，将盛有发酵培养基和东方醋杆菌的三角瓶放入摇床中发酵，反应48h-96h，初始pH为6.5 ;
(5 )分离与测定:发酵完毕后，将三角瓶中的混合液倒入离心杯，然后放入离心机中离心，离心结束后，取上清液置于4°C冰箱保存备用，沉淀部分水煮后再离心，将两次离心的上清液合并、浓缩后测量黄芪多糖的含量。
[0015]所述步骤(1)中黄芪粉是将洁净的黄芪片粉碎后过5号药筛制备而成的。
[0016]所述步骤(3)中扩大培养的的温度为37°C，初始pH为5.7±0.2，生长周期为24-32ho
[0017]所述步骤(4)中东方醋杆菌的菌液浓度为2X109-3X109个/ml。
[0018]所述步骤(4)中摇床的温度为27°C -37°C，转速为80_100r/min。
[0019]所述步骤(5)中离心机的转速为1500r/min。
[0020]所述步骤(5)中测量黄芪多糖的含量的方法是采用硫酸锌和亚铁氰化钾处理发酵产物，用苯酸-硫酸法在490nm波长下测定。
[0021]实施例1
一种利用东方醋杆菌生产黄芪多糖的方法，包括以下步骤:
(1)黄芪多糖的发酵培养基的制备:称量鱼肉蛋白胨0.5g、乳糖lg、酵母浸膏0.5g、磷酸氢二钾0.25g、磷酸二氢钾0.25g、黄芪粉8g、水100ml，加入500ml的三角瓶中，用棉塞塞住三角瓶后放入杀菌锅中灭菌，杀菌锅温度为121°C，灭菌20min ;所述黄芪粉是将洁净的黄芪片粉碎后过5号药筛制备而成的；
(2)MRS肉汤培养基的制备:称量酪蛋白酶消化物10份，牛肉膏粉10份，酵母膏粉4份，柠檬酸三铵2份，乙酸钠5份，七水合硫酸镁0.2份，四水合硫酸锰0.05份，磷酸二氢钾2份，葡萄糖2份，吐温-80 1份，水1000份，将上述成分加入水中，加热溶解，校正pH为5.7±0.2，分装在500ml的三角瓶中，用棉塞塞住三角瓶后放入杀菌锅中，杀菌锅温度为121 °C，灭菌 20min ；
(3)东方醋杆菌的扩大培养:将东方醋杆菌接入MRS肉汤培养基进行扩大培养；扩大培养的的温度为37°C，初始pH为5.7 ±0.2，生长周期为24_32h ;
(4)发酵反应:将扩大培养后的东方醋杆菌接入黄芪多糖的发酵培养基中，接种量占发酵总体积的1%，黄芪用量为8%，将盛有发酵培养基和东方醋杆菌的三角瓶放入摇床中发酵，反应48h，初始pH为6.5 ;东方醋杆菌的菌液浓度为2X 109-3X 109个/ml ;摇床的温度为 37°C，转速为 100r/min ；
(5 )分离与测定:发酵完毕后，将三角瓶中的混合液倒入离心杯，然后放入离心机中离心，离心机的转速