一种副猪嗜血杆菌菌株的制作方法
【专利说明】一种副猪嗜血杆菌菌株 【技术领域】
[0001] 本发明属于生物领域，具体涉及一种副猪嗜血杆菌菌株。 【【背景技术】】
[0002] 副猪嗜血杆菌病曾一度被认为是由应激引起的仔猪条件性、散发性疾病，随着养 猪工业化、集约化程度的提高，如今其已成为危害仔猪和生长猪最严重的细菌性疾病。
[0003] 副猪嗜血杆菌主要危害2~28周龄的仔猪和生长猪，以5-8周龄断奶保育仔猪危 害最为严重，引起多发性浆膜炎、关节炎等症状，发病率高达15 %~90%，死亡率有时可高 达90%。起初副猪嗜血杆菌被称为猪嗜血杆菌或猪流感嗜血杆菌，后来证实其生长不需要 X因子（血红素和其他卟啉类的物质），因而改名为副猪嗜血杆菌。副猪嗜血杆菌具有多形 态性，生长时严格需要NAD或V因子，血清型复杂多样，根据同型细菌外膜蛋白抗原的不同， 至少可分为15种血清型，另有20%以上的分离株不能分型；而且不同国家或地区的流行血 清型不同，据蔡旭旺等报道，认为我国当前流行的血清型主要有4,5,12,13型，但不同地方 的优势血清型有所不同，所以对病的防控增加难度。根据我国血清流行病学调查和分离菌 株的鉴定，以4、5型最为流行，其次是12型、13型。近年来，各副猪嗜血杆菌血清群之间交 互免疫力不强，接种的疫苗菌株血清群与当时当地流行的副猪嗜血杆菌病的病原血清群不 相符，给副猪嗜血杆菌的预防和治疗带来了一定的难度。
[0004] 目前国内用于副猪嗜血杆菌病免疫预防的疫苗有勃林格殷格翰动物保健（美国） 有限公司生产的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗（Z-1517株），西班牙海博莱生物大药厂生产的 猪副猪嗜血杆菌病1型和6型灭活疫苗，华中农业大学、武汉科前动物生物制品有限责任公 司、中牧实业股份有限公司生产的副猪嗜血杆菌病4型和5型灭活疫苗；这些疫苗的应用起 到了一定的预防作用，而该病的病原流行株和多种血清型感染已经使现有疫苗很难达到预 期的免疫效果，因此，用于参与制备防治多种血清型副猪嗜血杆菌病原引起的副猪嗜血杆 菌病疫苗的合适毒株是从业人员所迫切需要解决的问题。 【
【发明内容】
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[0005] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种副猪嗜血杆菌菌株LYW1(Haemophilus parasuis)，于2015年07月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo. 11146。
[0006] 本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
[0007] 2011年，申请人在无菌条件下采集福建省泉州市新罗某猪场中疑似Hps发病仔猪 的肺脏、关节积液、气管，并分别划线接种于TSA培养基，置于37°C恒温培养箱中，烛缸厌氧 培养24-48h，将培养获得的菌株进行理化特性与分子学鉴定，最终确定其为副猪嗜血杆菌 菌属的一个菌株。
[0008] 本发明的有益效果在于：提供一种副猪嗜血杆菌菌株LYW1(Haemophilus parasuis)，该菌株能够用于参与制备防治多种血清型的副猪嗜血杆菌引起的疾病的疫苗， 最终所制得的疫苗安全性及防治能力均良好。 【【附图说明】】
[0009] 下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
[0010] 图1是本发明实施例1-5中PCR产物的1. 0%琼脂糖凝胶电泳图。 【【具体实施方式】】
[0011] 本发明中副猪嗜血杆菌菌株LYW1(Haemophilusparasuis)是2011年时将采集自 福建省泉州市新罗某猪场中疑似Hps发病仔猪的肺脏、关节积液进行培养得到的菌株。且 需要说明的是，本发明中还涉及了其它几个菌株，分别为副猪嗜血杆菌菌株LYD1、副猪嗜血 杆菌菌株LYH5、副猪嗜血杆菌菌株LY02及副猪嗜血杆菌菌株LYC2。
[0012] 副猪嗜血杆菌菌株LYD1(Haemophilusparasuis)于2015年07月21日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 保藏编号为CGMCCNo. 11143 ;副猪嗜血杆菌菌株LYH5(Haemophilusparasuis)于2015年 07月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo. 11144 ;副猪嗜血杆菌菌株LY02(Haemophilus parasuis)于2015年07月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo. 11145 ;副猪嗜血杆菌 菌株LYC2(Haemophilusparasuis)于2015年07月21日保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.11147。
[0013] 为了对本发明进行详细阐述说明，申请人给出了如下具体实施例为了对本发明进 行详细阐述说明，申请人给出了如下具体实施例。
[0014] 实施例1菌株LYW1的分离与鉴定
[0015] 1、菌株LYW1的分离：
[0016] 2011年，申请人在无菌条件下采集福建省泉州市新罗某猪场中疑似Hps发病仔猪 的肺脏、关节积液、气管，并分别划线接种于TSA培养基，置于37°C恒温培养箱中，烛缸厌氧 培养24-48h，将培养获得的菌株命名为菌株LYW1。
[0017] 2、菌株LYW1的鉴定：
[0018] 初步鉴定：
[0019] 将所获得的菌株LYW1进行形态学与生化特性的测定，结果如下：呈革兰氏阴性， 细小杆菌，具有多种不同的形态，从单个的球杆菌到长的、细长的、以致丝状的菌体；无溶血 现象、分离株不产生吲哚，能发酵葡萄糖、果糖、蔗糖，不发酵木糖、L-阿拉伯糖、乳糖、棉子 糖，接触酶、尿素酶试验阴性，对甘露糖生化反应不稳定，生长均需要V因子而不需要X因 子；因此，可初步认定菌株LYW1属于副猪嗜血杆菌菌属。
[0020] 进一步鉴定：
[0021] 提取模板：挑取菌株LYW1的单菌落进行亚克隆培养，用灭菌的双蒸水小心刮洗 菌苔并置于1. 5mL离心管中，之后于12000rpm下离心30s，弃上清，保留细胞沉淀；接着加 入567μLTE悬浮沉淀，用等体积第一抽提液（体积比为25 : 24 : 1的酚：氯仿：异戊 醇）抽提，使两相完全混合，冰浴10分钟；然后12000rpm离心10分钟，吸取上清液，等体 积第二抽提液（体积比为24 : 1的氯仿：异戊醇）再抽提1次，至溶液中有絮状的DNA沉 淀出现；将DNA沉淀转移到lmL70 %乙醇中洗涤，再于65 °C干燥箱中干燥2分钟；最后用 50-100μLTE缓冲液（含20μg/mLRNase)溶解DNA沉淀，即为所需的模板，4°C保存备用。
[0022] PCR鉴定：委托上海生工生物工程有限公司合成上游引物P1 (如SEQIDN0 : 1 所示）：5'-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3' ；下游引物P2(如SEQIDNO:2 所示）： 5,-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3, 。
[0023] 以本实施例提取所获得模板为模板，且以上述引物（P1/P2)为引物对进行PCR反 应，并以现有公认的副猪嗜血杆菌标准菌株为阴性对照：
[0024]PCR反应体系（50yL) :10XPCRBuffer(Mg2+)5yL，2. 5mmol/LdNTPs4yL，5U/ yLTaqDNA聚合酶 0.5yL，H20 36.5 4 1^，10 4111〇1/1上游引物14 1^1(^111〇1/1下游引物 1μL，模板 2μL;
[0025] PCR反应程序为：94°C预变性5min;接着94°C变性30s，58°C退火30s，72°C复性 lmin，重复30个循环；最后72°C下延伸7min。
[0026] PCR产物的检测：将PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，以DNA MarkerDL2000作为标准分子量，80V电压、1XTAE缓冲液中电泳20min。
[0027] 即进行凝胶电泳分离检验，电泳分离检验结果如图1 (图1中，Μ为DNAladder;1 为本实施例待测菌株；2为阴性对照；3为双蒸水空白对照）所示，由图1可知，本实施例待 测菌株即菌株LYW1同副猪嗜血杆菌标准菌株一样，均在821bp位置扩增出单一条带，即确 认该菌株LYW1与副猪嗜血杆菌标准菌株同属于同一菌属。
[0028] 依据上述的鉴定，最终确认菌株LYW1属于副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis)菌属的一个菌株。
[0029] 血清型鉴定：将菌株LYW1接种于TSA培养基，37°C培养大量增殖后，于7000r/min 下离心取菌体；往菌体中加入9体积倍于菌体的pH7. 4PBS缓冲溶液，121°C蒸汽处理2h， 再7000r/min离心lOmin取上清液并进行琼脂扩散试验，具体根据Keilstein和Rapp- Gabrielson所建立的琼脂扩散试验法鉴定其Hps血清型，鉴定结果为Hps12型。
[0030] 实施例2菌株LYD1的分离与鉴定
[0031] 1、菌株LYD1的分离：
[0032] 2009年，申请人在无菌条件下采集福建省泉州市新罗某猪场中疑似Hps发病仔猪 的肺脏、关节积液、气管，并分别划线接种于TSA培养基，置于37°C恒温培养箱中，烛缸厌氧 培养24-48h，将培养获得的菌株命名为菌株LYD1。
[0033] 2、菌株